BIOTECHNOLOGIA

POJĘCIA:

1. Biotechnologia jest interdyscyplinarną dziedziną łączącą w sobie nauki techniczne i przyrodnicze, obejmującą badanie, wytwarzanie i wykorzystanie DNA/RNA, białek/enzymów, drobnoustrojów, kultur komórkowych w procesach modyfikacji genetycznej, biosyntezy, biotransformacji, bioutylizacji a także wyodrębnianie i modyfikacje tak otrzymanych bioproduktów.

2. Biotechnologia tradycyjna- przebiegająca z użyciem drobnoustrojów i komórek organizmów wyższych niż zawierających obcego materiału genetycznego

3. Biotechnologia nowoczesna gdzie stosowane są szczepy drobnoustrojów lub inne linie komórkowe skonstruowane metodami inżynierii genetycznej

4. Inżynieria genetyczna-ingerencja w materiał genetyczny organizmów, w celu zmiany ich właściwości dziedzicznych. Polega na wprowadzaniu do komórek organizmu biorcy, określonego odcinka DNA dawcy.

5. Biotechnologia czerwona wykorzystywana w ochronie zdrowia i medycynie. Jest ważnym i dynamicznie rozwijającym się obszarem biotechnologii, w szczególności w zakresie produkcji nowych biofarmaceutyków, rozwoju diagnostyki genetycznej, geoterapii i

ksenotransplantologii.

6. Biotechnologia zielona związana jest z rolnictwem, obejmuje zastosowanie metod inżynierii genetycznej w celu doskonalenia produkcji roślinnej i zwierzęcej. Ważnym obszarem jest wprowadzanie transgenicznych roślin do produkcji szczepionek doustnych i rekombinowanych białek a także wykorzystanie tychże roślin jako surowców odnawialnych w biorafineriach.

7. Biotechnologia biała- biotechnologia przemysłowa wykorzystująca systemy biologiczne w produkcji przemysłowej i ochronie środowiska

8. Fermentacja- z łac. burzenie się. W praktyce biotechnologicznej służy do określania przemian chemicznych w wyniku aktywności metabolicznej drobnoustrojów czyli obejmuje zarówno fermentacje beztlenowe jak np. fermentację etanolową jak również tlenowe np. fermentację octanową.
9. Mikroorganizm (drobnoustrój) - organizm obserwowany dopiero pod mikroskopem. Mikroorganizmami są bakterie, archeany, pierwotniaki i niektóre grzyby.

10. Komórka prokariotyczna- komórka nie posiadająca jądra komórkowego. Podstawowym materiałem genetycznym jest nukleoid. Materiał genetyczny nie jest oddzielony od reszty komórki żadną błoną.

11. Komórka eukariotyczna - materiał genetyczny tej komórki jest umieszczony w jądrze. Zawierające DNA z histonami upakowane w chromosomy.

12. Jądro- najważniejsze z organelli komórkowych występująca w komórkach organizmów jądrowych (Eukarionty), odgrywająca decydującą rolę w przekazywaniu cech dziedzicznych i przebiegu przemiany materii.

13. Chromosomy-samoodtwarzające się, stałe składniki jądra komórkowego, będące nosicielami genów.

14. Gen-odcinek DNA nadający komórce zdolność do tworzenia różnych form RNA, pośredniczy w kodowaniu białek. Gen decyduje o przekazywaniu poszczególnych dziedzicznych cech organizmu.

15. Genom człowieka-kompletny zestaw informacji genetycznej człowieka; składa się z 2 odrębnych genomów.

16. Ekspresja genu - proces, w którym informacja genetyczna zawarta w genie zostaje odczytana i przepisana na jego produkty, które są białkami lub różnymi formami RNA.

