Biochemia - ćwiczenia laboratoryjne

Kierunek : Wychowanie fizyczne

Semestr : II

Prowadzący: dr Dżamila Bogusławska, dr Elżbieta Heger

CZĘŚĆ I

1. Temat ćwiczenia: AMINOKWASY I BIAŁKA

2. Cel ćwiczenia:

Opanowanie wiedzy na temat budowy, funkcji, właściwości i klasyfikacji aminokwasów.

3. Szczegółowy spis środków dydaktycznych użytych podczas ćwiczeń:

• waga laboratoryjna, łaźnia wodna, wirówka laboratoryjna, dygestorium,

• szkło laboratoryjne: pipety automatyczne, probówki, zlewki, kolby stożkowe, cylindry miarowe, naczynia wirówkowe, probówki typu eppendorf.

4. Wykaz literatury.

Literatura obowiązkowa:

• B. D. Hames, N. M. Hooper, J. D. Houghton ; przekł. zbiorowy pod red. J. Michejdy, J. Augustyniaka, K. Ziemnickiego „Biochemia. Krótkie wykłady”

• J.M. Berg, L. Stryer, J.L.Tymoczko „Biochemia”

• J. Staniec, A. Bojarska „Ćwiczenia z biochemii dla studentów biologii”

• L. Kłyszejko-Stefanowicz „Ćwiczenia z biochemii”

Literatura uzupełniająca:

• A. Zgirski, R.Gondko „Obliczenia biochemiczne”

• „PostępyBiochemii ” (Czasopismo wydawane przez Polskie Towarzystwo Biochemiczne, prenumerowane przez WNB UZ)

5. Zakres treści:

1. Budowa chemiczna aminokwasów.

2. Cechy budowy α-aminokwasów - wzór ogólnej budowy aminokwasów,

grupy -NH_2, -COOH.

3. Własności kwasowo-zasadowe aminokwasów.

4. Zależność stanu jonizacji aminokwasów od warunków pH.

5. Izomery D i L aminokwasów.

6. Łańcuchy boczne aminokwasów.

7. Aminokwasy jako elementy budulcowe białek.

8. Aminokwasy z aromatycznym łańcuchem bocznym.

9. Aminokwasy z alifatycznym łańcuchem bocznym.

10. Aminokwasy zasadowe.

11. Aminokwasy kwaśne.

12. Podział, wzory i symbole jedno- i trójliterowe aminokwasów.

13. Reakcje chemiczne aminokwasów.

14. Reakcje charakterystyczne dla wybranych aminokwasów.

15. Budowa peptydów i białek.

16. Struktura molekularna białek (I-IV rzędowa struktura białek).

17. Reakcje barwne białek.

18. Właściwości białek w roztworze.

• Punkt izoelektryczny białek.

• Rozpuszczalność białek.

• Wysalanie białek.

• Denaturacja białek.

• Właściwości optyczne białek.

19. Klasyfikacja białek, kryteria:

• ze względu na funkcje,

• ze względu na strukturę (globularne i fibrylarne),

• ze względu na grupę prostetyczną (nukleoproteiny, glikoproteiny, lipoproteiny, chromoproteiny, fosfoproteidy, metaloproteiny).

20. Białka pełnowartościowe i niepełnowartościowe.

21. Budowa, rola i funkcje: miozyny hemoglobiny i kolagenu.

CZĘŚĆ II

22. Instrukcja do ćwiczeń.

6.1. Wykazanie właściwości amfoterycznych tyrozyny.

Tyrozyna jest aminokwasem prawie nierozpuszczalnym w pnk izoelektrycznym pHi=5,7. Rozpuszcza się natomiast w środowisku kwaśnym i zasadowym. W obecności kwasu lub zasady wytwarzają się postacie jonowe, które są łatwiej rozpuszczalne niż cząsteczki dipolowe.

Odczynniki i materiał doświadczalny:

• Tyrozyna in. subst.

