Wykłady z genetyki i hodowli roślin ozdobnych, Sulechów (Kalsk), rok akademicki

2003/2004, studia dzienne i zaoczne

Wykład 9

GENETYKA MOLEKULARNA cd.

EKSPRESJA GENÓW, SYNTEZA I OBRÓBKA PROTEOMU

Gen jest to fragment DNA, zawierający informację biologiczną, kodujący cząsteczki RNA i/lub polipeptyd. Człowiek posiada około 80000 genów, zajmujących około 3% genomu.

Wielkość genu waha się w granicach od około 100 do kilku milionów par zasad.

Ekspresja genu jest kontrolowana głównie na etapie inicjacji transkrypcji. Transkrypcja polega na syntezie RNA na matrycy DNA przez polimerazę RNA.

Tradycyjny obraz ekspresji genów to: transkrypcja i translacja "DNA tworzy RNA, który tworzy białko".

Bardziej precyzyjny obraz uwzględnia następujące etapy:

1. Utworzenie kompleksu transkrypcyjnego

2. Transkrypcję (inicjacja, elongacja i terminacja)

3. Dojrzewanie RNA

4. Inicjację translacji, degradację RNA

5. Translację (elongację i terminację)

6. Zmiany potranslacyjne białka

7. Zwijanie się białka

8. Ew. degradację białka

Niektóre geny są matrycą dla RNA nie kodującego białek, jak np. RNA rybosomowego i RNA transportującego.

Gen jest odcinkiem chromosomu przepisywanym na RNA. Jeżeli RNA jest transkryptem genu kodującego białko, to nazywa się informacyjnym DNA (mRNA).

Część genu, która ulega translacji na białko, nazywa się otwartą ramką odczytu (ORF). Każda trójka nukleotydów w ORF jest kodonem określającym aminokwas zgodnie z zasadami kodu genetycznego. ORF zaczyna się kodonem inicjującym a kończy terminacyjnym.

Utworzenie kompleksu transkrypcyjnego (inicjacja)

Inicjacja transkrypcji obejmuje budowanie na DNA, w pobliżu początku genu, kompleksu złożonego z polimerazy RNA i różnych dodatkowych białek. W wyniku aktywności tego kompleksu powstaje transkrypt RNA - kopia genu. Ważną częścią tego etapu są mechanizmy decydujące o rozpoczęciu procesu transkrypcji genu.

Transkrypt - kopia genu składającego się z RNA

Polimeraza RNA jest enzymem odpowiedzialnym za transkrypcję, syntetyzuje cząsteczki RNA

Promotor -położona powyżej genu sekwencja nukleotydowa, z którą wiąże się polimeraza RNA w czasie inicjacji transkrypcji

Transkrypcja (synteza pierwotnego transkryptu, będącego kopią genu).

Do syntezy RNA nie jest potrzebny starter. Miejscem startu transkrypcji jest w 90% przypadków puryna. Sekwencję nukleotydową, z którą wiąże się polimeraza RNA w czasie inicjacji transkrypcji nazywamy promotorem. Promotor decyduje o wydajności syntezy RNA.

Po przyłączeniu polimerazy RNA, na skutek rozerwania wiązań łączących pary zasad wewnątrz krótkiego fragmentu podwójnej helisy, następuje przekształcenie zamkniętego kompleksu promotorowego w kompleks otwarty. Inicjacja transkrypcji kończy się pomyślnie tylko w przypadku, gdy polimeraza RNA przesunie się poza rejon promotora. Pierwsze 9 nukleotydów zostaje połączonych bez przesuwania się enzymu wzdłuż DNA. Nukleotydy te ulegają często procesowi poronnemu.

Polimeraza RNA przesuwając się wzdłuż genu (tzw proces ELONGACJI) syntetyzuje pierwotny transkrypt, który jest dokładną kopią genu. Odcinek DNA przed przemieszczającą się polimerazą ulega rozpleceniu tworząc tzw. pęcherzyk (bombel) transkrypcyjny i splata się ponownie za nią. U roślin wyższych długość rozplecionego odcinka DNA wynosi około 17 par zasad. Synteza RNA przebiega od 5' do 3'. RNA powstaje na matrycowej nici i ma sekwencję niematrycowej nici DNA. Nić niematrycowa zwana jest również nicią sensowną lub nicią kodującą.

Polimeraza RNA kontynuuje transkrypcję do momentu dotarcia do sekwencji terminacyjnej ("stop"). Sygnałem "stop" jest struktura tzw "spinki do włosów" , której transkrypt zawiera odcinki wzajemnie komplementarne. Mogą jednak istnieć również inne miejsca terminacyjne wykorzystujące czynnik białkowy rho.