17. DNA

18. Nukleozydy-są zbudowane z zasady heterocyklicznej (adenina,cytozyna,guanina,uracyl,tymina) i odpowiedniego cukru deoksyrybozy lub rybozy w zależności od tego w skład którego biopolimeru wchodzą DNA czy RNA

19. Nukleotyd- połączenia rybozy lub deoksyrybozy, zasady purynowej albo pirymidynowej i kwasu fosforowego.

20. Zasada heterocykliczna- związek organiczny wchodzący w skład nukleozydu.

21. Replikacja-jest to powielanie materiału genetycznego.

22. Polimeraza DNA - enzym katalizujący syntezę DNA w czasie replikacji lub naprawy DNA.

23. Ligaza-enzym restrykcyjny, łączący odcinki DNA.

24. Transkrypcja w genetyce oznacza proces syntezy RNA na matrycy DNA przez różne polimerazy RNA. Jest to, zatem przepisywanie informacji zawartej w DNA na RNA.

25. mRNA- cząsteczki informacyjne RNA powstające jako kopie odcinków DNA podczas transkrypcji w biosyntezie białka.

26. Ekson- kodująca część cząsteczki DNA, ulegając transkrypcji pojawia się w dojrzałej cząsteczce RNA. Może kodować element białkowy.

27. Intron- niekodująca część cząsteczki DNA, ulega transkrypcji, jest wycinany podczas obróbki potranskrypcyjnej, w procesie splicingu.

28. Kod genetyczny-to zasada, według której informacja genetyczna, zawarta w DNA lub RNA, w komórkach wszystkich organizmów może ulegać "tłumaczeniu" na kolejność aminokwasów w białka w procesie translacji. Kod genetyczny jest: kodem trójkowym, zdegenerowany, bezprzecinkowy, uniwersalny, jednoznaczny, kodony nie zachodzą na siebie.

29. Kodon- jednostka informacji genetycznej; 3 kolejne nukleotydy w łańcuchu DNA lub mRNA, wyznaczające rodzaj i miejsce 1 aminokwasu w łańcuchu polipeptydu podczas biosyntezy białka w komórce.

30. Kodony synonimowe- kodony określające ten sam aminokwas.

31. Degeneracja kodu genetycznego-nadmiarowość kodu genetycznego, przejawiająca się tym, że określony aminokwas jest kodowany przez więcej niż jeden kodon

32. Mutacja-jest to nagła zmiana materiału genetycznego. Mutacja może być wywołana samorzutnie, lub przez czynniki zewnętrzne.

33. tRNA- transportujący RNA,pośredniczy w przyłączaniu kolejnych aminokwasów w procesie biosyntezy białka.

34. Antykodon-3 kolejne nukleotydy tRNA, stanowiące jednostkę czynną w procesie syntezy białka w komórce

35. rRNA- rybosomowy RNA. Cząsteczki kwasu rybonukleinowego wchodzące w skład rybosomów, biorących udział w procesie biosyntezy polipeptydów.

Rekombinowany DNA- DNA zawierający wprowadzone za pomocą wektorów dane sekwencje zasad tworzące gen.

36. Rybosom- organelle służące do produkcji białek w ramach translacji.

37. Wektor- cząsteczka DNA mogąca być przenośnikiem interesującego nas genu i która posiada zdolność do automatycznej replikacji w danym typie komórek.

38. Klonowanie to proces tworzenia organizmów mających taką samą informację genetyczną.

39. Klon- komórki będące swoimi wiernymi kopiami (o jednakowym składzie genetycznym).

40. Retrowirusy - rodzina wirusów, których materiał genetyczny zawarty jest w RNA. Najdokładniej poznanym retrowirusem jest wirus HIV.

41. Odwrotna transkryptaza- proces syntezy komplementarnej nici DNA na matrycy wirusowego RNA, katalizowany przez enzym zw. odwrotną transkryptazą.

42. Enzym restrykcyjny-enzym z grupy endonukleaz występujący w komórkach bakterii. Rozpoznaje kreślone odcinki łańcucha DNA obcego dla komórki i wycina je.

