Hodowle komórek i tkanek zwierzęcych

Wykład 1. Definicje i pojęcia związane z przedmiotem

Hodowla - tworzenie warunków do rozwoju. Zespół zabiegów i procesów w wytwarzanych sztucznie optymalnych warunkach dla rozwoju hodowanego organizmu.

Z reguły rozwój daje się zauważyć po 24 godz. stąd definicja hodowli jako metody umożliwiającej utrzymanie poza organizmem żywych komórek i tkanek ponad 24 godz.

Inkubacja - tworzenie warunków do przetrwania (= zachowania i przejawiania funkcji życiowych). Podczas inkubacji brak jest zewnętrznych, sztucznych warunków (zewnętrznej ingerencji) pobudzających rozwój. Inkubacja zapewnia minimalne warunki (co najmniej temperaturę) do zachowania podstawowych funkcji życiowych

Hodowle komórek - procedury hodowlane tworzące warunki do wzrostu i rozwoju komórki, która funkcjonuje niezależnie od innych komórek. (Komórka jest definiowana przez niezależność funkcjonalną. Def.: Komórka (łac. cellula) jest to najmniejsza budulcowa i funkcjonalna jednostka organizmów żywych. Jest ona zdolna do przeprowadzania wszystkich podstawowych procesów życiowych (takich jak przemiana materii, wzrost i rozmnażanie).

Cechy „normalnej” komórki istotne dla definicji hodowli i sposobu jej prowadzenia:

- ograniczony okres przeżycia

- właściwości adhezyjne (dla większości komórek)

W hodowlach komórkowych:

- komórki funkcjonują niezależnie od siebie (po wyjęciu z hodowli komórka może dalej funkcjonować bez zmiany swoich właściwości w nowej hodowli)

- jeśli nie są w pełni wykształcone, kontynuują wzrost i rozwój

Hodowla tkanek - hodowla zespołu komórek, które funkcjonują zależnie od siebie i od podłoża. (Tkanka jest definiowana przez pochodzenie, budowę i funkcję. Mogą być pochodzenia naturalnego lub konstruowane.

Def.: Tkanka - zespół komórek o podobnej budowie, określonych czynnościach, wspólnym pochodzeniu i ich wytworów (substancja międzykomórkowa) przystosowanych do wykonywania określonej funkcji na rzecz całego organizmu. Uwzględniając cechy morfologiczne i fizjologiczne zespołów komórkowych tworzących tkanki, wszystkie tkanki dzieli się na cztery grupy: nabłonkową, łączną, mięśniową, nerwową.

W hodowlach tkankowych

- komórki działają zależnie od siebie i podłoża

- komórki wspólnie przejawiają jakąś cechę i funkcję

- mogą kontynuować wzrost i rozwój

Hodowle narządów - hodowle zespołu komórek lub/i tkanek funkcjonujących zależnie od siebie i od podłoża w celu naśladowania określonej funkcji fizjologicznej. (Narząd jest definiowany przez funkcję jaką wypełnia dla całego organizmu i złożoną strukturę. Def.: Narząd, organ - część wielokomórkowego organizmu zwierzęcego lub roślinnego, która pełni określoną funkcję fizjologiczną. Narząd posiada swoistą budowę, wygląd i położenie odróżniające go od innych narządów. Narządy często łączą się w struktury wyższego rzędu, spełniające określone funkcje fizjologiczne - układy narządów (u roślin analogiczne struktury nazywamy systemami). Przykładowe narządy: słuchu, smaku, węchu, wzroku, rozrodcze, równowagi, ruchu, wydalnicze.

W przypadku narządów hodowlę można definiować poprzez długi okres utrzymywania narządu poza organizmem. Narząd aby pełnił swoją funkcję musi być już ukształtowany. Narząd można zatem wyhodować ale raczej nie hodować.

Cechy hodowli narządowych:

- integralna struktura narządu

- zróżnicowanie histologiczne

- brak wzrostu podczas trwania hodowli

- ograniczona wielkość jeśli stosuje się odżywianie poprzez dyfuzję (ok. 1 mm przy tkankach od małych gryzowni do 5 mm przy narządach od dużych zwierząt roślinożernych)

- raczej ograniczony czas trwania (3 dni)

Historia rozwoju hodowli komórek i tkanek

Rozwój ściśle uzależniony od rozwoju metod aseptyki i antyseptyki oraz postępu techniki urządzeń do obserwacji i hodowli komórek.

