BIOTECHNOLOGIA

Biotechnologia to zintegrowane zastosowanie wiedzy i techniki w dziedzinach biochemii mikrobiologii i nauk inżynierskich w celu technologicznego wykorzystania drobnoustrojów, kultur tkankowych lub ich części oraz molekularnych analogów dla pozyskania produktów i usług. Biotechnologia to świadczenie dóbr i sług z zastosowaniem metod biologicznych. Biotechnologia jest dyscypliną nauk technicznych wykorzystującą procesy biologiczne na skalę przemysłowa. Biotechnologia jest interdyscyplinarną dziedziną łączącą w sobie nauki techniczne i przyrodnicze, obejmującą badanie, wytwarzanie i wykorzystanie DNA/RNA, białek / enzymów, drobnoustrojów, kultur komórkowych w procesach modyfikacji genetycznej, biosyntezy, biotransformacji, bioutylizacji a także wyodrębnianie i modyfikacje tak otrzymywanych bioproduktów.

Wykład 2

W związku z pojawieniem się metod pozwalających na ingerowanie w naturalny materiał genetyczny drobnoustrojów przyjęto powszechnie podział biotechnologii na
-tradycyjną -przebiegającą z użyciem drobnoustrojów i komórek organizmów wyższych nie zawierających obcego materiału genetycznego

-nowoczesną gdzie stosowane są szczepy drobnoustrojów lub inne linie komórkowe skonstruowane metodami inżynierii genetycznej

Podział biotechnologii

biała biotechnologia - biotechnologia przemysłowa wykorzystująca systemy biologiczne w produkcji przemysłowej i ochronie środowiska

czerwona biotechnologia - wykorzystywana w ochronie zdrowia
zielona biotechnologia - związana z rolnictwem obejmująca stosowanie metod inżynierii genetycznej w celu doskonalenia produkcji roślinnej i zwierzęcej.

Biotechnologia czerwona wykorzystuje systemy biologiczne w produkcji przemysłowej. Opiera się na biokatalizie i bioprocesach. Surowce odnawialne są tu przekształcane z wykorzystaniem pleśni, drożdży, bakterii, enzymów w cenne chemikalia, leki, biopolimery, czynniki energetyczne, funkcjonalne, składniki żywności.

Biotechnologia czerwona wykorzystywana w ochronie zdrowia i medycynie. Jest ważnym i dynamicznie rozwijającym się obszarem biotechnologii, w szczególności w zakresie produkcji nowych biofarmaceutyków, rozwoju diagnostyki genetycznej, geoterapii i

ksenotransplantologii.

Biotechnologia zielona związana jest z rolnictwem, obejmuje zastosowanie metod inżynierii genetycznej w celu doskonalenia produkcji roślinnej i zwierzęcej. Ważnym obszarem jest wprowadzanie transgenicznych roślin do produkcji szczepionek doustnych i rekombinowanych białek a także wykorzystanie tychże roślin jako surowców odnawialnych w biorafineriach.

HISTORIA BIOTECHNOLOGII

I okres przedpasteurowski (do połowy XIXw) procesy fermentacyjne produkcja piwa, wina, octu, chleba, napojów mlecznych. Wprowadzenie procesu inokulacji - szczepienia kolejnych cykli fermentacji częścią produktu finalnego lub ubocznego.

II okres przejściowy (początki nowych technologii mikrobiologicznych. Naukowe poznanie procesów mikrobiologicznych. W 1857r L Pateur wyjaśnił rolę drobnoustrojów w procesie fermentacji. Zastosowanie złoża zraszanego w oczyszczaniu ścieków. Nowe metody biotransformacji mikrobiologicznej orbitolu.

III okres Era nowoczesnej technologii, podokres : ZŁOTA ERA ANTYBIOTYKÓW nowe biotechnologie ok 100 antybiotyków w tym penicylina, a także wielu enzymów, aminokwasów, witamin nukleotydów SCP (białko paszowe), katalizatory immobilizowane, podokres: WSPÓŁCZESNA BIOTECHNOLOGIA manipulacja genami poza komórką. Nastąpił rozwój metod rekombinacji DNA in vitro, in vivo. Mikrobiologiczna

produkcja insuliny, hormonu wzrostu, białek odpornościowych metody klonowania i rozmnażania roślin in vivo.

Technologia mikrobiologiczna - obejmuje procesy uwarunkowane obecnością drobnoustrojów. Pozwalają na wykorzystanie mikroorganizmów do wywołania różnorodnych przemian chemicznych oraz do nadprodukcji wielorakich metabolitów w

ilościach znacznie przewyższających ich potrzeby. Wiąże się to z możliwością ukierunkowanej transformacji genotypu drobnoustrojów oraz sterowania ich metabolizmem poprzez dobór odpowiednich warunków środowiskowych. Obszar ten obejmuje procesy mikrobiologicznej biosyntezy i biotransformacji Fermentacja - z punktu widzenia biochemii drobnoustrojów pojęcie to wiąże się z metabolizmem beztlenowym w którym energotwórcze procesy utleniania substratu węglowego przebiegające z wydzieleniem CO₂ nie wymagają tlenu cząsteczkowego jako końcowego akceptora elektronów.

W praktyce biotechnologicznej fermentacja służy do określenia przemian chemicznych w wyniku aktywności metabolicznej drobnoustrojów, czyli obejmuje zarówno fermentacje beztlenowe (np fermentacja alkoholowa) jak również tlenowe (fermentacja octowa).

Technologia enzymów - obejmuje wszystkie zagadnienia związane z zastosowaniem enzymów w procesach biotechnologicznych. Dział biotechnologii intensywnie rozwijający

się od II poł XX wieku. Szczególnie intensywnie rozwijają się techniki unieruchamiania enzymów (immobilizacja) lub całych komórek. Dzięki immobilizacji zakres zastosowań enzymów uległ znacznemu rozszerzeniu. Powstał nowy dział biotechnologii - technologia biokatalizatorów unieruchomionych.

Inżynieria genetyczna - metody biologii molekularnej umożliwiające manipulacje genetyczne poza komórką czyli rekombinowanie DNA in vitro

Inżynieria białka - zajmuje się problemami związanymi z przystosowaniem enzymów do wykonywania odpowiednich procesów technologicznych - syntezy, transformacji lub degradacji związków chemicznych, nie zawsze będących substancjami naturalnymi.

