METODY

I. Izolacja, obróbka i elektroforeza DNA

I.1. Izolacja plazmidowego DNA w małej skali wg zmodyfikowanej metody lizy alkalicznej (Birnboim i Doly,1979)

1. 1,5 ml nocnej hodowli bakteryjnej wirować przez 3 min w mikrowirówce (12000 obr./min; 10500 × g) w temp. pokojowej.

2. Osad zawiesić w 100 μl zimnego roztworu I.

3. Po 5-minutowej inkubacji w temp. pokojowej dodać 200 μl roztworu II, delikatnie wymieszać i inkubować przez 5 min w lodzie.

4. Dodać 150 μl zimnego roztworu III i inkubować przez 5 min w lodzie.

5. Dodać 50 μl mieszaniny fenol:chloroform. Po dokładnym wymieszaniu, mieszaninę wirować przez 5 min w mikrowirówce (12000 obr./min; 10500 × g).

6. Do zebranego supernatantu dodać 1 ml 96 % alkoholu etylowego. DNA wytrącać przez 20 min w temp. -20°C.

7. Wirować 15 minut w mikrowirówce (12000 obr./min; 10500 × g), w temp. 4°C.

8. Osad przemyć 70 % etanolem, wysuszyć i zawiesić w 20-40 μl buforu TE.

I.2. Izolacja i oczyszcznie plazmidowego DNA poprzez ultrawirowanie w gradiencie chlorku cezu z bromkiem etydyny (Sambrook i Russell, 2001)

1. Nocną hodowlę bakteryjną (1000 ml) wirować 20 min w temp. 4°C przy 7000 obr./min(9300 × g) (wirówka Sorval RC5B).

2. Osad zawiesić w 40 ml roztworu I, a następnie dodać 80 ml roztworu II i delikatnie wymieszać.

3. Po 10-minutowej inkubacji w lodzie dodać 60 ml roztworu III i preparaty pozostawić w lodzie na 15 min.

4. Preparaty zwirować przez 15 min w temp. 4°C przy 8000 obr./min (12000 × g) (wirówka Sorval RC5B).

5. Do przefiltrowanego przez jałową gazę supernatantu dodać 0,6 objętości izopropanolu i wytrącać DNA w temp. pokojowej przez 20 min.

6. Próby wirować 15 min w temp. pokojowej przy 8000 obr./min (12000 × g) (wirówka Sorval RC5B).

7. Osad wysuszyć i zawiesić w 8 ml buforu TE.

8. Po zobojętnieniu roztworu za pomocą 2 M Tris base dodać 8,6 g chlorku cezu, a po jego rozpuszczeniu, 1 ml bromku etydyny (10 mg/ml).

9. Inkubować 10 min w temp. pokojowej.

10. Preparat wirować 10 min przy 10000 obr./min. (12000 × g) (wirówka Sorval RC5B).

11. Zebrać supernatant i doprowadzić jego gęstość do wartości 1,55-1,59 g/ml.

12. Próby wirować 48 godz. w temp. 15°C, przy 40000 obr./min (160000 × g) (Beckman L7 Ultracentrifuge), a następnie zebrać pasmo plazmidowego DNA.

13. Bromek etydyny usunąć, stosując kilkukrotną ekstrakcję równą objętością izopropanolu nasyconego chlorkiem cezu.

14. Chlorek cezu usunąć, dializując preparat w 2 l buforu TE przez 24 godz. w temp. 4°C. Bufor zmienić dwukrotnie w czasie dializy.

I.3. Izolacja całkowitego DNA przez fenolowanie (Williams i wsp., 1998)

1. Nocną hodowlę bakteryjną (1,5 ml) zwirować w mikrowirówce przy 12 000

obr./min (10500 × g).

2. Osad zawiesić w 400 μl roztworu fizjologicznego (RF), dodać 400 μl

fenolu nasyconego 1 M Tris HCl (pH 8,0), wymieszać intensywnie przy użyciu mikrowytrząsarki przez około 2 minuty.