43. Sekwencja palindromowa - jest to sekwencja rozpoznawana przez enzymy restrykcyjne. Odczytywana z nici nonsensownej i sensownej jest taka sama.
5' A A T T 3'
3' T T A A 5'

44. Lepkie końce- kohezyjne końce fragmentu DNA, pociętego przez enzymy restrykcyjne w ten sposób, że cięcia przesunięte są względem siebie o kilka nukleotydów.

45. cDNA- komplementarny DNA, cząsteczka DNA będąca kopią sekwencji mRNA.

46. Plazmid- dwuniciowa, kolista cząsteczka DNA naturalnie występująca w niektórych bakteriach. Stosowana jako wektor w inżynierii genetycznej.

47. Miejsce wielokrotnego klonownia

48. Marker selekcyjny

49. Bakteriofag-wirus atakujący bakterie, zbudowany z otoczki białkowej, w której znajduje się materiał genetyczny.

50. Kosmidy- sztucznie wytworzone wektory używane w inżynierii genetycznej. Tworzy się je łącząc plazmidy z sekwencją cos bakteriofaga lambda.

51. PCR-(Polymerase Chain Reaction) - łańcuchowa reakcja polimerazy, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki.

52. Primer PCR

53. Polimeraza Taq- polimeraz kodowana w genomie bakterii Thermus aquaticus

54. Termocykler- urządzenie używane w laboratorium do przeprowadzenia PCR.

55. Polimorfizm fragmentów restrykcyjnych- występowanie w populacji osobników danego gat. DNA (deoksyrybonukleinowy kwas) różniącego się długością fragmentów odciętych enzymami restrykcyjnymi

56. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych- metoda badania kwasów nukleinowych oparta na zdolności do tworzenia kompleksu dwuniciowego przez jednoniciowe, komplementarne fragmenty kwasów nukleinowych.

57. Insulina-hormon peptydowy o działaniu ogólnoustrojowym, odgrywający rolę głównie w metabolizmie węglowodanów, lecz także białek i tłuszczów.

58. GMO(genetically modified organisms) - rośliny i zwierzęta zawierające w swych komórkach włączony do genomu gen obcego gatunku; uzyskiwane metodami inżynierii genetycznej.

59. Protoplasty- aktywna metabolicznie część komórki bakterii, grzyba lub rośliny czyli część komórki bez ściany komórkowej.

60. Elektroporacja- chwilowa dezintegracja błony komórkowej za pomocą pola elektrycznego podczas inkubacji komórek z egzogennym DNA.

61. Lipofekcja- opłaszczanie egzogennego DNA lipidami, które spontanicznie wnikają przez błonę komórkową do cytoplazmy

62. Mikroiniekcja- wprowadzenie fragmentów DNA za pomocą mikropipety

63. Plazmid T_i- plazmid z bakterii Agrobacterium tumefaciens, wywołujący guzowatość korzeni roślin

64. Insulina ludzka- produkowany w trzustce polipeptyd zbudowany z 51 aminokwasów. Zbudowana jest z dwóch łańcuchów: łańcuch A zawiera 21 reszt aminokwasów, a łańcuch B zawiera 30 reszt aminokwasów. Oba łańcuchy połączone są dwoma mostkami disiarczkowymi, a w łańcuchu A znajduje się jeszcze mostek S-S.

65. Insulina rekombinowana- insulina powstała w wyniku rekombinacji DNA w plazmidzie

66. Gensulin- lek stosowany w leczeniu cukrzycy

67. Zaproponowana przez Watsona i Cricka struktura dwuniciowej helisy DNA ma dwie cechy o kluczowym znaczeniu w pełnieniu przez DNA funkcji nośnika informacji genetycznej

a) struktura ta jest kompatybilna z każdą sekwencją zasad (pary zasad mają zasadniczo taki sam kształt)

b) sekwencja wzdłuż jednej nici determinuje całkowicie sekwencję drugiej nici (jako wynik komplementarnośi).

A zatem jeśli dwuniciowa helisa ulega rozdzieleniu na dwie pojedyncze nici to każda z nich może pełnić rolę matrycy w tworzeniu nowej komplementarnej nici poprzez specyficzne parowanie zasad.

