Manipulacja autofagią i nekrozą dla korzyści terapeutycznych
Tabela 1 podsumowuje charakterystykę morfologiczną, kluczowe regulatory, techniki pomiaru oraz odpowiedź immunologiczną na apoptozę, autofagię i nekrozę. Ponieważ autofagia i nekroza są skomplikowanymi, złożonymi, dynamicznymi procesami, prezentują one wiele potencjalnych celów dla interwencji terapeutycznej. Cele terapii, która moduluje procesy autofagii czy nekrozy mogą być inne w zestawieniu z chemoprewencją niż przy leczeniu powstałych już guzów. Ponieważ gen beclin1 jest haploinsuficjentnym genem supresorowym nowotworów ( = w sytuacji, gdy jest tylko jeden prawidłowy allel genu, a drugi jest inaktywowany przez mutację - ekspresja genu jest niedostateczna, co może prowadzić do choroby - zwłaszcza w tym przypadku), a autofagia ogranicza niestabilność genomu we wczesnej fazie rozwoju guza, terapie indukujące autofagię mogą ograniczyć rozwój guza u pacjentów z wysokim ryzykiem rozwoju raka. W rozwiniętych guzach narażonych na stres metaboliczny i teraputyczny, autofagia może zwiększać przeżycie guza, i dlatego połączenie terapii indukujących apoptozę z inhibitorami procesu autofagii może prowadzić do regresji guza i przedłużenia życia u pacjenta.
Jak wspomniano powyżej, farmakologiczna indukcja autofagii może być osiągnięta przy pomocy niektórych leków szeroko stosowanych w onkologii.
W dodatku, zjawiska takie, jak:
paradoksalnie niski procent pacjentów, u których nastąpiła poprawa stanu zdrowia
przedłużone przeżycie bez progresji nowotworu
upłynnienie wnętrza guzów widoczne dzięki tomografii komputerowej,
obserwowane przy stosowaniu nowoczesnych inhibitorów angiogenezy, w monoterapii lub w połączeniu z chemioterapią, sugerują, że autofagia i/lub nekroza mogą w tych przypadkach również być aktywne.
Obecne przeprowadzane są wczesne próby kliniczne testujące strategię eliminacji komórek guza, które ulegają autofagii, aby przeżyć. Obecnie bardzo niewiele inhibitorów autofagii zostało dobrze scharakteryzowanych, do tego większość nie ma pożądanych właściwości farmakologicznych. Wyjątkiem są chlorochina i jej pochodne (hydroksychlorochina) o działaniu przeciwmalarycznym. Przez ponad 60 lat od ich syntezy, te pochodne 4-aminochinoliny używane były na całym świecie w leczeniu malarii i chorób autoimmunologicznych, jak np. reumatoidalne zapalenie stawów. Jako słabe zasady, związki te mają skłonność do kumulowania się w kompartmentach o środowisku kwaśnym, np. lizosomach. Badania lizosomów tkankowych u zwierząt leczonych chlorochiną wskazują na wzrost pH wewnątrz lizosomów oraz ich nabrzmienie. Leczenie wielu typów komórek pochodnymi chlorochiny powoduje szybkie i intensywne gromadzenie się pęcherzyków autofagicznych, prawdopodobnie dlatego, że ostatni etap autofagii jest zablokowany. Dowodem na dysfunkcję autofagii w komórkach poddanych działaniu chlorochiny jest nagromadzenie się większych autofagosomów ze zwiększonym poziomem utlenionego produktu ubocznego - lipofuscyny - w nowotworowych komórkach nabłonka i akumulacja enzymów pochodzących z wnętrza lizosomów, jak katepsyna D, w cytozolu.