Wyróżnia się 3 fazy w historii rozwoju technik hodowli komórek:

Faza adaptacji - adaptacja izolowanych tkanek i narządów do środowiska poza organizmem

Ekspansji - poprawa warunków hodowli, tworzenie różnego rodzaju hodowli

Specjalizacji - tworzenie hodowli dla konkretnych celów (gł. technologicznych, sztuczne narządy)

1907 - R.G. Harison - hodował wycinki t. nerwowej żaby w kropli skrzepłej limfy. Zaobserwował wydłużenie nerwów w embrionie.

1912 - A. Carrel - zastosował postępowanie aseptyczne i antyseptyczne w hodowlach tkanek co pozwoliło na zanczne wydłużenie czasu trwania hodowli. Wyizolował fibroblasty z embrionów kurzych.

1918 - Rous i Jones - zastosowali trypsynę do izolacji komórek przyklejających się do podłoża

1923 - A. Carrel - zastosował szklane butelki do hodowli komórek zapewniające przyklejanie komórek do dnia naczynia oraz pracę aseptyczną

1949 - J.F. Enders - pokazał, że wirusy można namnażać w hodowlach komórkowych - podstawy dla rozwoju produkcji szczepionek

1955 - H. Eagle - zwrócił uwagę możliwość stosowania chemicznie definiowanych pożywek zamiast biologicznych wyciągów o nieznanym składzie. Wymyślił MEM (Minimum Essential Medium) - łatwe do sterylizacji, o stałym składzie

1961 - L. Hayflick, P.S. Moorhead - wykryli, że izolowane komórki mają ograniczoną liczbę podziałów. Stworzenie definicji „normalnej” komórki, linii komórkowych.

1970 - opracowanie technologii rekombinacji DNA - początek wykorzystania komórek w biotechnologii

1975 - G. Kohler, C. Milstein - pierwsza produkcja przeciwciał monoklonalnych przez hybrydy komórkowe - początek wykorzystania hodowli komórek do produkcji przeciwciał, hormonów, glikoprotein i innych składników sekrecyjnych.

Cele prowadzenia hodowli komórek i tkanek

3 podstawowe cele

1/ badanie zjawisk na niższym poziomie organizacji niż cały organizm (wewnątrzkomórkowym, komórki, tkanki, narządu).

2/ zastąpienie badań na zwierzętach modelami nie odczuwającymi cierpienia.

3/ wykorzystanie w biotechnologii (synteza hormonów, przeciwciał, glikoprotein, itd.)

Cele określają wymagania dla hodowli oraz określają sposób w jaki prowadzi się hodowle:

Ad.1. hodowla powinna charakteryzować się warunkami łatwymi do kontroli i wykazywać dużą powtarzalność.

Ad.2 hodowla powinna być jak najbardziej podobna funkcjonalnie do żywego zwierzęcia a wyniki badań powinny dać się ekstrapolować z warunków in vitro do in vivo (nie muszą się bezwzględnie dać ekstrapolować ale musimy o tym wiedzieć i znać ograniczenia).

Ad.3. model musi wykazywać pełną kontrolę warunków hodowli, dużą powtarzalność i dać się skalować do dużych rozmiarów.

Rodzaje hodowli komórkowych

A. Ze względu na pochodzenie komórek:

Pierwotne - komórki stosowane w hodowli pochodzą bezpośrednio z organizmu. (Z eksplantów = wycinków tkankowych z których komórki migrują do podłoża hodowlanego. Po izolacji z narządu lub tkanki) - szczegóły na wykładzie nr 3

Wtórne (Linie komórkowe) - populacje komórek powstające z hodowli pierwotnej po pierwszym pasażu (przeniesieniu komórek do nowego naczynia) - szczegóły na wykładzie 2

Embrionalne - komórki pochodzą z tkanek embrionalnych i w hodowli mogą się różnicować w inne komórki (nie są ani pierwotne ani wtórne) - szczegóły na wykładzie nr 5

Monokultura - hodowla jednego typu komórek (takich samych morfologicznie i czynnościowo). Jeśli komórki jednego typu pochodzą od kilku osobników tego samego gatunku to jest to w dalszym ciągu monokultura.

Kokultura (kultury polimorficzne) - składają się co najmniej z 2 komórek różnego typu (lub tego samego typu ale z różnych gatunków).