3. Wirować 5 minut (12 000 obr./min; 10500 × g) w temp. pokojowej.

4. Zebrać fazę wodną i powtórzyć procedurę.

5. Następnie fazę wodną potraktować (analogicznie jw.) dwukrotnie mieszaniną fenol:chloroform (1:1 v/v), a potem chloroformem, w celu usunięcia resztek fenolu.

6. Do zebranej fazy wodnej dodać 2 objętości etanolu (96 %) oraz 0,1 objętości 3 M octanu potasu.

7. DNA wytrącać przez 30 min w -20°C.

8. Preparat odwirować przez 20 min w 4ºC (12 000 obr./min; 10500 × g).

9. Osad przemyć 70 % etanolem, wysuszyć i zawiesić w 40 μl buforu TE.

I.4. Izolacja fragmentów DNA z żelu agarozowego

Fragmenty restrykcyjne uzyskane w reakcji PCR bądź po trawieniu plazmidowego DNA rozdzielić w żelu agarozowym (0,8-2 %) w buforze TAE. Po wycięciu z żelu bloczku agarozowego, zawierającego odpowiedni fragment DNA, przeprowadzić izolację DNA, używając zestawu „DNA Gel Out” firmy A&A Biotechnology (Gdańsk) zgodnie z zaleceniem producenta.

I.5. Izolacja i elektroforeza wielkocząsteczkowego DNA [wg procedury opisanej przez Eckhardta (1978) i zmodyfikowanej przez Hynesa i McGregor (1990)]

I.5.1. Przygotowanie żelu agarozowego do elektroforezy wielkocząsteczkowego DNA

Żel agarozowy o stężeniu 0,75 % przygotować w 1 x stężonym buforze TBE. Po

umieszczeniu żelu w komorze aparatu do elektroforezy, komorę uzupełnić 1 x stężonym buforem TBE, do wysokości górnej powierzchni żelu. Do każdej studzienki żelu nałożyć po 25 l roztworu A (zawiera SDS), po czym prowadzić wstępną elektroforezę (przez 15-30 min, przy napięciu 100 V) w kierunku przeciwnym do właściwego kierunku prowadzenia elektroforezy (wprowadzenie do żelu SDS). Do komory aparatu dodawać następnie porcję buforu TBE, tak by pokrył on żel.

I.5.2. Izolacja i elektroforeza wielkocząsteczkowego DNA

1. 1 ml hodowli nocnej, rozcieńczonej do OD620 0,2, wirować przez 3 min w mikrowirówce (12000 obr./min; 10500 x g).

2. Po dokładnym usunięciu supernatantu, osad zawiesić w 0,5 ml zimnej wody dejonizowanej, a następnie dodawać 1 ml zimnego N-lauroilosarkozynianu sodu o stężeniu 0,3 %.

3. Zawiesiny bakterii wirować przez 3 min w mikrowirowce (12000 obr./min; 10500 x g).

4. Osad zawiesić w 40 l roztworu B.

5. Inkubować 10 min. w lodzie.

6. Dodać 10 l buforu lizującego i po łagodnym wymieszaniu nanieść 25 l mieszaniny do studzienki uprzednio przygotowanego żelu agarozowego.

7. Elektroforezę prowadzić przez 30 min, przy napięciu 40 V, a następnie przez 7,5 godz., przy napięciu przy napięciu 100 V.

8. Po rozdziale elektroforetycznym żel umieścić w wodnym roztworze bromku etydyny (2 μg/ml; 20 min), a następnie odpłukać w wodzie (przez noc). DNA analizować analogicznie jak po elektroforezie drobnocząsteczkowego DNA.

II. Hybrydyzacja DNA-DNA

II.1. Znakowanie sondy DNA z wykorzystaniem zestawu DIG-High Prime firmy Roche

1. DNA przeznaczony do znakowania (1 μg) zawiesić w 16 μl ddH₂O, po czym zdenaturować poprzez inkubację we wrzącej łaźni wodnej (10 min) i szybkie schłodzenie w lodzie.