W chłoniakach powodowanych przez mutację Myc, w których regresja guza została zainicjowana poprzez aktywację p53 lub chemioterapię alkilującą, leczenie chlorochiną lub wyłączenie genu autofagii ATG5 spowodowało podobne nasilenie apoptozy wywołanej terapią. Podanie chlorochiny komórkom o obniżonej zdolności przejścia w autofagię nie nasiliło dalej śmierci komórek, sugerując, że przy niskich, mikromolarnych stężeniach, działanie przeciwnowotworowe chlorochiny ma związek z inhibicją autofagii. W dodatku chlorochina w innym stężeniu wewnątrzkomórkowym może wykazywać inne działanie przeciwnowotworowe, włączając w to działanie jako:
Niekatalityczny inhibitor topoizomerazy
Inhibitor dehydrogenazy NAD(P)H - Q 2
Aktywator ATM (Ataxia-teleangiectasia mutated - białkowa kinaza Ser/Thr biorąca udział w regulacji cyklu komórkowego)
Pozostaje jeszcze do ustalenia, czy są to bezpośrednie efekty chlorochiny czy zjawiska związane ze zwiększeniem poziomu RFT, spowodowanym inhibicją autofagii. Opierając się na kilku z tych innych mechanizmów działania, Sotelo et al. przeprowadzili test fazy III (losowy, przeprowadzony przez jedną instutycję, podwójnie ślepy, z użyciem placebo zamiast chlorochiny) karmustyny i radioterapii - z dziennie podawaną chlorochiną i bez niej - u pacjentów z dopiero co zdiagnozowaną glioblastoma multiforme ( = glejak wielopostaciowy). Mimo że to badanie nie wykazało statystycznie istotnej różnicy w przeżyciu pacjentów, mediana (= środkowa wartość uporządkowanego ciągu danych) przeżycia u pacjentów leczonych chlorochiną wyniosła 24 miesiące - w porówaniu z 11 miesiącami u tych, którzy dostali placebo). Tendencja w kierunku przedłużonego przeżycia nie szła w parze z istotnym statystycznie zwiększeniem toksyczności.
Obecnie konsorcjum Nowe Podejścia do Terapii Guza Mózgu przeprowadza fazę I/II testów hydroksychlorochiny połączonej z radioterapią i temozolomidem (jako środkiem wspomagającym) u pacjentów z nowo wykrytym glejakiem. Do połączenia z chemioterapią zamiast chlorochiny wybrana została hydroksychlorochina ponieważ w jej przypadku można bezpieczniej zwiększać dawkę. Inne testy kliniczne fazy I/II hydroksychlorochiny w połączeniu z induktorami autofagii są obecnie przeprowadzane w odniesieniu do kilku rodzajów nowotworów złośliwych. Badania korelatywne mierzące zmienne farmakokinetyczne hydroksychlorochiny, zmiany w przebiegu autofagii oraz genotypowanie genów regulatorowych autofagii przy odrobinie szczęścia rozjaśnią powiązanie pomiędzy pochodnymi chlorochiny a autofagią indukowaną terapią u pacjentów i umożliwią przeprowadzenie dalszych testów klinicznych inhibitorów autofagii.
Terapeutyczne wspomaganie nekrozy w celu zwiększenia odporności przeciwnowotworowej nie było jeszcze celem poszukiwania nowych leków. Właściwie w fazę testów klinicznych wchodzi wiele leków prawdopodobnie hamujących nekrozę. Inhibitory PARP, jak AG014699, zostały zaprojektowane jako chemosensitizery (= leki zwiększające podatność na chemioterapię). Ponieważ PARP wspomaga naprawę DNA, inhibicja PARP w celu zwiększenia efektów chemioterapii uszkadzającej DNA jest poparta racjonalnymi, obszernymi przedklinicznymi dowodami skuteczności w guzach xenograft (= zaszczepionych, pochodzących od innego gatunku) i daje podstawy do przeprowadzenia testów klinicznych. Aktywacja PARP poprzez chemioterapię może indukować nekrozę poprzez wyczerpanie NAD+. Dla kontrastu, inhibitory PARP w połączeniu z chemioterapią mogą hamować nekrozę, i jednocześnie, poprzez inhibicję naprawy DNA zależnej od PARP, nasilać nekrozę. Co najmniej 5 inhibitorów PARP jest obecnie w fazie I i II testów klinicznych. Chociaż nie wykazują takiego efektu w monoterapii, w połączeniu z chemioterapią wydają się nasilać zależną od niej mielosupresję (=spadek aktywności szpiku kostnego) - tak jak się zresztą spodziewano. Dane z fazy II testów klinicznych temozolomidu połączonego z AG014699 wykazały 10% response rate (= procent pacjentów z poprawą stanu zdrowia), podobnie jak przeprowadzone wcześniej testy dla samego temozolomidu. Oczekiwane są dodatkowe testy II fazy aby stwierdzić, czy ta strategia wspomagania apoptozy wzmaga aktywność przeciwnowotworową u pacjentów z przerzutami. Ponieważ inhibitory PARP są dobrze tolerowane, hamowanie nekrozy jako strategia chemoprewencyjna może być testowana przy udziale tych inhibitorów w modelach nowotworów wywołanych chronicznym stanem zapalnym. Relacja pomiędzy ostrym lub chronicznym zapaleniem i rakiem nadal pozostaje kontrowersyjna - tak więc, podczas gdy inhibicja nekrozy przy pomocy inhibitorów PARP jest testowana przedklinicznie i klinicznie, leki zaprojektowane w celu nasilenia nekrozy również powinny być badane i testowane w podobnym kontekście.
