09.02.04

MIKROSKOP ŚWIETLNY

Budowa mikroskopu, rysunek... (przypomnienie z podstawówki ;)

Obraz w mikroskopie świetlnym jest obrazem rzeczywistym, powiększonym i odwróconym.

OBIEKTYW

Parametry charakteryzujące obiektyw mikroskopu:

• Apertura numeryczna (A):

• A = N sinα, gdzie:

• N - współczynnik załamania światła ośrodka (medium) miedzy preparatem a obiektywem

• α - wartość kąta aperturowego, czyli kąta pomiędzy wiązką przechodząca przez oś optyczną soczewki obiektywu a graniczną wiązką wpadającą do obiektywu po przejściu przez preparat;

zależy od: szerokości soczewki obiektywu oraz jej odległości od preparatu

• Im większa A, tym lepiej.

• Zdolność rozdzielcza (1/D):

• najmniejsza odległość między dwoma punktami, które widać jako dwa osobne punkty (mówi o jakości obiektywu)

• D = λ / A = λ / N sinα, gdzie:

• λ - długość fali świetlnej użytej do obserwacji

• A - apertura numeryczna

• Zdolność rozdzielcza obiektywu jest tym większa (lepsza), im mniejsza jest wartość D, czyli im mniejsza λ i im większa A.

• Jak możemy poprawić zdolność rozdzielczą?

• Jak największa apertura.

• Światło o jak najkrótszej fali.

• Aby uzyskać największą zdolność rozdzielczą obiektywu, preparat oświetla się światłem UV (o najkrótszej fali, 280- 300 nm); wymaga to użycia soczewek ze szkła kwarcowego, ponieważ zwykłe szkło (krzemowe) nie przepuszcza praktycznie światła w tym zakresie widma /dlatego przez szybę nie można się opalić!/.

• Obiektyw immersyjny - wypełnienie przestrzeni pomiędzy szkiełkiem podstawowym a obiektywem cieczą: wodą, olejkiem imersyjnym (np. cedrowym) lub wodnym roztworem glicerolu („gliceryną”); wykorzystuje się fakt, że wsp. załamania światła N jest inny w innym ośrodku

• Fluorescencja

Oznaczenia obiektywów imersyjnych
Rodzaj imersji	Symbol	Kolor pierścienia na okularze
Woda	WI	Biały
Olejek imersyjny, np. cedrowy	HJ	Czarny
Roztwór glicerolu w wodze, czyli tzw. „gliceryna”	Glyc	Czerwony

Wartości A i D obiektywów
	A (apertura numeryczna)	D (odwrotność zdolności rozdzielczej)
Obiektyw suchy	≤ 0,95	- 0,3 μm
Imersja wodna	1,20	- 0,24 μm
Imersja olejkowa	1,5	- 0,19 μm

Błędy wynikające z własności obiektywu
Rodzaj błędu	Problem	Mechanizm	Sposób korekty
Aberracja sferyczna	Nieostre kontury	soczewki mocno wypukłe (duża krzywizna), przy określonym N, ogniska się nie pokrywają (promienie nie ogniskują się w jednym punkcie) tym większa, im bardziej wypukła soczewka F1 F2	używamy kilku małych soczewek zamiast jednej dużej
Aberracja chromatyczna	Tęczowa obwódka	soczewka działa trochę jak pryzmat, rozpraszając wiązkę światła; poszczególne długości fali mają trochę inne ogniska, ogniskują się w różnych punktach	a) filtry „wycinające” część widma skupiającą się najdalej albo - jeszcze lepiej - b) komplet dwóch idealnie pasujących soczewek: dwuwypukła i płaskowklęsła.

Typy obiektywów:

• Achromatyczne (korekcja aberacji chromatycznej tylko na centralną wiązkę)

• 
  Apochromatyczne (korekcja obu aberacji) całe pole

• Plenochromatyczne (korekcja obu aberacji) ostre

- do fotografii spod mikroskopu, gdy chcemy sfotografować większą powierzchnię

OKULAR

Okulary działają jak lupa, też mogą korygować aberracje.