PYTANIA OPISOWE:

Pyt. 1.

Ogólnie rzecz ujmując biotechnologia jest to świadczenie dóbr i usług z zastosowaniem metod biologicznych. Inaczej -biotech. Jest to integracja nauk przyrodniczych i inżynieryjnych w celu osiągnięcia zastosowań organizmów, komórek lub ich części oraz molekularnych analogów dla .pozyskania produktów i usług (definicja wg Europejskiej Federacji Biotechnologii). U podstaw biotechn. leży wiele dziedzin nauki i techniki, jednak szczególne miejsce zajmuje biologia i genetyka molekularna.

W nowoczesnej biotechnologii utożsamianej i zawężanej do inżynierii genetycznej, stosowane procedury polegają przede wszystkim na przenoszeniu lub modyfikacji określonych, zdefiniowanych genów pomiędzy rożnymi osobnikami, najczęściej pomiędzy rożnymi gatunkami za pomocą technik laboratoryjnych. W „klasycznej" hodowli również ma miejsce przenoszenie genów, np podczas dokonywanych krzyżówek; jednakże, nikt nie wie jakie geny czy zespoły genowe zostały przeniesione Ta „nowoczesna" biotechnologia ściśle wiąże się z „klasyczną", a zatem taki podział jest sztuczny, wręcz niewłaściwy. Można natomiast wyróżnić inżynierię genetyczną, czyli zespół metod stosowanych dla modyfikacji genomu, a zatem w celu zmian właściwości organizmu.

Rys historyczny

Okres I- Przedpasteurowski (korzenie biotechnologii)- od zarania ludzkości do poł. XIX w; Spontaniczne procesy fermentacyjne, m.in. produkcja wina, piwa, octu, napojów mlecznych, chleba. Osiągnięciem tego okresu było wprowadzenie techniki inokulacji - szczepienia kolejnych cykli fermentacji częścią produktu, finalnego łub ubocznego.

Okres II przejściowy (początki nowych technologii mikrobiologicznych) IIpoł. XIX w., do lat 40- tych XXw. —Naukowe poznanie procesów mikrobiologicznych i wdrażanie nowych rozwiązań technicznych; Opracowano i wdrożono do produkcji na skalę przemysłową etanol, butanol, metanol, aceton, kwasy organiczne Zastosowanie do oczyszczania ścieków techniki złoża zraszanego, na którym rozwijała się mikroflora degradująca składniki wód ściekowych. Opracowano pierwsze metody biotransformacji mikrobiologicznej: sorbitolu do sorbozy, glukozy do kwasu glukonowego.

Okres III- Era nowoczesnej biotechnologii (po II wojnie światowej): Podokres 1 (1940-1970) Złota era antybioz.- Opracowano nowe biotechnologie: ok. 100 antybiotyków w tym penicylina, kilkunastu enzymów, kilku aminokwasów, dwóch witamin, nukleotydów, dekstranu, biotransformacje steroidów, szczepionki wirusowe, białka paszowego pochodzenia drobnoustrojowego (SCP). Wprowadzenie pierwszych technologii z zastosowaniem biokatalizatorów immobilizowanych. Podokres 2 (od 1970) Współczesna biotechnologia - Narodziła się koncepcja manipulacji genami poza komórką. Nastąpił rozwój metod rekombinaqi DNA in vitro i in vivo. Opracowano szereg nowych biotechnologii, m.in. mikrobiologiczną produkcję insuliny, hormonów wzrostu, białek odpornościowych, wytwarzania przeciwciał monoklonalnych, powszechne stosowanie metod klonowania i rozmnażania roślin in vitro

Pyt.2.