2. Dodać 4 μl firmowej mieszaniny DIG-High Prime (zawierającej 1 u/μl fragmentu Klenowa polimerazy I, 1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 0,65 mM dTTP, 0,35 mM DIG-11-dUTP oraz 5-krotnie stężony bufor) firmy Roche.

3. Znakowanie prowadzić w 37°C przez ok. 20 godz.

II.2. Transfer ciśnieniowy DNA na membranę nylonową

1. DNA rozdzielić w 0,8 % żelu agarozowym.

2. Na szklanym filtrze komory do transferu (aparat firmy Kucharczyk T.E.) ułożyć 2 warstwy bibuły (Whatman, 3 MM Chr) zwilżonej wodą dejonizowaną, na niej zwilżoną membranę nylonową (Sigma, Nylon Membrane Charge Modified), foliową maskownicę i żel z rozdzielonym DNA.

3. Po ustawieniu ciśnienia 0,01 MPa, zalać żel na 20 min roztworem do depurynacji.

4. Po usunięciu roztworu do depurynacji powierzchnię żelu zalać buforem elucyjnym. Transfer prowadzić w warunkach alkalicznych przez 40 min przy ciśnieniu 0,04-0,05 MPa.

5. Po wyjęciu z aparatu membranę wysuszyć i naświetlić 2 min w świetle UV, o długości fali 300 nm, w celu przytwierdzenia do niej DNA.

II.3. Hybrydyzacja DNA-DNA

1. Prehybrydyzację i hybrydyzację prowadzić w buforze hybrydyzacyjnym, w piecu hybrydyzacyjnym w temperaturze 68⁰C.

2. W czasie prehybrydyzacji membranę z przytwierdzonym DNA inkubować w tym buforze (nie mniej niż 20 ml buforu/100 cm2 membrany) przez 4-6 godzin.

3. Zlać bufor i dodać nową, mniejszą porcję (2,5 ml/100 cm2) oraz zdenaturowaną (5 min w 100⁰C, a następnie przeniesienie do łaźni lodowej) sondę (około 1 g). Hybrydyzację prowadzić przez noc.

4. Wypłukać membranę mieszając: (i) 2 razy przez 5 min w temperaturze pokojowej w roztworze 2 x SSC/0,1 % SDS; (ii) 2 razy przez 15 min w temperaturze 68⁰C w 0,1 x SSC/0,1 % SDS.

II.4. Immunodetekcja utworzonych dupleksów

1. Reakcję generującą barwny produkt z wyznakowanym DNA prowadzić z wykorzystaniem zestawu do wizualizacji DNA (DIG Nucleic Acid Detection Kit firmy Roche).

2. Membranę przemyć 1 min roztworem do płukania membrany, a następnie przenieść do roztworu B2 i inkubować ją przez 30 min.

3. Po zlaniu roztworu B2 dodać przeciwciała [skoniugowane z alkaliczną fosfatazą, skierowane przeciwko digoksygeninie (DIG)] rozcieńczone 5000 razy w roztworze B2 (4 μl przeciwciał w 20 ml B2) i prowadzić inkubację przez kolejne 30 min.

4. Membranę wypłukać 2 razy przez 15 min w roztworze B1 (usuwanie wolnych, niezwiązanych przeciwciał).

5. Roztwór B1 zlać i dodać roztwór B3 i usuwnąć po 2 minutach.

6. Dodać roztwór wywołujący, zawierający 10 ml B3 oraz 200 μl NBT/BCIP i prowadzić inkubację (nie mieszając), wciemności, w temperaturze pokojowej, od kilku minut do 1 godziny.

7. Reakcję zatrzymać przez 5 minutową inkubację w TE. Membranę suszyć w temperaturze pokojowej.

III. Wprowadzanie DNA do komórek bakteryjnych

III.1. Transformacja chemiczna komórek E. coli zmodyfikowaną rubidowo-wapniową metodą Kushnera (1978)

1. Nocną hodowlę E. coli zaszczepić w stosunku 1:100 do nowej porcji

pożywki i hodować z intensywnym wytrząsaniem do uzyskania OD600 0,4-0,5.