Inżynieria cytogenetyczna - inżynieria genetyczna na poziomie komórkowym zajmująca się głównie opracowaniem technik fuzji komórek (np fuzja komórek nowotworowych szpiczaka i immunizowanych komórek pozwoliła na otrzymanie komórek mieszkańców (hybrydoma) które zachowując cechy nowotworu szybko rosną i wydajnie produkują przeciwciała.

Zalety biotechnologii gwarantujące jej dynamiczny rozwój

- duża różnorodność bioprocesów

- łagodne warunki przebiegu bioprocesów

- procesy przyjazne dla środowiska

- bezpieczeństwo procesów biotechnologicznych

- wykorzystanie surowców,które są odpadami dla innych technologii

- przetwarzanie surowców odnawialnych

Tworzenie nowych biotechnologii

Program opracowania proces obejmujący:

-fazę wstępną czyli analizę zapotrzebowania społecznego na określone produkty

-fazę badawczą mającą na celu opracowanie technologii kończącą się rachunkiem ekonomicznym i podjęciem decyzji inwestycyjnych

-fazę wdrożenia czyli projektowanie oaz budowę linii technologicznej i uruchomienie produkcji.

Procesem technologicznym przyjęto nazywać zapis wszystkich czynności występujących po sobie w określonej kolejności, powodujących przemiany fizyczne, chemiczne, biochemiczne surowców oraz materiałów i prowadzących do otrzymania pożądanego produktu. Opracowanie procesu technologicznego wymaga wyszczególnienia procesów i operacji jednostkowych, określenia substratów i materiałów pomocniczych, sposobu oczyszczania i konfekcjonowania produktu jak również planu zagospodarowania bądź utylizacji odpadów

Proces jednostkowy - elementarny etap procesu produkcyjnego stosowany w przemyśle chemicznym i pokrewnych. Rozróżnia się procesy podstawowe o charakterze fizykochemicznym lub chemicznym , które dzieli się z uwagi na typ reakcji lub rodzaj faz biorących udział lub warunków przebiegu procesu

Operacje jednostkowe - są to te czynności jednostkowe w których wyniku zachodzą przemiany fizyczne.

Procesy biotechnologiczne mają zróżnicowany charakter, mogą być prowadzone wieloma sposobami i wymagają różnych warunków technicznych Jest uzależnione od

-rodzaju surowca

-produktu wytwarzanego

-rodzaju biologiczno-chemicznej natury czynnika katalitycznego

Większość bioprocesów wymaga użycia

-czystych kultur drobnoustrojów określonych linii komórkowych lub konkretnych enzymów

-zapewnienia warunków aseptycznych

-prowadzenia procesów w specjalnych bioreaktorach umożliwiających kontrolę warunków procesu. Prowadzone są także procesy nie wymagające warunków aseptycznych i przebiegające z udziałem mieszanej populacji organizmów (np biologiczne oczyszczanie ścieków). Mogą być również prowadzone w innych warunkach np mikrobiologiczne ługowanie metali.

Podział procesów biotechnologicznych:

-biosynteza

-biotransformacja

-biohydroliza

-fermentacja

-bioługowanie

-biodegradacja

PROGRAM OPRACOWANIA PROCESU BIOTECHNOLOGICZNEGO

-przygotowanie technologii na przykładzie procesu biosyntezy mikrobiologicznej

-proces obejmuje zarówno prace badawcze jak i prace wdrożeniowe Ogólnie można wyróżnić 6 etapów opracowania procesu

1. pozyskiwanie odpowiednich drobnoustrojów (scrining)

2. wstępne ustalenie warunków hodowli

3. doskonalenie cech produkcyjnych szczepów

4. optymalizacja procesu

5. powiększenie skali procesu

6. uruchomienie produkcji

Ad.1. Pozyskiwanie drobnoustrojów - poszukiwanie odpowiednich drobnoustrojów prowadzących określony bioproces lub wytwarzających określony bioprodukt (izolacja, ocena przydatności, warunki przechowywania) charakterystyka materiału biologicznego (szybkość wzrostu, szybkość przyswajania substratu, szybkość tworzenia produktu, szybkość oddychania)

Znajomość: mikrobiologia, biochemia, biologia kmórki

Ad.2. dobór warunków hodowli - stworzenie warunków zapewniających szczepom maksymalną produkcję (skład podłoża, prekursory, pH, potencjał O₂, potencjał redox, następnie temperaturę, natlenienie sposób prowadzenia hodowli: powierzchniowy czy wgłębny, okresowy czy ciągły. Na tym etapie ustala się również metody wyodrębniania i oczyszczania bioproduktów, oraz warunki tych operacji: ciśnienie, temperatura, lepkość, pobór mocy.

Znajomość: mikrobiologia biochemia, biologia komórki, inżynieria

Ad.3. doskonalenie cech produkcyjnych szczepu - zwiększenie potencjału genetycznego szczepu w zakresie biosyntezy i biotransformacji, określonego substratu w ilości przewyższającej potrzeby własne drobnoustrojów od kilkuset do kilkudziesięciu tysięcy razy. Stosuje się następujące metody manipulacji genami: mutacje genetyczne, fuzję protoplastów, rekombinację DNA in vitro. Ponadto dzięki inżynierii genetycznej możnakonstruować szczepy, które syntezują bioprodukty, których drobnoustroje macierzyste nigdy nie produkowały. Znajomość: genetyka, biologia molekularna

Ad.4. Optymalizacja bioprocesu - ostatni etap laboratoryjny. Jest konsekwencją maksymalnego wykorzystania potencjału metabolicznego drobnoustrojów. Ustala się skład podłoża, warunki jego mieszania i napowietrzania, kinetyki bioprocesu i in. Często ten etap i następujące po nim są opracowywane przy użyciu techniki komputerowej. Znajomość: mikrobiologia, biochemia,biologia komórki, chemia,inżynieria oraz informatyka.

Ad.5. powiększenie skali - przeniesienie opracowanej w laboratorium technologii do skali półtechnicznej (fermentatory o poj. 20-1000L).

Znajomość inżynieria, informatyka, matematyka, fizyka, ekonomia, ekologia

Ad.6. uruchomienie produkcji przemysłowej - przeniesienie wyników doświadczeń laboratoryjnych, półtechnicznych do warunków przemysłowych (fermentatory o poj.

10tys-200tys L)

Znajomość: inżynieria, informatyka, matematyka, fizyka, ekonomia, ekologia.