B. Ze względu na sposoby hodowli komórek

B.1. Niezorganizowane (bezstrukturalne)

B.1.1. Zawiesiny - komórki nie mają bezpośredniego kontaktu ze stałym podłożem ani ze sobą nawzajem (np. hodowla komórek krwi, np. limfoblastów). Zawiesiny wykorzystywane są głównie do inkubacji. Mogą zawierać EDTA aby ograniczyć zlepianie się komórek.

B.2. Hodowle płaskie (jednowarstwowe)

B.2.1. Płytkowe - hodowla na równej powierzchni z którą komórki mają bezpośredni kontakt i aktywnie się organizują. Trwałe podłoże w hodowli jest niezbędne dla komórek spolaryzowanych, podłożo-zależnych. W hodowlach homogenach lub bez surowicy płytki pokryte są „substancją międzykomórkową” ECM (extracellular matrix): kolageny, fibronektyna, laminina, witronektyna, matirgel (z komórek sarkomy Engelbretha-Holma-Swana)).

Istotna rola połączeń międzykomórkami i połączeń z podłożem.

- składniki ECM stymulują proliferację i różnicowanie

- wiążą się z receptorami błonowymi, powiązane są ze szkieletem komórkowym (kadheryny, integryny, koneksyny)

najważniejsze składniki: fibronektyna, kolageny I-V i XI, laminina, witronektyna

B.2.2. Na mikronośnikach - hodowla płaska na nierównej powierzchni (np. na kulkach z dekstranu, polistyrenu, biosilonu, kolagenu, celulozy, żelatyny).

Cel hodowli na mikronośnikach:

- zwiększenie powierzchni do przyklejania komórek

- łatwość skalowania do dużych hodowli, dzięki regulacji powierzchni

Cechy mikronośnika:

- mały (średnica ok. 200 mcm) = jak największa powierzchnia przy małej objętości (średnio przykleja się 100-200 komórek),

- lekki = łatwo unosi się w pożywce podczas niewielkiego wstrząsania (40 rpm),

- przeźroczysty = widać co się na nim dzieje,

- obdarzony ładunkiem = pozwala na szybkie przyklejenie się komórek (kula ma większą gęstość ładunku na powierzchni)

- łatwo „uwalnia” przyklejone komórki pod działaniem enzymów

Komercyjne mikronośniki: Cytodex (różne typy: dekstran z N,N-dietyloaminoetylen (DEAE) dla zwiększenia ładunku, kolagen na powierzchni)

W hodowlach płytkowych powierzchnia jest limitowana powierzchnią naczynia (płytka, butelka). Średnia butelka o płaskiej ścianie ma 0,02 m² powierzchni i może przykleić 10⁸ komórek. Podobnej wielkości układ z mikronośnikami ma powierzchnię 0,64 m² i może przykleić 2x10⁹ komórek (20-razy więcej).

B.2.3. Na pumeksach - hodowla płaska na mikronośnikach porowatych.

Cel hodowli na pumeksach:

- dodatkowo zwiększona powierzchnia w porównaniu do mikronośników

- ochrona fizyczna komórek przed czynnikami środowiska.

Porowaty mikronośnik może nosić około 2000 komórek. Komercyjne pumeksy są wykonane zwykle z żelatyny

B.3. Hodowle przestrzenne

Cel: możliwie pełna organizacja przestrzenna w której wszystkie bieguny komórki mają kontakt z innymi komórkami lub substancją międzykomórkową

B.3.1. Konstruowane in vitro

Wielowarstwowe - hodowle płytkowe zbudowane z 2 lub 3 warstw komórek.

Agregaty - skupiska komórek powstające samoistnie lub pod działaniem siły zewnętrznej (ciążenia, odśrodkowej), których stabilność utrzymywana jest dzięki aktywności samych komórek. (W pierwotnych agregatach jest brak czynnika zlepiającego i stabilizującego skupisko komórek). Agregaty tworzą komórki podłożo-zależne w sytuacji gdy nie są stanie zorganizować się na podłożu.

Sferoidy - skupiska komórek o kształcie kuli, stabilizowane aktywnością samych komórek. (Sferoid powinien się sam zorganizować). Mogą powstawać z dużych agregatów (powyżej 500 mcm) w wyniku apoptozy lub martwicy komórek centralnych.