Zapoczątkowano wiele badań klinicznych wczesnej fazy leków, które działają jako ligandy receptora śmieci, w nadziei na indukcję apoptozy zależnej od kaspazy-8 w komórkach nowotworowych. Wczesne testy kliniczne ligandów receptora śmierci utknęły w miejscu ze względu na obserwowaną hepatotoksyczność i znaczny spadek liczby limfocytów. Kliniczne badania wczesnej fazy ligandów receptora śmierci spokrewnionych z TNF (TNF-related apoptosis-inducing ligand = ligand wywołujący apoptozę spokrewniony z czynnikiem martwicy nowotworu) wykazały, że ta generacja ligandów jest lepiej tolerowana. Testy II fazy dla kilku takich ligandów są obecnie przeprowadzane. Ważne będzie, aby testować leki głównie na pacjentach, których komórki nowotworowe posiadają właściwe receptory dla ligandów nowej generacji, w celu dalszego rozwoju tej klasy leków, lecz równie ważny może być pomiar markerów apoptozy i nekrozy u pacjentów aby ustalić dominujący proces odpowiedzialny za śmierć komórek, która przebiega u pacjentów poddanych testom. Rozwój i badanie inhibitorów pan-kaspaz może otworzyć możliwości przetestowania hipotezy, że farmakologiczne wspomaganie nekrozy w rozwiniętych guzach może polepszyć rezultaty kliniczne. Przedkliniczne doświadczenia z przeszczepami allogenicznymi (= pochodzącymi od innego osobnika tego samego gatunku) łączące farmakologiczne inhibitory kaspaz z chemioterapią lub ligandami receptorów śmierci, a także pomiar odpowiedzi immunologicznej oraz aktywności przeciwnowotworowej mogą być pierwszym krokiem ku przetestowaniu strategii wspomagania nekrozy dla pożytku terapeutycznego.
Podsumowanie
Fundamentalnym celem badań nad nowotworami powinna pozostać identyfikacja terapii, które będą indukować selektywną śmierć komórek nowotworowych. Zrozumienie procesów które przyczyniają się do śmierci bądź przeżycia komórki jest krytyczna dla zmniejszenia zachorowalności na raka i śmiertelności nim spowodowanej. Obszerna charakterystyka regulacji apoptozy pozwoliła na rozwój terapii zaprojektowanych do indukcji apoptozy i poznania biomarkerów, które mogą służyć jako wskaźniki apoptozy indukowanej terapią u pacjentów. Z uwagi na dużą różnorodność wad genetycznych i epigenetycznych, mogących hamować apoptozę w większości nowotworów, ważne jest zrozumienie regulacji i znaczenia nie-apoptotycznych konsekwencji terapii nowotworów. Autofagia i nekroza są dwiema nie-apopototycznymi konsekwencjami terapii raka, które mogą mieć zachodzące na siebie, lecz oddzielne mechanizmy regulacyjne. Wspólną cechą obu tych procesów jest to, że zaburzenia w równowadze cząsteczek takich jak ATP, NAD+, RFT i Ca2+ łączą aktywowane przez stres szlaki transdukcji sygnału ze specyficznymi regulatorami które dają początek zmianom morfologicznym, charakterystycznym dla każdego fenotypu. Pomimo iż apoptoza jest w dużej mierze immunologicznie wyciszona lub immunosupresywna, nekroza indukowana terapią inicjuje odpowiedź immunologiczną na komórki guza. To, czy stan zapalny związany z nekrozą jest pożądany, czy prowadzi do dalszego wzrostu komórek guza, stoi ciągle pod znakiem zapytania. Autofagia indukowana terapią, w przeciwieństwie do apoptozy i nekrozy, może doprowadzić do przetrwania komórki i przez to została uznana za cel dla farmakologicznej inhibicji. Testy kliniczne pochodnych chlorochiny w połączeniu z terapiami wzbudzającymi autofagię oraz przedkliniczna identyfikacja bardziej specyficznych inhibitorów autofagii są w toku. Terapeutyki, które celują w regulatory nekrozy są obecnie we wczesnej fazie testów klinicznych. Markery autofagii i nekrozy nie są jeszcze stosowane klinicznie, co ogranicza racjonalne projektowanie odczynników do testowania prób klinicznych. Odczynniki te mogłyby być następnie wykorzystywane do pomiaru tych procesów.