2. Hodowlę (w porcjach po 1,5 ml) schłodzić przez 5 min w lodzie i wirować przy 8000 obr./min (7200 × g) w 4°C przez 5 min w mikrowirówce.

3. Osad, otrzymany z 1,5 ml hodowli, zawiesić w 1 ml roztworu I do transformacji, inkubować 10 min w lodzie i ponownie zwirować jw.

4. Po usunięciu supernatantu osad zawiesić w 200 μl roztworu II.

5. Zawiesinę bakterii inkubować 15 min w lodzie, po czym dodać plazmidowy DNA i inkubować w takich samych warunkach przez 15 min.

6. Następnie komórki poddać szokowi cieplnemu w 43°C przez 50 s i dodać 1 ml LB o temp. pokojowej.

7. Przed wysiewem na podłoże selekcyjne bakterie inkubować przez 30-40 min w temp. 37°C.

III.2. Koniugacja trójrodzicielska

W celu wprowadzenia plazmidów mobilizowalnych z E. coli do szczepów środowiskowych bakterii gramujemnych (np. Paracoccus spp., Pseudomonas spp.)

stosuje się metodę koniugacji trójrodzicielskiej.

1. Nocne hodowle szczepu dawcy (E. coli zawierającego mobilizowalny plazmid Mob+), szczepu pomocniczego (E. coli DH5α z plazmidem pRK2013 - Km^r, Tra⁺) oraz biorcy (izolat środowiskowy - Rif^r) zwirować w celu usunięcia antybiotyku.

2. Otrzymany osad bakterii zawiesić w świeżej porcji podłoża.

3. Przygotowane hodowle dawcy, szczepu pomocniczego i biorcy zmieszać w stosunku 1:1:2, po czym 100 μl mieszaniny wysiać na podłoże LA.

4. Po 24 godz. inkubacji w temperaturze optymalnej dla biorcy wyrosłe bakterie zmyć z powierzchni szalki 2 ml roztworu fizjologicznego, a odpowiednie rozcieńczenia (10⁰-10^-3) wysiać na podłoże LA uzupełnione właściwymi antybiotykami.

III.3. Elektroporacja

1. Odpowiednio przygotowaną do elektroporacji porcję komórek wyjąć z zamrożenia (- 70^oC) i umieścić na 30 min w lodzie.

2. Do porcji komórek (40 μl) dodać 2 μl DNA plazmidowego i kontynuować inkubacje przez kolejne 10 min.

3. Mieszaninę przenieść do schłodzonej kuwety do elektroporacji, umieścić kuwetę w saneczkach Bio-Rad Gene Pulser, i przepuścić impuls elektryczny - 2,5 kV, 25 μF (E. coli - 200Ω).

4. Po elektroporacji mieszaninę komórek zawiesić w 1 ml świeżego LB i przenieść do nowej probówki Eppendorfa.

5. Zawiesinę bakterii inkubować w optymalnej dla biorcy temperaturze przez 1 godz. bez wytrząsania.

6. Hodowlę zagęścić przez wirowanie, zawiesić w 100 μl LB i wysiać na szalki z podłożem selekcyjnym.

7. Inkubować w temperaturze optymalnej dla biorcy przez 24-48 godz.

IV. Oznaczanie aktywności β-galaktozydazy (Miller,1972)

1. Nocne hodowle szczepów niosących plazmidy testowe z genem reporterowym prowadzić w podłożu LB w optymalnej temperaturze.

2. Następnie hodowle rozcieńczyć do A600 0,05 i hodować w analogicznych warunkach do A600 0,3-0,6.

3. W celu oznaczenia aktywności enzymu, do 100 μl hodowli bakteryjnej dodać: (i) 50 μl TE z dodatkiem lizozymu (20 mg/ml), (ii) 2,5 μl EDTA (0,5 M, pH 8,0).