Etapy w opracowaniu procesu biotechnologicznego

1.Pozyskiwanie drobnoustrojów (skrining) Jest to poszukiwanie odpowiednich drobnoustrojów prowadzących określony bioproces lub wytwarzających określony bioprodukt. (izolacja, ocena przydatności, warunki przechowywania), charakterystyka materiału biologicznego (szybkość wzrostu, szybkość przyswajania substratu, szybkość tworzenia produktu, szybkość oddychania)

2.Dobór warunków hodowli. Stworzenie warunków zapewniających szczepom max. produkcję (min. Skład podłoża czyli źródła C,N,P i inne prekursory, pH, . potencjał 02, potencjał redox, , pH, dalej; temp., natlenienie, sposób prowadzenia, hodowli.). Na tym etapie ustala się również metody wyodrębniania i oczyszczania bioproduktów oraz warunki tych operacji: temp., ciśnienie, lepkość, piana, pobór mocy.

3.Doskonalenie cech produkcyjnych szczepów. Zwiększenie potencjału genetycznego szczepu

w zakresie biosyntezy / biotransformacji określonego substratu w ilości przewyższającej potrzeby własne drobnoustrojów od kilkuset (aa) do kilkudziesięciu tysięcy razy (witaminy). Stosuje się następujące metody manipulacji genami: mutacje genetyczne, fuzję protoplastów, rekombinację DNA in vitro Ponadto dzięki inż. genetycznej można konstruować szczepy, które syntezują bioprodukty, których drobnoustroje macierzyste nigdy nie produkowały.

4.Optymalizacja bioprocesu. Jest ostatnim etapem laboratoryjnym. Jest konsekwencją maksymalnego wykorzystania potencjału metabolicznego drobnoustrojów. Ustala się skład podłoża, warunki jego mieszania i napowietrzania, kinetyki bioprocesu.

5.powiększenie skali- Przeniesienie opracowanej w laboratorium technologii do skali półtechnicznej (fementatory o poj. 20-1000L)

6.Uruchomienie produkcji przemysłowej

Pyt.3.

Pyt.4.

Podstawy biochemiczne procesów technologii rekombinacyjnego DNA

a) schemat przepływu informacji genetycznej w komórce

b) monomery budujące DNA

DNA jest liniowym polimerem czterech monomerów (zasad A,G,T,C). Każdy nukleotyd składa się reszty cukrowej deoksyrybozy i grupy fosforanowej i z zasady heterocyklicznej. Zasady heterocykliczne- adenina, guanina, cytozyna, tymina.

c) istotne cechy budowy dwuniciowej helisy DNA

- Dwa helikalne łańcuchy polinukleotydowe oplatają wspólną oś Łańcuchy te biegną w przeciwnych kierunkach

- Zasady purynowe i pirymidynowe znajdują sie wewnątrz, a fosforany i reszty deoksyrybozy — na zewnątrz helisy. Płaszczyzny zasad są prostopadle do osi helisy a płaszczyzny pierścieni cukrów są ułożone prostopadle względem zasad.

- Średnica helisy wynosi 2.0 ma Odległość miedzy sąsiednimi zasadami mierzona wzdłuż osi helisy wynosi 0.34nm. Zasady te są skręcone względem siebie pod katem 36°. Na całkowity skręt helisy przypada po JO nukleotydów w każdym łańcuchu, co daje okres powtarzalności równy 3.4 nm

- Dwa łańcuchy łączą się ze sobą wiązaniami wodorowymi między zasadami tworzącymi komplementarne pary. Adenina zawsze tworzy parę z tyminą a guanina z cytozyną. Dodatkowo strukturę stabilizują oddziaływania asocjacji warstwowej pomiędzy zasadą.

- Kolejność zasad w łańcuchu polinukleotydowym nie jest w żaden sposób ograniczona. ŚCISŁE OKREŚLONA SEKWENCJA ZASAD NIESIE INFORMACJE.