• 0,1 M HCl

• 0,05 M NaOH

• wskaźnik uniwersalny

Wykonanie:

W probówce rozpuścić 0,1g tyrozyny w możliwie małej ilości (0,5ml) 0,1M roztworu HCl i dodać 1 krople wskaźnika uniwersalnego w rozcieńczeniu 1:10. Następnie wprowadzać kroplami, za pomocą pipety roztwór 0,05 M NaOH.

Zaobserwować moment, w którym barwa pomarańczowa przechodzi w żółtą (pH=5-6). Równocześnie z roztworu wytrąca się biały osad, który w miare dodawania NaOH ulega rozpuszczeniu. Powstały roztwór zabarwiony jest na kolor zielony (pH=8).

6.2. Reakcja z ninhydryną.

Zasada:

Aminokwasy ogrzewane w środowisku kwaśnym z nadmiarem ninhydryny ulegają dekarboksylacji i oksydacyjnej deaminacji. Skutkiem tego aminokwas przekształca się
w niższy (uboższy o jeden atom węgla w cząsteczce od wyjściowego aminokwasu) aldehyd, uwalnia się dwutlenek węgla i wydziela amoniak. Równocześnie następuje redukcja ninhydryny. Zredukowana ninhydryna (hydrindantyna) wchodzi w reakcję kondensacji
z nadmiarem ninhydryny niezredukowanej i amoniakiem, tworząc związek o zabarwieniu niebiesko - fiołkowym. Reakcja aminokwasów z ninhydryną wykorzystywana jest do ilościowego oznaczania tych związków metodą kolorymetryczną (na podstawie intensywności barwy kompleksu) lub gazometryczną (na podstawie objętości uwolnionego dwutlenku węgla).

Uwaga: Reakcja ninhydrynowa nie jest specyficzna dla aminokwasów. Dają ją również, obok peptydów i białek, sole amonowe, aminocukry i amoniak. W celu ilościowego oznaczenia aminokwasów, badany roztwór musi być wolny od wyżej wspomnianych związków.

Odczynniki i materiał doświadczalny:

• 0,1 % roztwór glicyny,

• 0,1 % roztwór ninhydryny w 50 % etanolu.

Wykonanie:

Do 1 cm³ roztworu glicyny dodać 0,5 cm³ roztworu ninhydryny i ogrzać. Pojawia się niebiesko - fiołkowe zabarwienie.

Reakcje charakterystyczne dla wybranych aminokwasów.

Własności chemiczne α-aminokwasów zależą nie tylko od cech budowy wspólnych dla wszystkich tych związków (grupa α-COOH, grupa α-NH₂), ale także od rodzaju grup R. Niektóre α-aminokwasy zawierają w swym składzie cząsteczkowym, oprócz grupy karboksylowej i aminowej, inne grupy funkcyjne, co umożliwia odróżnienie poszczególnych aminokwasów na podstawie czułych reakcji barwnych. Wykorzystuje się reakcje takich grup, jak: tiolowej, fenylowej, fenolowej, indolilowej, guanidylowej, wreszcie układu imidazolowego.

6.4 Wykrywanie cysteiny i cystyny. Reakcja cystynowa.

Cystyna powstaje z cysteiny w procesie odwodorowania. Cysteina i cystyna tworzą ważny biologicznie układ oksydacyjno - redukcyjny, biorący udział w procesie utleniania komórkowego. Występują w znacznych ilościach w białkach zrogowaciałych tkanek, np. piór, rogów, włosów.

Zasada:

W roztworach alkaliów z grupy tiolowej cysteiny oraz ugrupowania disiarczkowego cystyny odszczepia się siarka, która przechodzi do roztworu w postaci jonów siarczkowych S^2-. Obecność tych jonów wykryć można za pomocą reakcji z roztworem octanu ołowiu (II). Powstaje wówczas siarczek ołowiu (II) - PbS, który wytrąca się w postaci czarnego osadu.

