SONDY MOLEK. PODZIAŁ SOND wg pochodzenia matryc wykorzyst do produkcji: 1) sekwencje cDNA wklonowane do efektywnych wektorów (np. plazmidowych lub fagowych); 2) sondy gDNA bezpośrednio pochodzące z genomu; 3) syntetyczne oligomery / oligonukleotydy (do PCR) TYPY SOND: Sondy długie - mogą zawierać niekiedy eksony kodujące podobne domeny różnych białek i być w ten sposób mniej specyficzne. Jednak hybrydyzacja z sondami długimi wydaje się być mniej zmienna niż z sondami oligomerycznymi. Sondy krótkie (15-30 nt) posiadają szereg zalet: sondy mogą być jednoniciowe (zaletą jest brak “samo-annealingu”), można zsyntetyzować dowolną sekwencję,automatyczna synteza oligo-nt jako matryc (wykorzystywanych do produkcji) pozwala na stworzenie dowolnej ilości jednorodnych sond, sonda może mieć wysoką specyficzność (bliską do Tm, a to umożliwia detekcję mutacji punktowej - jeden „błąd” w podstawieniu uniemożliwia asocjację sondy z badanym materiałem),krótkie sondy mają wysoki współczynnik dyfuzji, a w związku z tym hybrydyzują znacznie szybciej. SYSTEMY ZNAKOW SOND można podzielić na: znakow nieizotopowe - polegające na dołączeniu do sondy lub wbudowaniu w sondę markera (np. biotyny, digoksygeniny). Wymaga dodatkowego mechanizmu detekcji (zazwyczaj immunochemicznego) zależnego od zastosowanego markera. Wady znakowania nieizotopowego: detekcja immunologiczna jest wystarczająco dobra do hybrydyzacji membranowej, ale jedynie gdy posiadamy specyficzne przeciwciał; detekcja po hybrydyzacji zapewnia dobrą rozdzielczość jednak zwykle kosztem dużo niższej czułości; wymagane specyficzne przeciwciała np. anty-biotynowe, które muszą być koniugowane z jakimś wybranym markerem enzymatycznym; wymagany wybór metody detekcji o odpowiedniej czułości; rozpad przeciwciał oraz markerów podczas dłuższego przechowywania sondy. znakow izotopowe - przez wprowadzenie do cząsteczki sondy izotopu promieniotwórczego (ၢ : 35S, 32P, 33P). Detekcję sygnału prowadzi się przez ekspozycję błony fotograficznej na działanie promieniowania hybrydy (sondy / badany materiał związany na membranach). Zaleta znakowania izotopowego jest wysoką czułość detekcji. Wady znakowania izotopowego : rozpad izotopu może prowadzić do zaburzenia struktury sondy; zanieczyszczenie produktami rozpadu; nie nadają się do dłuższego przechowywania (wg półokresu rozpadu izotopu). Dwie możliwości znakowania: znakowanie terminalne albo równomierne rozmieszczenie markera / izotopu w całej sekwencji sondy np. przez inkorporację znakowanych nukleotydów. METODY ZNAKOW 1) Znakowanie (3' lub 5') terminalne - wprowadzanie znakowanego nukleotydu na koniec 3' lub 5' sondy (najczęściej syntetycznego oligonukleotydu): znakowanie końca 3' - z zastosowaniem końcowej deoxynukleotydylo-transferazy (TdT) - dodanie serii deoxynukleotydów do końca 3' ; znakowanie końca 5' - z zastosowaniem [ၧ-32P]ATP przy pomocy polinukleotydowej kinazy faga T4 (PNK). Zamiana ၧ-fosforanu w pozycji 5'- hydroxylowej oligonukleotydu. Wymag metod znakowania: musi być znana sekwencja nukleotydowa badanego genu - co pozwala na syntezę syntetycznego oligonukleotydu (20-30); można zastosować kilka oligonukleotydów, których sekwencje można przewidywać na podstawie znanej sekwencji aminokwasowej. 2) Znakowanie PCR (inkorporacja znakowanych dNTP). Zalety: można produkować różne sondy +/- (,,sense i antysense”; 1x/3x); można zastosować jeden lub więcej znakowanych nukleotydów [ၡ-32P]-dNTP ; wysoka radioaktywność sond oraz czułość detekcji. Wady: musimy znać sekwencje nukleotydowe badanego genu; musimy posiadać matryce do produkcji sondy; musimy posiadać syntetyczne startery (16-20 oligonukleotydy). 