4. Próbę inkubować 5 minut w temp. pokojowej, po czym dodać 50 μl 0,1% SDS i 950 μl buforu Z.

5. Mieszaniny energicznie wytrząsać przez 10 sekund i pozostawić na 5 min w łaźni wodnej o temp. 28^oC.

6. Dodać 200 μl ONPG w stężeniu 4 mg/ml. Próby inkubować w temp. 28^oC do momentu pojawienia się żółtego zabarwienia, a następnie zahamować reakcję przez dodanie 0,5 ml 1 M Na₂CO₃.

7. Aktywność enzymu oznaczyć, mierząc absorbancję hodowli badanej przy długości fali 420 nm (A420) i 550 nm (A550), stosując wzór podany przez Millera (1972):

1000 × (A420 - 1,75 × A550)/ (T × V × A600)

A600 - absorbancja hodowli w czasie „0” (bezpośrednio przed oznaczeniem)

T - czas reakcji (w minutach)

V - objętość hodowli stosowanej do oznaczenia (w mililitrach).

V. Analiza komputerowa sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych

• Wizualizacja wyników reakcji sekwencjonowania DNA - program Chromas (http://www.technelysium.com.au/chromas.html).

• Analiza komputerowa sekwencji nukleotydowych - programy Clone Manager Professional suit SciEd8, Artemis

(http://www.sanger.ac.uk/Software/Artemis/) (Rutherford i wsp., 2000) i ORF Finder (http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi) .

• Porównanie sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych z danymi zgromadzonymi w bazach danych GenBank i ISfinder - programy serii BLAST (Altschul i wsp., 1997) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) oraz Pictogram (http://genes.mit.edu/pictogram.html).

• Analiza, porównywanie oraz nakładanie wybranych sekwencji aminokwasowych - programy dostępne na serwerze http://www.expasy.org/ oraz programy: Clustal-W (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/# ) (Thompson i wsp., 1994), MultAlin (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html) (Corpet, 1988) oraz HELIX-TURN-HELIX MOTIF PREDICTION (dostępny na stronie Web Network Protein Sequence @nalysis server).

• Analizy filogenetyczne - programy zawarte w pakiecie Phylip 3.65 (Felsenstein, 1989) oraz opracowanie graficznie w programie TreeView (wersja 1.6.6; http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html) .

• Modelowanie struktury drugorzędowej RNA - program GenBee (http://www.genebee.msu.su/services/rna2_reduced.html).

• Poszukiwanie motywów transbłonowaych białek - program TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ ).

MATERIAŁY

I, Podłoża i antybiotyki

Podłoża:

• płynne: LB - podłoże Luria-Bertani (Sigma);

• stałe: LA: przygotowywane poprzez zestalenie LB agarem - 15 g/l.

W zależności od potrzeb eksperymentu podłoże można uzupełnić (wartości dla E. coli):

• IPTG, o końcowym stężeniu 2 mM;

• roztworem X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktozyd) i IPTG (izopropylo-

β-D-tiogalaktopiranozyd) w DMF (dimetyloformamid);

• roztworem antybiotyku, o końcowym stężeniu:

• ampicylina - 100 μg/ml;

• chloramfenikol - 30 μg/ml;

• kanamycyna - 50 μg/ml;

• ryfampicyna - 50 μg/ml;

• tetracyklina - 20 μg/ml.

II. Roztwory i bufory

Roztwory do izolacji DNA metodą lizy alkalicznej:

• roztwór I: 50 mM glukoza, 25 mM Tris HCl, 10 mM EDTA; pH 8,0;

• roztwór II: 0,2 M NaOH, 1 % SDS;

• roztwór III: 3 M octan potasu, 5 M kwas octowy; pH 4,8.

