2. OCZYSZCZANIE DEHYDROGENAZY GLUKOZO-6-FOSFORANOWEJ Z DROŻDŻY PIWNYCH

Sprawozdanie, wersja elektroniczna

Proszę nie kasować wprowadzonego tekstu i tabel, a jedynie uzupełnić sprawozdanie według podanych wskazówek. Proszę zmodyfikować nazwę pliku poprzez zastąpienie n - nazwiskami

Oceny - wykonanie: opis:

Ćwiczenie wykonane przez (nazwisko, e-mail)

I. Oczyszczanie DG6P

Nazwa próby	Objętość frakcji	Ilość siarczanu amonu [g] użyta w doświadczeniu	Uwagi
Etap II (Autolizat)
Etap III a) b)
Etap IV
Etap V: FT
Etap V: W1
Etap V: W2
Etap V: 100 mM
Etap V: 200 mM
Etap V: 300 mM
Etap V: 400 mM
Etap V: 600A mM
Etap V: 600B mM

a), b) - kolejne wysalania/wirowania

II. Oznaczanie aktywności i zawartości białka we frakcjach otrzymanych w czasie oczyszczania DG6P

Integralną częścią sprawozdania jest załączenie pliku arkusza obliczeniowego (Exel) o nazwie 2010_cw2_n (n- nazwiska studentów). Nazwa ma być tożsama z nazwą tego pliku tekstowego.

Arkusz kalkulacyjny powinien zawierać następujące dane:

1) Wartości absorbancji zarejestrowane w czasie wyznaczania aktywności preparatów DG6P na kolejnych etapach oczyszczania (Etap II, II, IV, V)

2) Wyznaczone metodą korelacji liniowej zmiana absorbancji (A₃₄₀ nm) dla każdego wykonanego pomiaru, należy wykonać odpowiednie wykresy

3) Przeliczenia prowadzące do wyznaczenia aktywności całkowitej frakcji uzyskanych na kolejnych etapach oczyszczania DG6P. Należy zaprojektować przeliczenia w komórkach arkusza uwzględniające ilości dodawanej próby do kuwety, objętość kuwety, całkowitą objętość otrzymanych frakcji. Kolumny przeliczeniowe powinny być odpowiednio zatytułowane i zawierać wartości :

- objętości frakcji dodawanej kuwety [μl]

- aktywności w kuwecie [Δ Abs min^-1]

- aktywności w kuwecie [Δ μmol min^-1]

- aktywność całkowitej frakcji [ min^-1] (U)

- średniej aktywność całkowitej frakcji [ min^-1] (U)

4) Przeliczenia prowadzące do wyznaczenia całkowitej zawartości białka we frakcjach DG6P. Krzywa wzorcowa do oznaczania białka metodą Bradford (595 nm) przygotowana przez prowadzących powinna zostać włączona do arkusza sprawozdania i na jej podstawie należy przeliczyć wartości absorbacji

Należy zaprojektować przeliczenia w komórkach arkusza uwzględniające ilości dodawanej próby do kuwety, objętość kuwety, całkowitą objętość otrzymanych frakcji. Kolumny przeliczeniowe powinny być odpowiednio zatytułowane i zawierać wartości :

- objętości próby użytej do oznaczenia [μl]

- wartości absorbancji przy 595 nm

- zawartości białka w kuwecie [μg]

- całkowitej zawartości białka w poszczególnych frakcjach [mg]

- średniej całkowitej zawartości białka w poszczególnych frakcjach [mg]

Otrzymane w arkuszu kalkulacyjnym wyniki należy wpisać do podanych poniżej tabel

Aktywność DH Glu-6-P w kolejnych frakcjach

Nazwa próby	Aktywność w kuwecie [Δ Abs min^-1])	Aktywność w kuwecie [μmol min^-1]	Aktywność całkowita frakcji [μmol min^-1] (U)
Etap II (Autolizat)
Etap III
Etap IV
Etap V: FT
Etap V: W1
Etap V: W2
Etap V: 100 mM
Etap V: 200 mM
Etap V: 300 mM
Etap V: 400 mM
Etap V: 600A mM
Etap V: 600B mM

Całkowita zawartość białka w próbach

Nazwa próby	Objętość próby użytej do oznaczenia [μl] Rozcieńczenie próby wyjściowej	Wartość absorbancji przy 595 nm	Zawartość białka w kuwecie [μg]	Całkowita zawartość białka w poszczególnych frakcjach [mg]
Etap II (Autolizat)
Etap III
Etap IV
Etap V: FT
Etap V: W1
Etap V: W2
Etap V: 100 mM
Etap V: 200 mM
Etap V: 300 mM
Etap V: 400 mM
Etap V: 600A mM
Etap V: 600B mM

Opracowanie wyników

Profil elucji białka oraz aktywności enzymu z kolumny Q-Sepharose (według wzoru, który został zamieszczony w skrypcie do ćwiczeń)

	Nazwa frakcji
		Etap II (Autolizat)	Etap III	Etap IV	Etap V (frakcja o najwyższej aktywności właściwej)
Objętość [ml]
Stężenie całkowite białka [mg/ml]
Całkowita zawartość białka [mg]
Aktywność całkowita [U]
Aktywność właściwa [U/mg białka]
Wydajność [%]
Stopień oczyszczenia [n]

Analiza stopnia oczyszczania DG6P na podstawie analizy rozdziału elektroforetycznego SDS-PAGE poszczególnych frakcji enzymatycznych

Poniżej należy przekopiować z programu QuantityOne otrzymany obraz żelu poliakrylamidowego z zaznaczonymi wartościami względnymi mas cząsteczkowych, wyznaczonymi dla poszczególnych białek.

Wnioski (max 2 strony A4)

Na podstawie uzyskanych wyników stopnia oczyszczenia i analizy obrazu elektroforetycznego przeprowadzić dyskusję uzyskanych wyników. Proszę zanalizować stosowane metody oczyszczania białek.

Porównać uzyskane wyniki z danymi literaturowymi, w szczególności należy skorzystać z informacji dostępnych w Internecie. Omówić typ kinetyki DG6P, specyficzność substratową, możliwe typy inhibicji.

Dostęp do baz danych można uzyskać rozpoczynając od strony http://www.expasy.ch/enzyme/1.1.1.49

i w dalszej kolejności przeszukując strony tematycznie związane z DG6P, np.:

http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=1.1.1.27

http://www.uniprot.org/uniprot/P11412

http://www.pdb.org/pdb/cgi/explore.cgi?pdbId=1qki

http://www.uniprot.org/uniprot/P97324

---