Uwaga: Powyższą reakcję daje cysteina i cystyna nie tylko w postaci wolnej, ale również związanej w białku.

Odczynniki i materiał doświadczalny:

• 1 % roztwory cysteiny i cystyny,

• 30 % roztwór NaOH,

• 5 % roztwór octanu ołowiu (II) - Pb(CH₃COO)₂.

Wykonanie:

Do 1 cm³ roztworu cysteiny lub cystyny w probówce dodać 2 cm³ roztworu NaOH
i ogrzewać do wrzenia przez kilka minut. Następnie wprowadzić kilka kropel roztworu Pb(CH₃COO)₂ i ponownie ogrzać. Z roztworu wydziela się brunatnoczarny osad siarczku ołowiu (II) - PbS.

Uwaga: W obecności białka roztwór staje się najpierw brunatny, a następnie czarny.

6.5. Wykrywanie tyrozyny. Reakcja Millona.

Zasada:

Reakcja ta zachodzi pod wpływem odczynnika Millona, który zawiera w swym składzie jony: Hg₂²⁺, Hg²⁺, NO₂^- i NO₃^-. Powstające w wyniku reakcji czerwone zabarwienie pochodzi od kompleksu rtęciowo - fenolowo - nitrozowego. Reakcję tę daje zarówno wolna tyrozyna, jak też związana w białku.

Odczynniki i materiał doświadczalny:

• odczynnik Millona,

• 1 % roztwór tyrozyny.

Wykonanie:

Do 1 cm³ roztworu tyrozyny dodać 4-5 kropel odczynnika Millona i ogrzać małym płomieniem. Pojawia się czerwone zabarwienie.

6.6. Wykrywanie histydyny. Reakcja Pauly'ego.

Zasada:

Pierścień imidazolowy histydyny w środowisku alkalicznym wchodzi w reakcję sprzęgania z chlorkiem p-sulfobenzenodiazoniowym z wytworzeniem pomarańczowożółtego barwnika azowego.

Odczynniki i materiał doświadczalny:

• 0,5 % roztwór kwasu sulfanilowego w 2 M HCl,

• 0,5 % roztwór NaNO₂,

• Na₂CO₃ in subst.,

• 0,5 % roztwór histydyny.

Wykonanie:

Do 5 cm³ roztworu kwasu sulfanilowego dodać 0,5 cm³ 0,5 % roztworu NaNO₂ przy równoczesnym chłodzeniu probówki zimną wodą. Utworzony roztwór soli diazoniowej zalkalizować Na₂CO₃ i wlać do 1 cm³ roztworu histydyny. Powstaje pomarańczowożółty barwnik azowy.

6.7. Reakcja biuretowa (Piotrowskiego).

Zasada:

Reakcja biuretowa jest charakterystyczna dla wiązań peptydowych występujących
w cząsteczkach białek i peptydów (zbudowanych co najmniej z trzech reszt
α - aminokwasów). W środowisku zasadowym następuje tautomeryzacja (przegrupowanie atomów) wiązań peptydowych -CO-NH- z wytworzeniem formy enolowej:

Z ugrupowaniami tego typu jony miedzi Cu²⁺ tworzą dwa wiązania kowalencyjne
z atomami tlenu grup enolowych i cztery wiązania koordynacyjne z atomami azotu. Powstaje połączenie kompleksowe o zabarwieniu fiołkowoniebieskim. Intensywność zabarwienia zależy od liczby wiązań peptydowych zawartych w cząsteczce badanej substancji. Peptydy dają raczej zabarwienie czerwone, natomiast białka - intensywnie fioletowe. Powyższa zależność wykorzystywana jest do ilościowego oznaczania zawartości białka w roztworach metodą kolorymetryczną.

Odczynniki i materiał doświadczalny:

• białko jaja kurzego,

• 10 % NaOH,

• 1 % CuSO₄.