Ostateczne powiększenie = powiększenie obiektywu * powiększenie okularów

najczęściej stosowane powiększenia okularu: 5, 10, 15x

Dobór odpowiedniego okularu:

Obiektyw	Okular
achromatyczny	A
apochromatyczny ew. planochromatyczny	PH

Apertura*1000 powinna być podobna do ostatecznego powiększenia.

Lepiej słabszy okular i silniejszy obiektyw.

Techniki obserwacji:
Obserwacje w jasnym polu w świetle przechodzącym + zabarwienie preparatu
Obserwacja w ciemnym polu w świetle przechodzącym (trochę jak negatyw, większy kontrast) Światło jest skierowane przez soczewki kondensora pod pewnym kątem, tak, że do soczewek obiektywu wchodzi tylko światło ugięte lub rozproszone przez preparat. Niezbyt dobra rozdzielczość; możliwość ujawniania w postaci białych, błyszczących plamek tych małych obiektów, które uginają znaczną część padającego światła - metoda szeroko stosowana w mikrobiologii do wykrywania bakterii.	przeżyciowo
Obserwacja w ciemnym polu w świetle odbitym (światło nie przechodzi przez preparat, jest z boku)
Kontrast fazowy: w świetle przechodzącym; wykorzystujemy to, że różne struktury w różnym stopniu pochłaniają światło (filtry wzmacniają ten efekt); te części, które są bardziej gęste, są ciemniejsze Szklana płytka fazowa wstawiona między preparat a oko obserwatora zwiększa kontrast. Światło padające przechodzi przez przesłonę pierścieniową, która skupia na praparacie światło w kształcie pierścienia

Min. wielkość obiektów widzialnych:

Oko nieuzbrojone: nieco powyżej 100 μm

Mikroskop świetlny: 100 nm - 1 μm

Mikroskop elektronowy: 0.1 nm (pojedyncze cząsteczki!)

W mikroskopie świetlnym możemy zobaczyć:

10-100 μm - komórki

3-10 μm - jądro komórkowe

…… μm - chloroplasty

…. μm - mitochondria

0,1- 10 μm - grubość ściany komórkowej

a dzięki obiektywom immersyjnym - także lizosomy i sferosomy

Nie widać natomiast: mikrotubul, mikrofilamentów, filamentów pośrednie oraz grubość błon!!!

Pomiary mikroskopowe

Szkiełko mikrometryczne - szkiełko przedmiotowe z podziałką o długości 1 mm, podzieloną na 100 równych odcinków, każdy o długości 10 μm.

Okular mikrometryczny - okular z podziałką o nieznanej długości odcinków.

1. Wyznaczamy wartość mikrometryczną obiektywu, czyli rzeczywistą odległość pomiędzy sąsiednimi kreskami podziałki okularu mikrometrycznego dla danego obiektywu.

1. Umieszczamy szkiełko mikrometryczne na stoliku mikroskopu, nastawiamy mikroskop na żądane powiększenie i ustawiamy ostrość podziałki na szkiełku.

2. Wkładamy okular mikrometryczny.

3. Patrząc w okular mikrometryczny, nasuwamy na siebie obie widoczne podziałki tak, aby ich pierwsze kreski pokrywały się.

4. Odszukujemy następna parę kresek pokrywających się.

5. Liczymy, ile odcinków podziałki szkiełka mikrometrycznego (a) oraz ile odcinków podziałki okularu mikrometrycznego (b) znajduje się między parami pokrywających się kresek.

6. Obliczamy wartość mikrometryczną obiektywu wg wzoru: a x 10 : b.

7. Wartość mikrometryczną wyznaczamy osobno dla każdego obiektywu!

2. Dokonujemy pomiaru wielkości obserwowanego obiektu.

1. Umieszczamy preparat na stoliku mikroskopu, nastawiamy mikroskop na żądane powiększenie i ustawiamy ostrość obrazu.

2. Patrząc przez okular mikrometryczny, liczymy, ile odcinków podziałki okularu znajduje się miedzy punktem początkowym i końcowym mierzonego obiektu.

3. Obliczamy wielkość obserwowanego obiektu, mnożąc uzyskana liczbę przez wartość mikrometryczną.

---