Problemy bezpieczeństwa w biotechnologii.

Do głównych należą

-analiza patogenności stosowanych drobnoustrojów

-ocena zagrożeń wynikających z otrzymania i stosowania organizmów konstruowanych metodami inżynierii genetycznej.

Wśród drobnoustrojów stosowanych w biotechnologii przeważają gatunki całkowicie bezpieczne dla człowieka (np. bakterie stosowane przy produkcji przetworów mlecznych).Zastosowanie drobnoustrojów chorobotwórczych (przy produkcji szczepionek) wymaga przestrzegania ścisłych przepisów i tworzone są bardzo precyzyjne mechanizmy kontroli warunków technicznych bezpiecznego namnażania drobnoustrojów patogennych. Zagadnieniem budzącym niepokój jest potencjalne niebezpieczeństwo związane z rozwojem inżynierii genetycznej i biotechnologii z użyciem organizmów modyfikowanych genetycznie. Dotyczy to szczególnie szczepów konstruowanych dla rolnictwa jak również wykorzystywanych do utylizacji ścieków.

Proces biotechnologiczny

Uproszczony schemat technologii zrekombinowanego DNA

CHARAKTERYSTYKA DROBNOUSTROJÓW PRZEMYSŁOWYCH

Termin drobnoustroje nie jest jednoznaczny. Do grupy mikroorganizmów zalicza się bakterie, liczne grzyby a także niektóre glony i pierwotniaki.

Wirusy to organizmy z pogranicza życia i materii nieożywionej.

Drobnoustroje pełnią ważną rolę w procesach biotechnologicznych dzięki takim cechom jak

-duża szybkość przemiany materii

-wielka różnorodność prowadzonych reakcji chemicznych

-znaczna zmienność fizjologiczna, co pozwala na sterowanie przebiegiem procesów

mikrobiologicznych przez dobór warunków środowiskowych

-łatwość dokonywania zmian genetycznych

Rodzaje produktów wytwarzanych przez drobnoustroje

-całe komórki (drożdże, preparaty paszowe, szczepionki preparaty mikroflory)

-produkty końcowe przemian metabolicznych (etanol, kwas mlekowy, aceton, butanol)

-produkty spożywcze (jogurt, sery, piwo, wino)

-produkty syntez podstawowych

a)małocząsteczkowe (aminokwasy, kwas cytrynowy, nukleotydy, witaminy)

b)wielkocząsteczkowe (enzymy, lipidy, polisacharydy)

-produkty syntez peryferyjnych (antybiotyki, alkaloidy dekstran)

-produkty syntez i biotransformacji z udziałem prekursorów (kwas 6-aminopenicylanowy,

kwas akrylowy)

-produkty obce dla drobnoustrojów ze zrekombinowanym DNA (insulina, interferon, hormon wzrostu, inne białka).

Przydatność drobnoustrojów w biotechnologii ocenia się wg następujących cech użytkowych

-wydajność i szybkość tworzenia produktu

-czystość produktu

-szybkość wzrostu

-niepatogenność i brak produktów toksycznych

-stabilność genetyczna i fenotypowa

-fagooporność

-wymagania pokarmowe (ilościowe i jakościowe)

-tolerancja na zmienne stężenia składników podłoża

-wielkość zapotrzebowania na tlen oraz tolerancja na zmiany warunków natlenienia

-wymagania w zakresie temperatury, odczynu i innych parametrów procesów, oraz wrażliwość na ich zmiany

-łatwość wydzielenia produktu

-inne cechy technologiczne

a)korzystne np. zdolność do flokulacji (proces tworzenia agregatów)

b)niekorzystne np. lepkość pienistość hodowli

Sposoby odżywiania drobnoustrojów

Organizmy żywe dzielimy

Podział organizmów żywych:

*Podział ze względu na związki będące ostatecznym akceptorem elektronów.

*Bilans materiałowy metabolizmu glukozy z tlenowej i beztlenowej hodowli drożdży

*Wymagania pokarmowe drobnoustrojów

*Drobnoustroje wykorzystywane w procesach biotechnologicznych charakteryzują się niewielkimi wymaganiami pokarmowymi. Większość z nich to organizmy prototroficzne

(zdolne do syntezy wszystkich składników komórki z pojedynczego źródła węgla np. glukozy) Niektóre szczepy są naturalnymi lub sztucznie indukowanymi auksotrofami, wymagającymi dodatku witamin aminokwasów lub innych związków organicznych,

specyficznych dla danego procesu.

Podłoża do hodowli

-minimalne zawierające jedynie związki niezbędne dla wzrostu drobnoustrojów (nie sprzyjają jednak szybkiemu namnażaniu drobnoustrojów, gromadzeniu dużej biomasy czy też wydajnej biosytnezy dlatego są raczej stosowane w procesach badawczych a rzadziej w procesach biotechnologicznych).

-podłoża wzbogacone zawierają takie składniki jak namok kukurydziany, melasę i serwatkę. Podłoża kompleksowe mają pewne wady, trudny do określenia skład jakościowy i ilościowy co jest wynikiem zmienności i nieodtwarzalności składu chemicznego użytych surowców kompleksowych pochodzących z różnych źródeł.

Surowce kompleksowe

Namok kukurydziany zawiera 45-55% suchej masy głównie związki azotowe w tym azotu białkowego 8% Jest źródłem aminokwasów i peptydów poza tym zawiera cukry(2-10%sm) kwas mlekowy(10-30%sm) związki fosforowe(3-5%sm) jest także źródłem witamin i soli mineralnych.

Melasa - produkt uboczny przy produkcji cukru z buraków cukrowych: gęsty lepki ciemnobrunatny syrop zawierający ok 50% cukru stosowana jet jako dodatek do pasz w przemyśle fermentacyjnym i spożywczym (produkcja spirytusu drożdży kw. Cytrynowego, kwasu mlekowego, gliceryny. Związki azotowe stanowią ponad 12% sm. Zawiera również sole mineralne i witaminy.

Serwatka - produkt uboczny uzyskiwany podczas przerobu mleka na ser i twaróg.

Wyróżnia się serwatkę podpuszczkową oraz kwasową. Zawierają głównie wodę a także

tłuszcz białko i laktozę. Serwatka zawiera k 50% laktozy zawartej w mleku jak również białko witaminy związki mineralne Białka często są wydzielane i oczyszczone sprzedawane jako białko serwetkowe.