d) proces replikacji u bakterii

Polimeraza DNA I z E. coli wymaga prekursorów w postaci wszystkich czterech 5'-trifosforanów deoksynukleozydów (dNTP) jonów Mg²*, matrycy DNA oraz odcinka starterowego zawierającego wolną grupę 3'-OH. Synteza DNA przebiega w kierunku 5`-»3'. Polimeraza DNA I wykazuje też aktywność egzonukleazy3'-»5' {sprawdzającą wierność replikacji) oraz aktywność egzonukleazy 5'-»3\ Polimerazy DNA II i III z E. coli nit wykazują egzonukleotycznej aktywności 5`-»3. Replikacja rozpoczyna się w pojedynczym miejscu inicjacji (ori).przebiega dwukierunkowo i jest semikonserwarywna. Każde oczko replikacyjne zawiera dwa widełki replikacyjne.Synteza QNA przebiega w kierunku 5'->3' na każdej nici wyjściowego DNA. Na jednej z nici, o orientacji 3*->5^ł (nic wiodąca) nowo powstający DNA jest syntetyzowany w sposób ciągły. Na drugiej nici, o orientacji 5'-»3' {nić opóźniona) synteza DNA przebiega w sposób nieciągły (skokowy) z tworzeniem się najpierw serii krótkich fragmentów Okazaki, które następnie ulegają połączeniu. Do zainicjowania replikacji konieczny jest starter RNA („primer"), syntetyzowany przez polimerazę RNA zwaną prymazą. Starter jest wydłużany przez polimerazę DNA III, która syntetyzuje DNA na obu matrycowych niciach. DNA, to jest na nici wiodącej i opóźnionej. Polimeraza. DNA I degraduje starter i zastępuje go odcinkiem DNA, a następnie ligaza DNA łączy, końce DNA. Dwuniciową helisę DNA rozplatają helikazy, a białka łączące się z jednoniciowym DNA (SSB) stabilizują jednoniciowy odcinek DNA podlegający replikacji. Potrzebna też jest topoizomeraza DNA I, umożliwiająca rozplatanie DNA bez konieczności rotacyjnych ruchów całego chromosomu. Topoizomeraza DNA II oddziela od siebie potomne cząsteczki kolistego DNA powstałe w wyniku replikacji.

e) kod genetyczny i cechy kodu genetycznego

Kod genetyczny- jest zestawem reguł, która określają sposób, w jaki sekwencja nukleotydów w mRNA zostaje przetłumaczona na sekwencję aminokwasów w polipeptydzie. Sekwencja nukleotydów jest czytana trojkami. Kodony UAG, UOA, UAA nie specyfikują żadnego aminokwasu i są określane jako kodony terninacyjne, czyli kodony „stop". Kodon AUG koduje metioninę i działa również jako kodon inicjujący, czyli start

Cechy kodu:

1) zdegenerowany- większość aminokwasów jest kodowana przez więcej niż jeden kodon;

2) Uniwersalny- jest taki sam w większości organizmów,;

3) Nienakładający się

4) Jednoznaczny

5) Bezprzecinkowy

6) Jest to kod trójkowy

Pyt.5.

Idea rekombinacji i klonowania DNA

Rekombinacja DNA:

a) izolowanie genów poprzez cięcie genomu danego organizmu enzymami restrykcyjnymi

b) otrzymywanie cDNA; wykorzystanie procesu odwrotnej transkrypcji

c) chemiczno- enzymatyczna syntez genów

Klonowanie DNA:

a) odpowiednie przygotowanie wektorowego DNA

b) przygotowanie interesującego nas genu, który chcemy powielić(sklonować) lub uzyskać jego ekspresję

c) ligacja czyli połączenie genomowego i wektorowego DNA aby uzyskać zrekombinowaną cząsteczkę DNA

d) transformacja komórki biorcy, analiza rekombinatów

Pyt. 6.

Podstawowe narzędzia stosowane w inżynierii genetycznej to enzymy:

a) endonukleazy przecinające DNA; w tym endonukleazy restrykcyjne = enzymy restrykcyjne

b) polimerazy DNA:

c) odwrotna transkryptaza-synteza DNA na matrycy RNA

d) Ligaza-enzym łączący kowalencyjnie odcinki DNA (w strukturze dwuniciowych)

Pyt.7.

Co to są i jak działają enzymy restrykcyjne?