3) Wydłużanie startera (ang. Random priming) - polega na stosowaniu mieszaniny heksanukleotydów o losowej sekwencji, które po hybrydyzacji do matrycy pozwalają polimerazie Klenowa na stworzenie nici komplementarnej, wbudowując w sondę nukleotydy znakowane. Wady:metoda pozwala na syntezę jedynie dwuniciowych sond; sonda może być niespecyficzna, jeżeli matryca wykorzystywana do produkcji będzie niespecyficzna do poszukiwanego genu. 4) Transkrypcja in vitro tworzenie sond RNA przy pomocy polimerazy RNA T7 lub T3. Pozwala na tworzenie jednoniciowych sond (sense + antisense). Przepisanie DNA (cDNA lub gDNA na znakowane RNA). 5) Przemieszczanie pęknięć (Nick translation) Wady: polega na losowym nacinaniu nici matrycy DNA przez DNazę I i dalszej syntezie znakowanej nici komplementarnej, począwszy od punktów nacięcia; pozwala na syntezę jedynie dwuniciowych sond; ilość powstałego, znakowanego produktu nigdy nie przekracza ilości matrycy użytej do znakowania. ODCZYNN WYMAG DO PRZYGOT SOND MOLEK 1) Matryca - tzn. DNA lub RNA; 2) Polimeraza do syntezy DNA/RNA ( Klenow fragment polimerazy DNA E.coli; polinukleotydowa kinazy faga T4 (PNK); końcowa deoxynukleotydylo-transferaza (TdT); odwrotna transkryptaza; Taq polimeraza); 3) Startery: syntetyczne specyficzne dla danego genu (produkcja w automatycznych syntezatorach oligo-nt); syntetyczne niespecyficzne (heterogeniczne: wszystkie cztery zasady w każdej pozycji); naturalne niespecyficzne (heterogeniczne w sekwencji, tzn. zyskane przez trawienie DN-azą I uzyskanego DNA z cielęcej tarczycy lub spermy łososia), to fragmenty jedno-niciowe o długości ok. 6-12 nt; 4) Znakowane nukleotydy; 5)Nieznakowane wszystkie cztery typy wolnych dNTP - jako prekursory do syntezy DNA TYPY HYBRYDYZ: ISH - Hybryd IN SITU - na skrawkach tkanek lub komórkach hodowanych in vitro - do ustalenia lokalizacji miejsca ekspresji genu (mRNA w typach komórek); FISH - fluorescencyjna ISH - na chromosomach - do ustalenia lokalizacji genu na określonym chromosomie (miejsce DNA w genomie). MEMBRANY: NC - nitroceluloza, Wzmocniona NC, Nylon, Nylon pozytywnie (+) naładowany i wzmocniony, Aktywowany papier: DBM (diazobenzyloxymethyl) i DPT(diazophenylthioether). HYBRYDYZ MEMBRANOWA: Unieruchom materiału DNA/RNA do membran można prowadzić przez bezpośrednie naniesienie lub transfer na powierzchnię membrany: kapilarny, próżniowy, mokry-elektroblotting, lub pół-suchy („semi-dry”): Dot-blot lub slot-blot (zależnie od typu aparatu) -bezpośrednie naniesienie na membrane; Rozdział elektroforetyczny badanego materiału na żelu agarozowym umożliwia kontrolę długości badanego transkryptu lub amplikonu poprzez porównanie pozycji do markera cząsteczkowego; MAPOWANIE RNA Z NUKLEAZĄ S1: Stosow w celu: określenia lokalizacji zakończeń 5' oraz 3' mRNA na matrycy DNA; określenia połączeń 5' i 3' w odniesieniu do miejsc działania enzymów restrykcyjnych w klonowanych genach lub dwuniciowych cDNA; określenia ilości i różnorodności typów mRNA w całkowitym RNA (wyizolowanym z tkanek lub komórek). Metoda opiera się o: hybrydyzację denaturowanego DNA z RNA (sonda antysense DNA dla badanego fragmentu), lub analiza Southern produktów po elektroforezie); trawienie z nukleazą S1 (wyłącznie fragmenty jednoniciowe); elektroforeza fragmentów trawienia; identyfikacja fragmentów (Southern).PRZYCZYNY BŁĘDÓW HYBRYDYZ: przy oczyszczaniu RNA/DNA-białka nie pozwalają na elektroforezę-powt ekstrakcje fenolową; zniszczone RNA przez rnazy- autoklawować; Rnazy tkankowe-zmieniśc met izolacji.; przy Sotern i Northern- pozostałość RNA w żelu co powoduja mała wydajnośc transferu kapilarnego- trzeba zmienic transfer na próżniowy bądź semi-dry; niespecyficzne wiązanie-sprawdzić zawartośc substancji blokujących.