Proces pozyskiwania i ulepszania szczepów przemysłowych

Nowe biotechnologie wymagają użycia szczepów drobnoustrojów produkcyjnych o ściśle zaprogramowanych właściwościach metabolicznych. Można wyselekcjonować ze środowiska naturalnego szczep dziki wyróżniający się przydatnością do określonego procesu biotechnologicznego jednakże opracowanie wydajnego i ekonomicznie opłacanego procesu wymaga najczęściej przeprowadzenia doskonalenia cech użytkowych szczepu dzikiego. Pozyskiwanie szczepów zasady racjonalnego skriningu Pojęcie skriningu drobnoustrojów lub produktów ich metabolizmu definiowane jest jako kompleksowe postępowanie obejmujące zespół selektywnych zabiegów mających na celu

-wykrycie i izolację spośród dużej liczby możliwych tylko tych drobnoustrojów które są celem badań

-wstępną ocenę przydatności do danego procesu

Ulepszanie szczepów

Klasycznym sposobem wywoływania zmian jest dokonywanie trwałych zmian genetycznych poprzez proces mutagenizacji i selekcji wykorzystywanych mutantów. Taka

mutagenizacja genetyczna może zwiększyć wydajność szczepu.

Mutacje

Mutacją nazywamy zmianę w strukturze DNA na skutek jego uszkodzenia. Mutacje dziedziczy się w następnych pokoleniach. Rodzaje mutacji

-mutacje spontaniczne (naturalne) zachodzą samoczynnie z częstością mniejszą niż 10-5

Są poważnym problemem w procesach biotechnologicznych ponieważ mogą doprowadzić do zdominowania hodowli przez niekorzystne mutanty i doprowadzić do utraty przez szczep produkcyjny cech ważnych biotechnologicznie

-mutacje indukowane zachodzą pod wpływem czynników fizycznych (promieniowanie UV najczęściej w zakresie tzw dalekiego UV czyli 254-265nm, promieniowanie jonizujące,prędkie neutrony oraz czynników chemicznych (kwas azotawy, związki alkilujące, iperyt, nitrozoaminy, barwniki akrydynowe

przykłady związków alkilujących:

-etyenoimina

-metylosulfonian metylu

-metylosulfonian etylu

-dimetylonitrozoamina

W strukturze DNA wywołane przez czynniki mutagenne zmiany mogą dotyczyć obszaru od kilku do kilku milionów par zasad. Klasyczna mutagenizacja stanowi zatem typowe postępowanie losowe: opiera się na pracochłonnej metodzie prób i błędów.

Schemat mutacji punktowej:

Przepływ informacji genetycznej w komórce:

DNA

Pary zasad: T=A i G≡C

Informacja genetyczna to sekwencja zasad heterocyklicznych.

Struktura DNA ilustruje podstawową zależność wspólną dla wszystkich biocząsteczek

-ścisłą zależność między strukturą a funkcją

Właściwością DNA które pozwalają temu biopolimerowi funkcjonować jako wydajny i stabilny nośnik informacji jest struktura

-DNA jest liniowym polimerem czterech monomerów (zasad A,G,T,C)

-każdy nukleotyd składa się reszty cukrowej deoksyrybozy i grupy fosforanowej i z zasady heterocyklicznej

-rdzeń polimerowy stanowią powtarzające się reszty fosforanowo-cukrowe (rdzeń fosforanowo-cukrowy)

Do każdej reszty cukrowej dołączona jest zasada heterocykliczna. Kolejność zasad oznacza sekwencję. Sekwencja stanowi informację genetyczną(instrukcję do syntezy białek kierujących syntezą innych cząsteczek, tworzących całe komórki i całe organizmy.

Zasady heterocykliczne

Dwie pojedyncze nici DNA łączą się tworząc dwuniciową helisę.

Helisa DNA złożona jest z dwóch oplatających się nici ułożonych tak że cukrowo-fosforowy rdzeń leży na zewnątrz a zasady heterocykliczne są we wnętrzu helisy.

Najważniejszą cechą tej struktury jest specyficzność parowania się zasad poprzez wiązania wodorowe A=T G≡C Wiązania wodorowe sa znacznie słabsze od kowalencyjnych. Wiązania tego typu są jednak bardzo istotne z punktu widzenia układów

biologicznych i ich aktywności.

Zaproponowana przez Watsona i Cricka struktura dwuniciowej helisy DNA ma dwie cechy o kluczowym znaczeniu w pełnieniu przez DNA funkcji nośnika informacji genetycznej

1. struktura ta jest kompatybilna z każdą sekwencją zasad (pary zasad mają zasadniczo taki sam kształt)

2. sekwencja wzdłuż jednej nici determinuje całkowicie sekwencję drugiej nici (jako wynik komplementarnośi).

A zatem jeśli dwuniciowa helisa ulega rozdzieleniu na dwie pojedyncze nici to każda z nich może pełnić rolę matrycy w tworzeniu nowej komplementarnej nici poprzez specyficzne parowanie zasad.

RNA pośredniczy w przepływie informacji genetycznej.

Organizmy których geny zbudowane są z DNA muszą najpierw zamienić informację genetyczną z DNA na RNA by była ona dostępna i funkcjonalna.

Struktura RNA jest podobna do DNA. Jest polimerem zbudowanym z czterech monomerów- nukleotydów A, G, C, U. Podstawową różnicą między RNA i DNA jest to, że resztą cukrową jest tu ryboza a zamiast tyminy występuje uracyl.

RNA występuje w komórce na ogół w postaci pojedynczej nici jakkolwiek niektóre segmenty są dwuniciowe.

Funkcje jakie pełni RNA:

1. pośredniczy w przepływie informacji od DNA do białek (transkrypcja: mRNA).

2. RNA pełni rolę cząsteczek adaptorowych (tRNA) które przetwarzają informacje zawartą w sekwencji kwasu nukleinowego mRNA w określone białko (udział tRNA w procesie translacji)

3. RNA jest ważnym składnikiem maszynerii komórkowej, która prowadzi proces translacji.

rRNA jest składnikiem budującym rybosomy.

Unikatowa pozycja roli RNA jako pośrednika pomiędzy „magazynem” informacji genetycznej DNA a funkcjonalnym produktem tej informacji - białkiem jak i możliwość

łączenia właściwości nośnika informacji genetycznej i katalitycznych właściwości (rybosomy) wskazuje że RNA odgrywa istotną rolę w ewolucji (hipoteza świata RNA). Wszystkie białka zaczynają się od metioniny Cząsteczki transferowego RNA pośredniczą w odczytaniu informacji z DNA i syntezie białka. Zawiera antykodon - trójka zasad komplementarna do kodonu do końca 3' dołączony jest odpowiedni aminokwas.

