WYKŁAD VI - CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA
Co to jest cytometria przepływowa?
Cytometria przepływowa jest wygodną techniką diagnostyczną pozwalającą na szybki pomiar cząsteczek i/lub komórek podczas ich liniowego przepływu w komorze pomiarowej.
Do czego służy cytometr przepływowy
Do dokonywania pomiaru morfologii i składu biochemicznego komórek
Do szybkiego pomiaru dużej ilości cząstek lub komórek zawieszonych w cieczy
Zasada pomiaru - jakie zjawiska wykorzystuje
- wykorzystuje zjawisko rozpraszania światła laserowego przez komórki oraz ich struktury i zjawisko fluorescencji barwników
Budowa cytometru
System płynów
Wprowadza materiał badany (komórki, bakterie, kulki analityczne) do komory lasera oraz warunkuje przepływ liniowy
System optyczny
Generuje i zbiera sygnały świetlne (rozproszenie i fluorescencję)
System elektroniczny
Zamienia sygnały świetlne na elektroniczne impulsy, które dalej konwertowane są na znaki graficzne
Ogniskowanie hydrodynamiczne
W cytometrze przepływowym zawiesina odpowiednio zabarwionych komórek jest wytłaczana w otoczce płynu osłaniającego przez specjalną dyszę, w postaci laminarnie płynącego, cienkiego strumienia zawierającego rząd pojedynczych komórek. Jest to tzw. ogniskowanie hydrodynamiczne w którym płyn osłaniający płynie szybciej niż centralny strumień z komórkami. ( Cząsteczki przesuwają się do miejsca o niższym ciśnieniu)
Co robi sorter w cytometrze?
Zdolność selekcji populacji określona przez logiczną kombinację regionów (`gate') i wyodrębnienie tej populacji z analizowanej próbki.
SORTER mam zdolność fizycznego wyodrębniania subpopulacji.
Sortowanie w cytometrze:
1) Hydrodynamiczne ogniskowanie mieszaniny komórek lub cząsteczek wewnątrz komory z przepływającym płynem.
2) Analiza komórek przez światło laserowe przez rozproszenie i sygnał fluorescencyjny.
3) Przyporządkowanie określonych regionów do określonych populacji cząsteczek
Co to jest FSC i SSC
FSC - Rozproszenie na wprost
* Określa wielkość badanej komórki
* Mierzone wzdłuż osi padającego lasera na wprost
(emitowane światło ugina się na brzegach badanej komórki, w kierunki biegu promieni)
SSC- Rozproszczenie boczne - światło laserowe odbite i rozproszone
* Określa gęstość i liczbę ziarnistości (względnie)
* Mierzona pod kątem 90° w stosunku do wiązki laserowej
(Ugięcie światła lasera pod kątem prostym na błonie komórkowej i strukturach wewnątrzkomórkowych)
Analiza fluorescencyjna w cytometrze - wykorzystanie barwników
Polega na analizie fluorescencji barwników związanych z przeciwciałami.
Emisja fotonu następuje wtedy, kiedy elektron powraca z wyższej (stan wzbudzenia) orbity na niższą (stan spoczynku)
Preparaty wymagane do badania cytometrycznego: ilość komórek, zawieszenie w buforze
Zawiesina pojedynczych komórek czy innych cząsteczek
W odpowiednio dobranym buforze, zazwyczaj PBS
Typowa gęstość : 105 - 107 komórek/ ml
Nadana prędkość : do 10,000 cząstek/sek
(typowa 3,000)
Sortowanie do 100,000/sek (typowe 30,000/sek ~ 108 / godzinę)
Zawiesina komórek do bezpośredniej analizy
komórki nieadherentne
krew obwodowa/ komórki szpiku kostnego
mikrorganizmy
zawiesina bakterii
drożdże
Preparaty wymagające specjalnego przygotowania:
Komórki adherentne czy tkanki stałe muszą być poddane procesowi przygotowania ich w postaci zawiesiny przez:
enzymatyczne trawienie : trypsyną, kolagenazą, pronazą.
działaniu czynników chelatujących - wiązaniu jonów przez : EDTA, EGTA, TPB.
działaniu mechanicznemu : aspiracji (strzykawka) i sonikacja.
Chromosomy uzyskiwane są z komórek z cyklu mitotycznym.
Jądra komórkowe uzyskiwane są z tkanki i przechowywane w bloczkach parafinowych.
Metody te mogą uszkodzić powierzchnię komórki i epitopy, które chcemy analizować.
10. Zastosowanie cytometrii przepływowej
Ocena cech morfologicznych komórek
Diagnostyka kliniczna
Ocena fenotypu komórek
Ocena etapu różnicowania komórek