CZYNN WARUNK EFEKTYW HYBRYD: 1) Optymal stężenie soli - zwykle wykorzystywane bufory: 20x SSC (3M NaCl, 0.3M cytrynian trójsodowy) lub 20x SSPE (3.6M NaCl, 0.2M NaH2PO4, 0.02M Na2EDTA); 2) Czas hybrydyzacji - zwykle wystarcza: 15 godz. dla wodnych sond DNA/RNA; 24 godz. dla formamidowych sond genomowego DNA; 8 godz. dla formamidowych sond plazmidowego DNA na blotach lub łysinkach w wektorach z dużą liczbą kopii; minimum 15 godz. dla sond oligonukleotydowych; 3) Zastosow formamidu/temperatury: Southern- roztwór wodny w 68oC; sondy DNA i RNA i odciski kolonii/łysinek- roztwór z 50% formamidem w 42oC; Northern- 50% formamid w 37-42oC; Sondy oligonukleotydowe- wodny (bez siarczanu dekstranowego) w Tm -5 do -10oC. 4) Zastosow czynników blokujących niespecyficzne sygnały (tło): 100x roztwór Denhardta-bardzo zalecane dla wszystkich metod oraz odciski kolonii/bakterii; Blotto: 5% mleko odtłuszczone w proszku + 0.02% azydek sodowy- bardzo zalecane do odciski kolonii/bakterii, możliwe zastosowanie do DNA dot blot, a nie polecane do Southern dla genów pojedyńczej kopii, Northern, oraz RNA dot-blot; Denaturowane DNA spermy łososia (typ II)- bardzo zalecane do Southern i DNA dot blot, możliwe zastosowanie do wszystkich innych; Heparyna (świńska, typ II)- bardzo zalecane do Southern i DNA dot blot, możliwe zastosowanie do wszystkich innych; Drożdżowe tRNA- bardzo zalecane do Northern i RNA dot blot, a możliwe do Southern i DNA dot blot; Homopolimerowe DNA- bardzo zalecane do hybrydyzowanie DNA bogatego w AT lub GC, a nie polecane do wszystkich innych. FAZY HYBRYD: 1) Rozpoznanie: Względnie powolny proces wyszukiwania przez sondę sekwencji komplementarnej. Szczególnie wolno przebiegająca w warunkach hybrydyzacji na membranach. Dlatego wymagany jest długi okres inkubacji w odpowiedniej temperaturze.. 2) Właściwa hybrydyzacja: Szybkie łączenie się komplementarnych zasad w dwuniciową hybrydę. 3) Płukanie membran z nadmiaru sondy. Pracochłonność trzech zasadniczych etapów: 1) 20-30 godz. - przygotowanie materiału (DNA lub RNA); 2) 2-3 godz. - hybrydyzacja z sondą (24 godz. inkubacji) 3) 1-2 godz. - detekcja (1-3 dni ekspozycji zhybrydyzowanych membran do kliszy fotograficznej, tzn. autoradiografia). ZALETY HYBRYD NA MEMBRANACH: stosunkowo duża ilość materiału może być związana z membraną i wyeksponowana na działanie sondy; związany materiał nie ulega reasocjacji w struktury dwuniciowe; niezhybrydyzowana sonda może zostać łatwo odpłukana po inkubacji hybrydyzacyjnej; sondę można wykorzystywać wielokrotnie (z uwzględnieniem okresu trwałości, półokresu rozpadu). AUTORADIOGRAFIA - to proces trwałego utrwalenia wyników hybrydyzacji na kliszy fotograficznej. Zasada autoradiografii: Emitery promieniowania beta (ၢ), tzn. 32P oraz 35S penetrują kliszę fotograficzną, działając na kryształy srebra emulsji fotograficznej pokrywającej kliszę. Wyrzut elektronów przyciąga dodatnio naładowane kationy srebra, które precypitują (na kliszy) w miejscu działania prom ၢ. ENERGIA EMITERÓW: 35S - emituje promieniowanie o maksymalnej energii 0.167 MeV - co pozwala na penetrację kliszy fotograficznej na głębokość zaledwie 0.25 mm (zbyt mała energia by przenikać przez folię żywnościową - nie owijać blotów); 32P - emituje promieniowanie o maksymalnej energii 1.71 MeV - co pozwala na penetrację wody lub plastiku na głębokość do 6mm i całkowicie przenika przez kliszę fotograficzną. Można zastosować ekrany intensyfikujące (pobudzone przez ၢ, emitują protony i wzmacniają sygnał). 