Enzymy - narzędzia inżynierii genetycznej

-endonukleazy przecinające DNA w tym endonukleazy restrykcyjne

-polimerazy DNA

-odwrotna transkryptaza - synteza DNA na matrycy mRNA (synteza cDNAkomplementarny DNA)

-ligaza enzym łączący kowalencyjnie odcinki DNA (w strukturach dwuniciowych)

UPROSZCZONY SCHEMAT TECHNOLOGII ZREKOMBINOWANEGO DNA

Enzymy restrykcyjne - rozpoznają sekwencje DNA i przecinają ją w danym miejscu są to tzw. nożyczki molekularne. Występują w bakteriach a wytworzone zostały do obrony przed bakteriofagami. Każdy enzym restrykcyjny połączony jest z innymi enzymami zabezpieczającymi, dzięki czemu nie rozcinają swojego DNA. Sekwencje typu palindromowego - czyli takie które są symetryczne. Mogą tu wystąpić trzy sposoby rozcinania. Istnieje możliwość pocięcia DNA w sposób odwracalny, możemy łączyć je cząsteczką która służy nam do transformacji danego organizmu czy innego DNA.

Enzymy są narzędziami inżynierii genetycznej

-polimerazy DNA- potrafią zsyntetyzować komplementarną nić DNA wzorując się matrycą (może powielić DNA)

-odwrotna transkryptaza- synteza DNA na matrycy mRNA (synteza cDNAkomplementarny DNA). Enzym ten potrafi zsyntetyzować na matrycy RNA drugą nić która jest już nicią DNA. Następuje rozplecenie i do nici DNA syntezowana druga nić DNA.

cDNA-geny wytworzone sztucznie na bazie mRNA za pomocą odwrotnej transkryptazy.

-ligaza- enzym który w momencie gdy występują nici połączone lepkimi końcami łączy je na stałe Enzym łączy odcinki kowalencyjnie

PCR- polimerowa reakcja łańcuchowa. DNA ogrzewamy do 100°C, następuje rozplecenie nici.

Starter (primery) są to krótkie (najczęściej ok. 20 nukleotydów) fragmenty DNA komplementarne do matrycy. Do reakcji wprowadza się matrycowy DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydów, startery (primery), oraz termostabilną polimerazę DNA. W wyższej temperaturze (zwykle około 95°C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa. DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (pomiędzy 45-70°C), przyłączają się one do matrycy. Podwyższenie temperatury do około 72°C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy. Twórcą metody PCR jest Kary Mullis. Metoda ta zaczęła być szeroko stosowana gdy polimerazę Klerova można było zastąpić termostabilną polimerazą z bakterii Thermus aquaticus.

Polimeraza Taq. Optymalna temperatura polimeryzacji dla tego enzymu to 70-79°C. Enzym zachowuje zdolność polimeryzacji po wielokrotnym ogrzewaniu do temp 95°C (taka temperatura jest wymagana do przeprowadzenia denaturacji dwuniciowego DNA). Dzięki tym właściwościom polimerazy Taq proces powielania DNA udało się zautomatyzować. Proces ten polega na umieszczeniu próbki powielanego DNA w objętości nie większej niż 0,1ml. Proces składa się z trzech etapów:

1. denaturacja podwójnej helisy DNA zachodzi w temperaturze 95°C przez 15-30sek

2. renaturacja (wiązanie hybrydyzacja starterów) Mieszaninę szybko się chłodzi do określonej temperatury, w której startery mogą tworzyć dwuniciowe struktury hybrydowe na końcach każdej nici DNA

3. elongacja (właściwy etap syntezy DNA na matrycy DNA). Temperaturę mieszaniny podwyższa się zwykle do 72°C i utrzymuje przez zadany okres czasu aby umożliwić

polimerazie skopiowanie każdej jednoniciowej matrycy

Metoda A (rys.)

Metoda cDNA

Metoda chemiczno enzymatyczna

Naturalne metody wymiany informacji genetycznej u drobnoustrojów.

Rekombinacja genetyczna definiowana jako proces w wyniku którego powstają nowe kombinacje genów, stanowi podstawę bardziej racjonalnego aniżeli mutagenizacja,

sposobu otrzymywania szczepów przydatnych do celów biotechnologicznych. Proces ten wykorzystywany jest w dwojaki sposób:

1) poprzez hybrydyzację czyli krzyżowanie szczepów

2) konstruowanie sztucznych kombinacji genów in vitro i uzyskiwanie dokładnie zaprogramowanych informacji genetycznej w komórkach odpowiednio dobranego

gospodarza (inżynieria gospodarcza technologia zrekombinowanego DNA)

Podstawy hybrydyzacji

naturalna hybrydyzacja wiąże się z przekazywaniem informacji genetycznej z komórki dawcy do biorcy w wyniku przedłużonego kontaktu obu komórek i polega na wymianie odcinków DNA (rekombinacji) między chromosomami lub genoforami dawcy i biorcy w procesie określanym jako crossing over. W wyniku zachodzącej następnie separacji czyli rozdzielenia materiału genetycznego w komórkach potomnych można otrzymać hybrydy (rekombinaty) o zmienionym genotypie i nowych właściwościach metabolicznych. Jedną z koncepcji wykorzystania procesu hybrydyzacji drobnoustrojów do ich ulepszania było pozyskiwanie nowego wartościowego materiału genetycznego ze środowisk naturalnych i użycie do wzbogacania genotypów obecnie stosowanych upośledzonych genetycznie szczepów produkcyjnych. Zasadniczym działaniem stało się krzyżowanie szczepów, pochodzących z różnych linii mutacyjno-selekcyjnych zwłaszcza wywodzących się od różnych przodków. Hybrydyzacja umożliwia poprawę wielu ważnych cech stanowiących obok wydajności produktu o wartości technologicznej szczepów przemysłowych. Dotyczy to między innymi przyswajanie ważnych substratów zmiany wymagań pokarmowych, tolerancji na zmianę stężenia różnych składników podłoża i warunki natlenienia, tworzenia produktów ubocznych, szybkości wzrostu oraz takich cech technologicznych jak pienienie się i właściwości filtracyjne hodowli.