Komórki uwięzione (Cell entrapment) - komórki (róznego typu, także komórki podłożo-niezależne) uwięzione w polimerach (agar zwykle od 0,5 do 5%). W hodowli takiej komórki nie muszą utrzymywać ze sobą kontaktu. Polimery formowane są w kule wielkości 100-200 mcm. Polimery nie mogą hamować podziałów komórkowych, muszą zapewniać swobodną dyfuzję składników medium.

Cel hodowli komórek uwięzionych:

- tworzenie trwałych skupisk komórek, które nie są podłożo-zależne lub wolno się organizują na podłożu

- ochrona komórek przed działaniem czynników zewnętrznych (możliwe intensywne mieszanie medium, szybka wymiana, gwałtowne natlenowanie bez uszkodzenia komórek)

- łatwiejsza izolacja ewentualnych produktów komórek z medium hodowlanego

- możliwość stosowania przepływu medium w hodowli (uwięzione komórki są cięższe niż luźne, nie są porywane strumieniem medium)

- możliwość zagęszczenia hodowli, bez ograniczenia dostępu medium do komórek

Komórki kapsułkowane (Enkapsulaty komórek) - konglomeraty komórek stabilizowane (utrzymywane razem) przez działanie czynnika zewnętrznego stosowanego w postaci otoczki (żelatyna, agar, alginian, polilizyna). Mogą powstać przez otoczenie agregatu lub sferoidu. Jest to modyfikacja komórek uwięzionych, w której komórki mają ze sobą kontakt.

Cel hodowli komórek kapsułkowanych:

- jak w przypadku komórek uwięzionych

- otoczka decyduje jakie związki wydostają się na zewnątrz kapsułki (produkty komórek można zbierać wewnątrz kapsułki, np. przeciwciała).

Organotypy (Kokultury organotypowe, bionarządy, konstrukty) - w hodowli znajdują się komórki różnego pochodzenia, które współdziałają ze sobą, uzyskując cechy i funkcje jakie spełniają w narządzie. Kokultura organotypowa ma stworzyć ekwiwalent narządu. Np.:

- biosztuczna skóra (z komórek autologicznych naskórka i skóry właściwej keratynocyty + dermatocyty),

- biosztuczna wątroba (z komórek heterologicznych wątroby: hepatocyty + komórki Kuplera),

- biosztuczna trzustka (z komórek heterologicznych wysepek trzuski: komórki beta, alfa i gamma)

B.3.2. Hodowle przestrzenne naturalnego pochodzenia:

Skrawki narządów lub tkanek - niewielkie fragmenty tkanek lub narządów wielkości zapewniającej dyfuzję składników medium do całego obszaru skrawka.

Hodowle narządów (organów) - hodowle (raczej inkubacja) narządów lub fragmentów narządów. Narząd może być odżywiany przez dyfuzję (hodowla statyczna), transport wymuszony, perfuzję (hodowla przepływowa). (Np.: fragment jelita, perfundowana wątroba, nerka, mózg izolowany, oko)

Osobna historia to sztuczne modele (to nie są hodowle !)

Modele komórek, tkanek, narządów - sztuczne konstrukcje wykazujące funkcje podobne do biologicznych ale nie muszą zawierać elementów żywych (artificial, to nie są hodowle !), np. nerka wątroba skóra).

Wady i zalety hodowli komórek i tkanek

Zalety

- możliwość obserwacji zmian (mechanizmów działania) na różnych piętrach organizacji organizmu (od organelli komórkowych po narząd)

- możliwość analizy roli poszczególnych komórek, tkanek

- możliwość badania interakcji zachodzących pomiędzy różnymi komórkami

- możliwość łatwej kontroli środowiska (bodźców) podczas eksperymentu biologicznego

- możliwość uzyskania homogennej grupy badanej (ograniczenie zmienności populacji badanej jest podstawą dobrego eksperymentu biologicznego)

- oszczędzanie zwierząt w eksperymencie (szczególnie badania toksykologiczne)

- wykorzystanie w celach produkcyjnych (szczególnie uzyskiwanie glikoprotein)

Wady

Nie mają wad za wyjątkiem konieczności utrzymania aseptyki. Mają tylko ograniczenia w zakresie zastosowaniu do różnych celów. Jeśli zna się ograniczenia i jeśli wiadomo w jakim celu chce się wykorzystać hodowlę można użyć model bez wad, lub opracować własny.

Uwaga: nie należy wymagać od każdego układu in vitro, że wyniki uzyskane w tym układzie zawsze dadzą się przenieść do warunków in vivo.

---