Oddzielone od żółtka białko rozcieńcza się wodą destylowaną w objętości 19-krotnej użytego białka. Wytrącający się osad owomucyny rozpuszcza się przez dodanie niewielkiej ilości stałego NaCl. Roztwór otrzymany po przesączeniu zawiera około 5 % substancji białkowych.

Wykonanie:

Do 2 cm³ roztworu białka jaja kurzego w probówce dodać taką samą objętość
10 % roztworu NaOH i parę kropel 1 % CuSO₄. Pojawia się barwa fioletowa.

6.8. Denaturacja białek

Denaturacja cieplna

Zasada:

Denaturacja cieplna w odpowiednich warunkach prowadzi do koagulacji, której ulegają prawie wszystkie białka. Istotą tego procesu jest rozwinięcie łańcuchów polipeptydowych i zlepienie ich w duże agregaty. Jednak denaturacja białek nie jest równoznaczna z koagulacją, bowiem wiele białek zdenaturowanych pozostaje w roztworze. Spowodowane jest to odpowiednim pH środowiska, różnym od pH punktu izoelektrycznego (pH_i dla większości białek ma wartość 5-6). Białka występujące w roztworze w formie kationowej lub anionowej są rozpuszczalne. Jeśli taki roztwór zakwasi się do pH_i, wówczas następuje koagulacja. Nadmierne zakwaszenie może wywołać rozpuszczenie osadu, dlatego stosuje się słaby kwas octowy lub roztwory buforowe.

Wytrącanie się zdenaturowanych białek ułatwia obecność soli (elektrolitów), których jony obecne w roztworze powodują zobojętnianie ładunku elektrycznego jonów zawiesiny białka.

Odczynniki:

• roztwór białka jaja kurzego,

• roztwór surowicy (3-krotnie rozcieńczony wodą),

• 1%-owy roztwór CH₃COOH, NaCl i MgSO_4,

• inne substancje.

Wykonanie:

Do 2 cm³ białka (jaja kurzego lub surowicy) dodać dwie krople kwasu octowego
i ogrzać do wrzenia. Wytrąca się biały osad białka, który staje się obfitszy po dodaniu NaCl lub MgSO_4.

Działanie etanolu

Zasada:

Krótkotrwałe działanie etanolu powoduje wytrącenie białka z roztworu,
ale nie powoduje denaturacji. Denaturacja białka zachodzi dopiero po dłuższym czasie działania alkoholu i w wyższej temperaturze (20-30˚C).

Etanol, jak również inne rozpuszczalniki organiczne, wpływają na zmianę struktury przestrzennej cząsteczek białka. Osłabiają wiązania hydrofobowe i reagują bezpośrednio
z naładowanymi grupami na powierzchni cząsteczki, naruszając tym samym „płaszcz wodny” cząsteczek białka.

Odczynniki:

• Roztwór białka jaja kurzego.

• 95%-owy etanol.

Wykonanie:

Do 1 cm³ białka dodać 3 cm³ etanolu. Wytrąca się osad rozpuszczalny w wodzie. Wykonać analogiczną próbę, zostawiając mieszaninę na godzinę. Po upływie tego czasu osad nie rozpuszcza się.

Działanie stężonych kwasów i zasad - stęż. HNO₃ (odczyn Hellena)

Odczynniki:

• roztwór białka jaja kurzego,

• stężony HNO_3.

Wykonanie:

Do probówki wprowadzić 1 cm³ stężonego HNO_3, a następnie ostrożnie po ścianach pochyło trzymanej probówki dolewać taką samą objętość roztworu białka.

W miejscu zetknięcia się obu płynów powstaje biały pierścień wytrąconego białka.
Na podstawie grubości pierścienia można do pewnego stopnia wnioskować o stężeniu białka w roztworze. Reakcja ta ma zastosowanie do wykrywania białka w moczu.

3

---