Procesy paraseksualne u bakterii

Koniugacja - połączenie się dwóch komórek bakteryjnych po którym następuje

jednostronne przekazanie dużych fragmentów DNA z komórki dawcy (męskiej do komórki biorcy (żeńskiej ).

Transdukcja - przekazanie materiału genetycznego przez wirusy (bakteriofagi przenoszą fragmenty DNA z jednej komórki do drugiej).

Transformacja - proces wnikania do komórki biorcy fragmentów DNA bez kontaktu z komórką dawcy i zastąpienie przez ten fragment DNA odpowiedniego fragmentu genomu biorcy.

Koniugacja- połączenie się dwóch komórek bakteryjnych po którym następuje jednostronne przekazanie dużych fragmentów DNA z komórki dawcy do komórki biorcy

przy czym dawcą jest komórka męska Hfr zaś biorcą komórka żeńska F Proces ten składa się z następujących etapów :

-łączenie się komórek o różnych cechach poprzez wytworzenie mostka

cytoplazmatycznego. Dla zajścia tego etapu konieczne jest występowanie w ścianie komórkowej komórki biorcy tzw substancji komplementarnych, które pozwalają zaakceptować partnera

-przejście fragmentu DNA zawierającego cechę a+ z komórki dawcy do komórki biorcy

-włączenie cechy a+ do DNA komórki biorcy przez zastąpienie tą cechą odpowiedniego fragmentu genomu biorcy

-powstanie rekombinatów genetycznych posiadających nową cechę

Mechanizm wnikania i namnażania bakteriofaga

A -adsorpcja wirusa na powierzchni komórki bakteryjnej

B -wnikanie materiału genetycznego wirusa do wnętrza komórki bakteryjnej

C,D -otaczanie cząsteczek wirusa w zakażonej komórce

E -liza komórki bakteryjnej i wydalenie z niej fagów

Proces lizogeniczny- materiał genetyczny wbudowuje się w genom bakterii i pozostaje w uśpieniu.

Mechanizm transdukcji

-w momencie zetknięcia się wrażliwej komórki bakterii z fagiem następuje adsorpcja wirusa na jej powierzchni w sposób nieodwracalny (z udziałem czułki i płytki faga)

-skurcz osłonki ogonka fagowego i przeniknięcie ogonka w głąb ściany a następnie błony komórkowej bakterii

-wprowadzenie DNA do wnętrza bakterii kanalikiem rdzenia ogonka. Po przeniknięciu fag przestawia metabolizm bakterii na produkcję własnego DNA i własnego białka. W rezultacie powstają w komórce bakteryjnej dojrzałe fagi przy czym niektóre z nich

posiadają fragmenty DNA bakterii zamiast własnego DNA

-liza (rozpad) komórek bakteryjnych

-bakteriofag zawierający DNA fagowo-bakteryjne, zakażając kolejne komórki bakteryjne będzie wnosił do nich ten kompleks DNA.

Etapy transformacji

-po wyizolowaniu fragmentów DNA (materiał genetyczny może być pobrany z komórek

martwych gdyż nie traci on swych zdolności do przechowywania cech genetycznych innych organizmów) z komórek dawcy następuje ich sorpcja na powierzchni komórek biorcy

-transport zaadsorbowanej cząsteczki DNA przez ścianę komórkową i błonę cytoplazmatyczną komórek biorcy

-włączenie DNA dawcy do genomu biorcy

-procesy zewnętrznego wyrażania nowej cechy

WEKTORY

Wektory czyli przenośniki genów

Wprowadzenie pożądanego genu do wybranego mikroorganizmów wymaga włączenia go do większej cząstki DNA którą transformuje się komórkę biorcy. W tym celu stosuje się wektory

-plazmidowe

-fagowe

-kosmidowe (hybrydy składające się DNA plazmidowego i sekwencji cos faga lambda)

Struktura wektora musi być tak zaprogramowana aby poza wprowadzeniem pożądanego genu do komórki zapewnić jego

-powielenie

-stabilność

-dobrą ekspresję klonowanej cechy

-łatwą detekcję jego obecności

-ochronę zrekombinowanego DNA i produktu finalnego(białka) przed enzymatyczną degradacją

-ewentualnie transport białka poza komórkę

PLAZMID

Plazmidy są dwuniciowymi kolistymi cząsteczkami DNA naturalnie występującymi w niektórych bakteriach. Ich wielkość to od kilku do kilkudziesięciu tysięcy par nukleotydów. Mogą występować w komórce bakteryjnej w liczbie od kilku do kilkunastu kopii. Plazmidy posiadają własne regulatorowe sekwencje nukleotydów ori(origin of replication) kontrolujące ich automatyczną replikację, która dzięki temu może zachodzić niezależnie i z większą częstotliwością niż powielanie DNA genoforowego (czyli replikują niezależnie od głównego chromosomu bakteryjnego). Charakterystyka wektorów plazmidowych. Pojemność wektorów plazmidowych ograniczona jest sposobem wprowadzania zrekombinowanych cząstek DNA do komórek gospodarza. Przy klasycznej transformacji wielkość wstawki nie powinna być większa niż ok 10kb (10 tys par zasad). Warto zwrócić jeszcze uwagę na ilość kopii wektora w komórce Istnieją wektory

niskokopijne i wysokokopijne co uzależnione jest od rodzaju ori.

Wprowadzenie plazmidów do komórek biorcy. Wektory plazmidowe wprowadzane są do komórek bakterii przy wykorzystaniu zjawiska transformacji. W przypadku stosowanej najczęściej bakterii E.Coli wymaga to zwiększenia przepuszczalności błon komórkowych czyli ukompetentnienia. W tym celu wystawia się komórki na wysoką koncentrację pewnych dwuwartościowych kationów w typowej procedurze komórki traktuje się roztworem CaCl2. Zazwyczaj jedna komórka na milion zostaje stransformowana i jedna cząsteczka na tysiąc zrekombinowanych plazmidów transformuje komórkę bakteryjną. Markerem selekcyjnym jest gen oporności na antybiotyk

Komórki które nie przyjęły plazmidu umierają, natomiast te które go przyjęły żyją i mnożą się dalej. W plazmidach zawarte mogą być geny oporności na antybiotyki i inne substancje toksyczne, co jest dla bakterii bardzo korzystne ponieważ umożliwia przetrwanie w niesprzyjających warunkach. Plazmidowe geny odporności na antybiotyki stanowią ważną cechę selekcyjną wykorzystywaną podczas klonowania i namnażania szczepów ze zrekombinowanym DNA

Metoda selekcji wykorzystująca obecność w plazmidzie 2 genów oporności na dwa różne antybiotyki:

Selekcja na podstawie barwy

Bardziej przemyślanym sposobem rozpoznania obecności rekombinowanych plazmidów, możliwym do przeprowadzenia na jednej szalce jest ich przeszukiwanie na podstawie białej lub niebieskiej barwy koloni komórek. Metoda również oparta jest na inercyjnej inaktywacji genu i wykorzystuje powstawanie niebieskiego barwnika jako indykatora. System selekcji opiera się na tzw teście alfa-komplementacji.