Enzymy restrykcyjne umożliwiają rozcinanie DNA w specyficznych miejscach. Hybrydyzacjia kwasów nukleinowych pozwala wykrywać specyficzne ich sekwencje. Określanie kolejności ułożenia nukleotydów w cząsteczce DNA nazywamy sekwencjonowaniem DNA, jego przeprowadzenie jest stosunkowo łatwe. Enzymy restrykcyjne (restryktazy) rozpoznają specyficzne sekwencje i rozcinają DNA pozostawiając w miejscu rozcięcia kohezyjne lub tępe jego końce. Końce fragmentów restrykcyjnych DNA można połączyć za pomocą ligazy, uzyskując w ten sposób nowe zrekombinowane cząsteczki DNA.

Pyt.8.

Metody pozyskiwania DNA do zastosowań w technologii rekombinacyjnego DNA

Pyt. 9.

Wektory stosowane do klonowania DNA w bakteriach

a) wektory plazmidowe

- niektóre plazmidy występujące naturalnie w mikroorganizmach zostały przekształcone metodami inżynierii genetycznej w wektory pozwalajace na wprowadzenie obcego DNA do komórki biorcy

- po transformacji bakterii wektorem zawierającym obce fragmenty DNA można wyselekcjonować linie komórkowe czyli klony będące genetycznie czystymi kulturami wyprowadzonymi z pojedyńczej komórki.

b) wektory bakteriofagowe- wektory typu insercyjnego i zastępczego

- w genomie bakteriofaga λ geny są zorganizowane w funkcjonalne waże grupy

- region środkowy bakteriofaga może być usunięty z genomu bakteriofaga nie powodując zmiany w jego zdolności do litycznego rozwoju.

Z DNA faga λ można usunąć odcinek stanowiący ok. 30% genomu pozostawiając jego „lewe” i „prawe” ramiona zawierające niezbędne geny w cyklu litycznym. Podobnie jak w wektorach plazmidowych, do wektorów bakteriofagowych faga λ również wstawiono odpowiednie polilinkiery, geny marlierowe, silne promotory itp.

c) kosmidy- sa sztucznie stworzonymi wektorami, powstałymi z połaczenia plazmidu i sekwencji

cos faga- (sekwencja odpowiedzialna za cyrkulizacje DNA). Kosmidy z wprowadzonym

insertem sa pakowane w kapsydy i sa wykorzystywane do zaka_enia komórek bakteryjnych.

W przeciwienstwie do faga _, kosmidy nie niszcza zainfekowanych komórek. Najprostszym

wektorem kosmidowym jest typowy plazmid z miejscem ori i markerem selekcyjnym,

zawierajacym dodatkowo sekwencje cos i odpowiednie miejsce restrykcyjne do klonowania.

Po trawieniu (cieciu) wektora odpowiednim enzymem restrykcyjnym i zligowaniu3

z docelowym insertem, kosmid pakowany jest do czasteczek fagowych. Po wprowadzeniu

wiekszego insertu do kosmidu wydłu_a sie czas jego replikacji oraz zmniejsza sie liczba jego

kopii. Kosmidy umo_liwiaja klonowanie długich fragmentów DNA (ok. 45 kpz).

Pyt.10.

Pyt.11.

Biblioteka genomowa człowieka w fagu λ

a) preparat zawierający wiele cząsteczek genomowego DNA najpierw poddaje się mechanicznej fragmentacji lub częściowemi cięciu enzymami restrykcyjnymi

b) tą statystyczną mieszaninę wzajemnie nakładających się fragmentów rozdziela się elektroforetycznie i izoluje z niej fragmenty o długości 15000 par zasad. Do końców fragmentów przyłącza się syntetyczne linkiery, tworzy się kohezyjne końce i wprowadza się do wektora fagowego

c) zrekombinowanymi fagami infekuje się komórkami E-coli. Uzyskany w wyniku lizat zawiera fragmenty DNA znajdujące się w na tyle dużej populacji zrekombinowanych fagów, że fragmenty w sumie stanowią prawie kompletny genom

d) taka kolekcja fagów stanowi bibliotekę genomową

Pyt. 12

Wielokrotne powielanie DNA przez zastosowanie reakcji łańcuchowej polimeryzacji (PCR)