5 x wzmocnienie, można uzyskać przez zastosowanie ekranów intensyfikujących w niskich temperaturach (-70oC). FLUOROGRAFIA- Autoradiografia słabych ၢ-emiterów, takich jak 3H, 14C czy 35S może być wzmocniona chemicznie. Wzmacniacze chemiczne są fluorescencyjne i emitują protony, które wzmacniają promieniowanie. Fluorografia pozwala na: 3H - detekcję, która jest niemożliwa autoradiografią konwencjonalną; 14C czy 35S - wzmocnienie 10-krotne. W oryginalnej metodzie żel radioaktywny: płukano w DMSO; impregnowano w scyntylatorze PPO (2,5-diphenyloxazole); usuwano DMSO przez płukanie w wodzie; suszono; ekponowano do kliszy fotograficznej w -70oC. CZYNN ZWIĘKS WYDAJNOŚĆ TRANSFERU DNA W SOUTHERN: 1) Zwiększ efektywności precypitacji etanolowej DNA izolow z żelu agarozowego uzyskuje się przez: precypitacja wstępna: przez schłodzenie roztworu DNA przed precypitacją na lodzie/ min. 15 min; 15 min. wirowanie w 13.500 rpm / w 4oC; precypitacja właściwa: 0.2 objętości 10M octanu amonowego (zamiast sodowego - co zapobiega koprecypitacji z oligosacharydami agarozowymi DNA i RNA; 2 objętości 100% lodowo-zimnego EtOH; 30 min w temp. Pokojowej; całonocna inkubacja w -20oC; wirowanie 30 min. w 12.000 x g. 2) Wybór odp typu agarozy: mocniejsza agaroza (mniej krucha) - lepiej wybrać agarozę o standardowej temp. topnienia niż niskiej (“LMP”) np. FMC. 3) Przygotow agarowy: stosować agarozę ze standardową temp. topnienia; unikać żeli > 4mm grubości: zmniejsza wydajność transferu na membrany; wydłuża czas elektroforezy; wypoziomować żel podczas wylewania - żel musi być idealnie jednakowej grubości - poprawia wydajność transferu; stosować świeży żel - umieszczenie świeżego żelu w buforze do elektroforezy uniemożliwia wysychanie żelu na górnej powierzchni (“twarda skóra powierzchni”). 4) Wybór odpj membrany: Nylon (+) lub zwykły- trwały, wielokrotna hybrydyzacja, dobre wiązanie DNA<300pz, UV immobilizacja, wyższe tło, trwały po 90-95*C, Nitroceluloza- nietrwała, pojedyncza hybrydyzacja, słabe wiązanie DNA <300pz, tylko +80*C prażenia, niższe tło, krucha po 90-95*C. 5) Depurynacja: nie jest potrzebna gdy DNA jest mniejsze niż 15 kb; jeżeli DNA do transferu jest większy niż 15 kb - należy żel płukać w 0.25N HCl przez 15-30 min, a następnie dobrze wypłukać przed transferem na membranę; alternatywnie - można żel barwiony z bromkiem etydyny (Et-Br) poddać kontrolowanej ekspozycji na światło UV. 6) Transfer po elektroforezie alkalicznej: żel musi być neutralizowany przed transferem; płukanie w wodzie lub denaturacja DNA w żelu po zwykłej elektroforezie (20 min. w temp.pokojowej):- nylon (+) 0.4M NaOH - nylon 0.25M NaOH. 7) Transfer w buforze o wysokiej zawartości soli: transfer DNA < 1.000 pz - często wykorzystywany do potwierdzenia obecności produktów PCR (lub zmienionych sekwencji) podczas hybrydyzacji; DNA <1.000 pz - wymaga zastosowania żelu twardszego (większy % agarozy), niż dla większych fragmentów DNA, ale wydajność transferu obniża się wraz ze wzrostem procentowej koncentracji żelu; DNA < 300 pz - wydajny transfer tylko w elektroblottingu lub blottingu próżniowym. 8) Blotting półsuchy (Semi-Dry): dla żeli < 3 mm w 1x TAE; stosować (+) nylon; dolna część żelu na nylon; 6V/ 15 min; 12V/ 30 min. 9) Elektroblotting: transfer w buforze 0.5x TBE schłodzonym do +4oC; 3-4 mm żele; ekwilibrować żel w buforze do transferu / 1 godz./ w +4oC; 30V (stały) / 4 godz. 10) Immobilizacja DNA do membrany: +80oC / 2 godz. w próżni; optymalne (sprawdzone empirycznie) UV (254 nm w folii plastikowej) - tylko dla nylonu (z DNA po dolnej stronie membrany) - plus 30 min w +80oC; Etap można ominąć przy alkalicznym transferze na nylon+.