Stosowane są plazmidy serii pUC. Polilinkery w tego typu wektorach umiejscowione są w obrębie genu kodującego N-końcowy peptyd β-galaktozydazy (białka enzymatycznego który degraduje laktozę na glukozę i galaktozę).

Transformowane są bakterie które mają mutacje akurat we fragmencie genu kodującym tą część enzymu.

W takim szczepie aktywna β-galaktozydaza powstaje dopiero po dostarczeniu prawidłowej części genu niesionej przez plazmidach

Kolonie zmutowanych komórek E.coli które pobrały plazmid pUC i zostały wyhodowane na specjalnej pożywce zawierającej chromoforowy substrat X-pal (5-bromo-4-chloro-3-

indolino-β-galaktozyd) mają barwę niebieską. Wynika to z obecności w tych komórkach aktywnej β-galaktozydazy.

Włączenie w obręb polilinkera pUC dodatkowego fragmentu DNA (klonowanego genu) powoduje inaktywację genu loc Z i zablokowanie syntezy N-końcowej części

β-galaktozydazy . Po transformacji komórek E.coli takim plazmidem nie jest produkowana β-galaktozydaza i hodowane kolonie mają białe zabarwienie. Tak więc można łatwo wyróżnić komórki zawierające wektory zrekombinowane.

WEKTORY FAGOWE

Klonowanie w wektorze pochodnym faga.Można wstawić 20-25 tys par zasad. Genom bakteriofaga λ jest dwuniciową cząsteczką DNA o znanej sekwencji 49502 par zasad mieszczącą ok 40 genów.

W dojrzałych cząsteczkach wirusowych DNA ma formę liniowej cząsteczki zakończonej 12 nukleotydowymi jednoniciowymi „lepkimi

końcami”nazywanymi sekwencjami cos.

Z DNA faga lambda można usunąć odcinek stanowiący około 30% genomu pozostawiając jego lewe i prawe ramie zawierające niezbędne geny w cyklu życiowym. Ponieważ do główki białkowej faga nie jest pakowany DNA o długości różniącej się o więcej niż 75-105% długości DNA faga dzikiego. Można to zjawisko wykorzystywać do selekcji zrekombinowanych cząsteczek DNA, gdyż tylko takie będą infekcyjne.

Podobnie jak w wektorach plazmidowych do wektorów bakteriofagowych faga λ również wstawiono odpowiednie polilinkery,geny markerowe, silne promotory itp.

Czynności pakowania DNA do główek faga można wykonać in vitro.

Dzięki 12 nukleotydowym, wzajemnie komplementarnym jednoniciowym fragmentom DNA na końcach cząsteczki DNA faga tzw sekwencjom cos- możliwe jest przybranie przez DNA faga w komórce bakteryjnej formy kulistej oraz zapakowanie go w białkową główkę. Maksymalna wielkość DNA który może być sklonowany w wektorach stosowanych w transformacji komórek prokariotycznych.

Typ wektora	Dł.klonówDNA
PLAZMID	10 (kb)
BAKTERIOFAG	25 (kb)
KOSMID	45 (kb)
YAC	500 (kb)

YAC-sztuczne chromosomy drożdżowe.

WEKTORY EKSPRESYJNE

wektory te zawierają odpowiednie sekwencje promotorowe i regulatorowe, które w komórce umożliwiają skuteczną transkrypcje przyległego do nich wprowadzonego do wektora odcinka DNA. Wektory te kierują syntezą dużych ilości odpowiedniego mRNA które w komórkach ulega translacji skonstruowano różnego rodzaju wektory ekspresyjne przeznaczone do stosowania w różnych komórkach gospodarzy: bakterii drożdżach w komórkach owadzich i ssaczych Wektor ekspresyjny powinien posiadać:

-silny promotor warunkujący dobrą ekspresję klonowanego genu

-sekwencję liderowa wiązania mRNA z rybosomem

-kodon inicjacji syntezy białka naturalnego dla gospodarza w celu wytworzenia białka hybrydowego co chroni je przed hydrolizą przez enzymy proteolityczne gospodarza

-sekwencje sygnałowa dla białka które mogą być transportowane poza komórkę.

Wektory ekspresyjne tego typu wykorzystano do:

-celów naukowych by otrzymać liczne białka ważne dla biologii komórki w ilościach wystarczających do przeprowadzenia szczegółowych badań

-celów przemysłowych szczególnie do produkcji dużych ilości białek ważnych w medycynie np. Produkcja czynnika VIII krzepliwości krwi, insuliny, hormonu wzrostu lub białek wirusowych -kapsydów służących jako szczepionki

INSULINA

Insulina ludzka (HI-human insulin)

Produkowany w trzustce polipeptyd zbudowany z 51 aminokwasów. Mimo że jej masa cząsteczkowa wynosi około 6000Da to często zaliczana jest do białek z uwagi na łatwość z jaką z cynkiem lub innymi jonami krystalizuje w postaci dimerów lub heksamerów. Insulina wykazuje szerokie spektrum aktywności biologicznej:

-obniża poziom glukozy we krwi

-wzmaga biosyntezę aminokwasów, białek i kwasów tłuszczowych

-wpływa na wnikanie glukozy do tkanek tłuszczowych i mięśni.