PCR to metoda enzymatycznego powielania kwasów nukleinowych ze współczynnikiem wzmocnienia ok. 1000000. Cykl powielania polega na:

a) denaturacji cieplnej powielanego DNA

b) renaturacji- syntetyczne startery tworzą hybrydy z jednoniciowymi cząsteczkami DNA

c) elongacji czyli dodaniu polimerazy i substratowych trifosforanów 2'- deoksynukleozydów (dNT) i przeprowadzeniu reakcji polimeryzacji

Jeden cykl w zależności od potrzeby może trwać od kilkudziesięciu sekund do kilku minut. Specyficzność procesu powielania wynika z oddziaływania między polimerami, które tworzą wiązania wodorowe z łańcuchami jednoniciowego DNA. Niespecyficzność wiązania można eliminować stosując primery o odpowiedniej długości i stężeniu, dostatecznie wysoką temperaturą renaturyzacji.

Pyt.13.

Pyt.14.

Nowoczesna biotechnologia w przemyśle spożywczym

a) główne cele dla których modyfikuje się rośliny

- odporność na herbicydy

- odporność na choroby przenoszone przez wirusy, grzyby, bakterie

- odporność na szkodniki

- poprawa cech jakościowych i użytkowych

- uodpornienie na działanie niekorzystnych warunków środowiska

b) przykład procedury genetycznego modyfikowania roślin

- wybrany fragment DNA zostaje połączony z DNA organizmu dawcy. Wykonuje się to przy pomocy enzymów restrykcyjnych

- wycięty fragment DNA zostaje połączony z DNA wektora, który posiada umiejętność przenoszenia kodu genetycznego do komórek innych organizmów. Wektorami mogą być organizmy lub plazmidy posiadające zdolność przenoszenia własnych genów oraz genów do nich dołączonych

- fragment DNA przenoszony przez wektor „wbudowany” w DNA biorcy

c) argumenty za i przeciw

ZA:

- rośliny transgeniczne są zazwyczaj bardziej odporne na niekorzystne warunki środowiska. Poprawiają się też ich cechy użytkowe- smak, wygląd, skład chemiczny

- względy ekonomiczne- rośliny GMO odznaczają się lepszym smakiem, ładniej wyglądają, są bardziej dorodne

- możliwość zmniejszonego użycia chemicznych środków ochrony roślin, może prowadzić do obniżenia kosztów produkcji, a tym samym do obniżenia cen

- odporność na trudne warunki wzrostu oraz potencjalnie wyższe plony, mogą pomóc w eliminacji problemu głodu w krajach Trzeciego Świata

PRZECIW:

- szkodliwość upraw transgenicznych względem środowiska naturalnego oraz konsumentów

- nie jest dokładnie znany wpływ GMO na środowisko- szczególnie rośliny zawierające geny odporności na herbicydy, co może prowadzić do powstania superchwastu odpornego na działanie środków ochrony roślin

- zbyt duże ujednolicenie upraw

- bezpośrednia szkodliwość produktów GMO względem organizmu ludzkiego

Pyt.15.

Produkcja insuliny technologią zrekombinowanego DNA

a) ekstrakcja z ludzkich trzustek

b) chemiczna synteza via indywidualne aminokwasy

c) transformacja świńskiej insuliny semi-synteza

d) produkcja metodami inżynierii genetycznej SEMI-SYNTEZA

e) ekstrakcja insuliny świńskiej z zamrożonych tkanek

f) oczyszczanie insuliny świńskiej

g) biochemiczna transformacja (insulina świńska ma alaninę w B30 zamiast treoniny). Transformację wykonuje się wobec trypsyny przy dużym nadmiarze treoniny (najlepsze rezultaty daje ester t-butylowy)

h) oczyszczanie ludzkiej insuliny aby ograniczyć do minimum zawartość proinsuliny

i) ostateczna foemulacja insuliny

---