Terminacja transkrypcji - dysocjacja kompleksu transkrypcyjnego i zakończenie syntezy RNA w miejscu sekwencji terminacyjnej (miejscu terminacyjnym)

Sekwencja genu - odnosi się do nici niematrycowej

Transkrypt - syntetyzowana cząsteczka RNA

Dojrzewanie RNA

Większość cząsteczek RNA zostaje wytworzona w postaci prekursorów, które muszą ulec przetworzeniu, aby powstały dojrzałe RNA. Dojrzewanie RNA polega na chemicznej modyfikacji niektórych nukleotydów a w szczególności:

• usunięciu końcowych lub wewnętrznych części transkryptu

• modyfikacji końców

• składaniu (usuwaniu intronów - regionu niekodującego w obrębie genu)

Wiele genów eukariotycznych jest nieciągłych i dzieli się na introny i eksony. Funkcjonalna cząsteczka RNA powstaje po usunięciu intronów z pierwotnego transkryptu RNA i "złożenia" RNA

Otwarta ramka odczytu

ekson

intron

Ekson

Kodon inicjujący kodon terminacyjny

• cięcia

• zmian w budowie chemicznej

Wyróżniamy RNA kodujący i niekodujący. Pierwszy obejmuje tylko jedną klasę cząsteczek: mRNA

mRNA (RNA informacyjne) są transkryptami genów kodujących białka i ulegają translacji do białek w drugim etapie ekspresji genomu. mRNA stanowi do 4% całego RNA

mRNA podlega dojrzewaniu poprzez dołączenie pojedynczego, nietypowego nukleotydu tzw. czapeczki, poliadenylację i wycięcie intronów

Degradacja mRNA jest procesem, który usuwa kodujące cząsteczki RNA, kiedy ich produkty nie są dłużej potrzebne

RNA niekodujący obejmuje transkrypty o różnych funkcjach: RNA transportujące i RNA rybosomowe

RNA transportujące (tRNA) - małe cząsteczki, biorące udział w biosyntezie białka dostarczające aminokwasy do rybosomu i zapewniające ich łączenie w kolejności zapisanej w sekwencji nukleotydowej mRNA, który ulega translacji.

RNA rybosomowe (rRNA), jest składnikiem rybosomów - struktur na których odbywa się biosynteza białka.

Transkryptom -cała zawartość RNA w komórce

Eukariotyczne RNA stale przemieszczają się z jądra do cytoplazmy i prawdopodobnie odwrotnie przez kompleksy porów jądrowych.

Inicjacja translacji, degradacja RNA

Celem inicjacji jest zorganizowanie się kompletnego rybosomu na cząsteczce mRNA we właściwym punkcie startu - kodonie inicjatorowym. U organizmów wyższych do inicjacji niezbędne są: duża i mała podjednostka rybosomowa, mRNA, inicjatorowy tRNA, czynniki inicjujące oraz GTP. Translacja rozpoczyna się wiązaniem małej jednostki rybosomowej z mRNA (u organizmów wyższych w miejscu "czapeczki" na końcu 5'). Następnie podjednostka rybosomowa przesuwa się do kodonu inicjującego AUG, gdzie tworzy kompleks inicjujący.

Rybosomy są makrocząsteczkowymi strukturami, złożonymi z rRNA i związanych z nim białek. Każdy rybosom składa się z dwóch podjednostek: dużej i małej (u Eucaryota 60S i 40S). Cząsteczki rRNA tworzą wewnętrzny szkielet rybosomu, do którego przyłączają się białka.

Rybosomy występują w cytoplaźmie, gdzie wiążą informacyjne RNA (mRNA), i przeprowadzają ich translację, czyli syntetyzują białka.

Komórki zawierają szereg różnych tRNA, z których każdy wiąże określony aminokwas. Każdy tRNA wiąże się także z odpowiadajacym mu kodonem w mRNA, co umożliwia ulokowanie aminokwasu we właściwej pozycji rosnącego polipeptydu. Cząsteczki tRNA zawierają od 74-95 nukleotydów i są o kształcie liścia kończyny. W jej skład wchodzą następujące elementy:

• Ramię akceptorowe tworzy 7 par zasad wchodzących w skład 3' i 5' końcowej części cząsteczki. Aminokwas przyłączany jest do adenozyny znajdującej się na końcu 3' tRNA i wchodzącej w skład niezmiennej końcowej sekwencji CCA

• Ramię D

• Ramię antykodonowe, zawiera trzy nukleotydy zwane antykodonem, które w czasie translacji łączą się z mRNA

• Pętla zmienna

• Ramię rybotymidynowe RNA rybosomowe (rRNA), jest składnikiem rybosomów - struktur na których odbywa się biosynteza białka

KOD GENETYCZNY

Informacja genetyczna jest zapisana w cząsteczce DNA w postaci sekwencji zasad.

Kod genetyczny - są to 64 trójki zasad, zwane kodonami, odpowiadające za wprowadzenie 20 aminokwasów do polipeptydów (białek).