Bufory i roztwory stosowane do elektroforezy drobnocząsteczkowego DNA:

• bufor TAE: 40 mM Tris base, 20 mM kwas octowy, 1 mM EDTA;

• bufor obciążający: 0,25 % błękit bromofenolowy, 30 % glicerol;

• roztwór wodny bromku etydyny do barwienia DNA w żelach agarozowych: 2 μg/ml;

• żel agarozowy: 0,8-2 % agaroza w buforze TAE.

Bufory i roztwory stosowane do izolacji i elektroforezy wielkocząsteczkowego DNA:

• roztwór A: 10 % SDS, cyjanol ksylenu FF - 1 mg/ml;

• 0,3 % N-lauroilosarkozynian sodowy;

• roztwór B: 10 mM Tris base, 10 mM EDTA, 20 % Ficoll (MT 400 000);

• bufor TBE: 89 mM Tris base, 2,5 mM EDTA, 89 mM kwas borowy;

• roztwór lizujący: 10 mM Tris base, 10 mM EDTA, RNaza A - 4 mg/ml, lizozym -

1 mg/ml, błękit bromofenolowy - 1 mg/ml.

Roztwory do transformacji bakterii metodą rubidowo-wapniową:

• roztwór I: 10 mM MOPS, 10 mM RbCl; pH 7,0;

• roztwór II: 100 mM MOPS, 50 mM CaCl2, 10 mM RbCl; pH 6,5.

Bufor TE:

• 10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA; pH 8,0.

Roztwór fizjologiczny (RF):

• 0,85 % NaCl.

Mieszanina stosowana do odbiałczania preparatów DNA:

• fenol nasycony 1 M Tris HCl (pH 8,0), chloroform - (1:1 v/v).

Bufory i roztwory używane do hybrydyzacji:

• roztwór do depurynacji: 0,25 M HCl;

• roztwór elucyjny (do transferu): 0,4 M NaOH, 0,6 M NaCl;

• 20 × SSC: 3 M NaCl, 0,3 M cytrynian sodu;

• odczynnik blokujący z zestawu firmy Roche (BSS - Blocking Stock Solution): 10 % BSS rozpuszczony w roztworze B1;

• roztwór hybrydyzacyjny: 5 × SSC, 1 % BSS, 0,1 % N-lauroilosarkozynian sodu, 0,02% SDS;

• roztwór B1: 0,1 M kwas maleinowy, 0,15 M NaCl; pH 7,5;

• roztwór B2: 1 % BSS w B1;

• roztwór B3: 100 mM Tris HCl (pH 9,5), 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2;

• roztwór do płukania membrany: 0,3 % Tween 20 w B1;

• roztwór wywołujący: 200 μl NBT/BCIP (z zestawu do wizualizacji DIG Nucleic Acid

Detection Kit, firmy Roche) w 10 ml B3;

• inne roztwory: (i) 2 × SSC/0,1 % SDS; (ii) 0,1 × SSC/0,1 % SDS.

Bufory i roztwory stosowane do oznaczania β-galaktozydazy:

• bufor Z: 0,04 M NaH₂PO₄ × H₂O; 0,06 M Na₂HPO₄ × 7H₂O; 0,01 M KCl; 0,001 M

MgSO₄ × 7H₂O; 0,05 M β-merkaptoetanol; pH 7,0;

• 1 M Na₂CO₃;

• ONPG - 4 mg/ml w buforze Z;

• lizozym - 6 mg/ml w buforze TE;

• 0,1 % SDS;

• 0,5 M EDTA; pH 8,0.

III. Zestawy odczynników

• zestaw do izolacji plazmidowego DNA: ,,Plasmid Mini” - A&A Biotechnology;

• zestaw do izolacji DNA z żeli agarozowych: „DNA Gel Out” - A&A Biotechnology;

• zestaw do oczyszczania DNA po obróbkach enzymatycznych: ,,DNA Clean Up” -

A&A Biotechnology;

• zestaw do znakowania DNA: „DIG-High Prime” - Roche;

• zestaw do wizualizacji DNA po hybrydyzacji DNA-DNA: „DIG Nucleic Acid Detection Kit” - Roche.

---