Kodony określające ten sam aminokwas nazywamy kodonami synonimowymi. Spośród 64 możliwych kodonów, 61 koduje aminokwasy.

Kodony UAG, UGA i UAA są kodonami terminacyjnymi (stop), dajacymi sygnał do zakończenia translacji.

AUG jest sygnałem startu translacji i nazywany jest kodonem inicjującym (start)

Jak wspomniano, część genu kodującego białko, która ulega translacji na białko nazywa się otwartą ramką odczytu (ORF). ORF jest odczytywany w kierunku od 5' do 3' wzdłuż RNA. Zaczyna się kodonem inicjującym (promotor, start) i kończy terminacyjnym. Część mRNA przed ORF nazywa się liderem.

Ekspresja genów - proces , w którym komórka odczytuje informację do syntezy białek

TRANSLACJA

Translacja odbywa się na rybosomach. Zakończeniem procesu inicjacji jest przyłączenie się dużej podjednostki rybosomowej. W miarę przesuwania się mRNA wzdłuż rybosomu (podobnie do taśmy magnetofonowej przechodzącej przez głowicę ) wydłuża się łańcuch polipeptydowy (białkowy). Pojawienie się wolnego odcinka 5' mRNA umożliwia przyłączenie się kolejnego rybosomu i syntezę identycznego polipeptydu. Napotkanie przez rybosom kodonu "stop" powoduje uwolnienie gotowego białka, a rybosom dysocjuje na podjednostki. W rybosomie znajdują się dwa miejsca wiązania dla tRNA. W miejscu P (peptydylowym) znajduje się cząsteczka tRNA związana z rosnącym łańcuchem polipeptydowym, natomiast w miejscu A (aminoacylowym) znajduje się cząsteczka związana z kolejnym aminokwasem. Transferowe RNA są związane z rybosomem w ten sposób, , że ich kodony parują się zawsze z dwoma sąsiadującymi kodonami przesuwającego się względem rybosomu mRNA . Koniec translacji następuje w momencie, gdy kodon terminacyjny znajdzie się w miejscu A. Jak już wspomniano, po terminacji rybosom dysocjuje na podjednostki.

Elongacja translacji - jeden z etapów translacji, podczas którego dodawane są kolejne aminokwasy do rosnącego łańcucha polinukleotydowego.

Terminacja translacji - jeden z etapów translacji, podczas którego czynnik terminacyjny doprowadza do uwolnienia kompletnego polipeptydu (białka).

Potranslacyjna obróbka białek

Proces ekspresji genu nie kończy się na etapie translacji. Białko uwolnione z rybosomu jest nieaktywne i zanim zacznie spełniać swoją rolę w komórce, musi zostać poddany przynajmniej pierwszemu z czterech typów mechanizmów obróbki potranslacyjnej

1. Fałdowanie białka. Polipeptyd musi zostać sfałdowany w prawidłową strukturę trzeciorzędową

2. Proteolityczne rozszczepienie białka. Obróbka niektórych białek polega na cięciu przez enzymy (proteazy). Cięcie powoduje skrócenie polpeptydu z jednej lub obu stron, albo cięcie na kilka aktywnych segmentów

3. Modyfikacje chemiczne. Poszczególne aminokwasy w polipeptydzie mogą być modyfikowane przez przyłączanie nowych grup chemicznych

4. Wycinanie intein. Inteiny są sekwencjami "przerywającymi" w białkach, podobnie jak introny w mRNA. Aby białko stało się aktywne, inteiny muszą być usunięte , a eksteiny połączone ze sobą

Różne typy obróbki białka mogą zachodzić jednocześnie.

===================

• Populacja RNA w komórce zmienia się w czasie

• Eukariotyczne RNA stale przemieszczają się z jądra do cytoplazmy i prawdopodobnie odwrotnie przez kompleksy porów jądrowych

• Geny na chromosomach mogą być rozproszone lub zorganizowane w grupy

Występują dwa rodzaje zespołów genów: operony i rodziny wielogenowe

Operony występują u bakterii. Kodują białka, których funkcje są ściśle powiązane.

Rodziny wielogenowe

1. proste rodziny wielogenowe zawierają identyczne geny (geny rybosomowego DNA u człowieka występują w ponad 2000 kopii)

złożone rodziny wielogenowe zawierają geny podobne ale nie identyczne.

Pytania egzaminacyjne:

Pytania 45- 50.

Synteza i obróbka proteomu

1. Omów na rysunku ogólny przebieg ekspresji genów

2. Inicjacja transkrypcji

3. Rodzaje RNA, budowa i funkcje w komórce

4. Translacja (inicjacja, elongacja i terminacja , budowa rybosomów)

5. Kod genetyczny

6. Potranslacyjna obróbka białek

1

6

---