Niski poziom insuliny powoduje że niewykorzystana glukoza gromadzi się w organizmie i powoduje szereg dolegliwości (cukrzyca). Nieleczona cukrzyca powoduje uszkodzenie

naczyń krwionośnych, serca tkanki nerwowej i nerek. W zaawansowanych postaciach cukrzycy jedynym lekiem ratujący życie jest egzogenna insulina przyjmowana podskórnie lub dożylnie. Insulina została odkryta przez Bantinga w 1921r (nagroda Nobla w 1923r) a jej struktura pierwszorzędowa została ustalona przez Sangera w 1955 (nagroda Nobla w 1958r). Insulina ludzka zbudowana jest z dwóch łańcuchów:

-łańcuch A zawiera 21 reszt aminokwasów

-łańcuch b zawiera 30 reszt aminokwasowych

Oba łańcuchy połączone są dwoma mostkami siarczkowymi a w łańcuchu A znajduje się jeszcze jeden mostek S-S.

Insulina zwierzęca - otrzymuje się z trzustek wieprzowych lub wołowych Insulina świńska różni się od ludzkiej tylko jednym aminokwasem - w miejscu treoniny w pozycji B30 występuje alanina. Insulina bydlęca ma również alaninę w pozycji B30a także alaninę w miejsce treoniny w pozycji A8 oraz walinę w miejscu izoleucyny w pozycji A10.

Insulina krystaliczna - insulina oczyszczona przez krystalizację najczęściej kompleksu z cynkiem (zawiera zanieczyszczenia - proinsulinę deaminoinsulinę i inne produkty rozkładu.

Insulina jednoskładnikowa - insulina dobrze oczyszczona za pomocą sączenia molekularnego, chromatografii cieczowej lub ekstrakcji przeciwprądowej (nazwa pochodzi

od faktu iż na chromatografii HPLC jest tylko jeden pik).

Do niedawna jedynym źródłem insuliny były trzustki zwierząt rzeźnych głównie trzustki wieprzowe i wołowe. Ze względu na pracochłonną technologię jej wyodrębniania

występował stały deficyt tego leku

Z 1kg trzustek wołowych otrzymuje się 2000 IU insuliny (1mg insuliny odpowiada 24 IU) przy czym jedna dawka lecznicza wynosi kilkaset IU.

Mimo że cząsteczki insuliny zwierzęcej różnią się aminokwasami w niektórych pozycjach to prawie wszystkie wykazują podobną aktywność biologiczną i mogą spełniać aktywną funkcję w organizmie ludzkim. Czasami zdarza się iż organizm ludzki traktuje je jak obce białka- antygen, co przy długotrwałym stosowaniu prowadzi do szeregu reakcji alergicznych. Z tego powodu zostały opracowane chemiczno-biologiczne metody transformacji insuliny zwierzęcej w ludzką ale ze względu na koszty nie znalazły większego zastosowania. Dopiero rozwój inżynierii genetycznej stworzył realne podstawy produkcji. Synteza insuliny w organizmie ludzkim rys.

Otrzymywanie insuliny metodami cDNA.

Otrzymywanie ludzkiej insuliny z wykorzystaniem zrekombinowanych bakterii E.coli.

Generalnie problem rozwiązano na dwa sposoby:

-otrzymano metodami inżynierii genetycznej oddzielnie oba łańcuchy A i B po czym połączono je na drodze chemicznej

-wytworzenie proinsuliny która była enzymatycznie przekształcona w insulinę (sposób podobny do procesu zachodzącego naturalnie w trzustce).

W procesie technologicznym opartym na łączeniu łańcuchów A i B

-opracowano procedury wprowadzania genów do komórek bakterii, warunki hodowli zrekombinowanych organizmów oraz opracowano warunki izolacji i oczyszczania peptydów A i B

-opracowano warunki łączenia peptydów A i B w natywną cząsteczkę insuliny (tworzenie dwusiarczkowych mostków w ściśle określonych pozycjach). Produkcja ludzkiej insuliny w komórkach E.coli.

Był to niezwykle trudny etap w opracowaniu technologii. W wyniku niekontrolowanego połączenia może powstać bardzo wiele izomerów w tym 3 monomery A monomer B, 57 dimerów A2 2 dimery B2 12 dimerów AB (w tym jeden będący HI) a ponadto ponad 3000 trimerów i niezliczona liczba wyższych izomerów. W praktyce w wyniku spontanicznego tworzenia mostków disiarczkowych otrzymano preparat o aktywności 1-2% naturalnej insuliny. Taka wydajność była nie do zaakceptowania w przemysłowym procesie tworzenia leku. Opracowana procedura polegała na wcześniejszym przeprowadzeniu grup tiolowych w

tioestry siarczynowe, następnie reakcji łączenia łańcuchów A i B w stosunku molowym 2:1 przeprowadzonej w obecności chiralnego utleniacza zwanego odczynnikiem Clelada-DTTditiotretiol o wzorze HSCH2CHOHCHOHCH2SH. Takie warunki prowadziły do otrzymania

prawidłowej cząsteczki insuliny z wydajnością 50% liczoną w stosunku do łańcucha B

Metody otrzymywania ludzkiej insuliny

-ekstrakcja z ludzkich trzustek

-chemiczna synteza via indywidualne aminokwasy

-transformacja świńskiej insuliny semi-synteza

-produkcja metodami inżynierii genetycznej

SEMI-SYNTEZA

-ekstrakcja insuliny świńskiej z zamrożonych tkanek

-oczyszczanie insuliny świńskiej

-biochemiczna transformacja (insulina świńska ma alaninę w B30 zamiast treoniny). Transformację wykonuje się wobec trypsyny przy dużym nadmiarze treoniny (najlepsze rezultaty daje ester t-butylowy)

-oczyszczanie ludzkiej insuliny aby ograniczyć do minimum zawartość proinsuliny

-ostateczna foemulacja insuliny

Produkcja Novo Nordisk. Insulina jednołańcuchowa SCI (single-chain insulin).

Alternatywnym sposobem biosyntezy ludzkiej insuliny z wykorzystaniem

rekombinowanego DNA jest technologia oparta o wytwarzane przez drożdże peptydy des (B30) tzw insuliny jednołańcuchowym i jej transpeptydacja do insuliny ludzkiej. Do komórek drożdży wprowadza się gen prekursora insuliny czyli peptydu des(B30). Taki peptyd był już wcześniej znany ponieważ powstał z insuliny świńskiej pod wpływem

trypsyny. Wykorzystano zatem wcześniejsze doświadczenia dotyczące jego

transpeptydacji w obecności estru treoniny. Najtrudniejszym etapem tego procesu jest oczyszczanie produktu od zanieczyszczeń biologicznych a w szczególności od obcych białek.

Po dokonaniu poniżej wymienionych

procesów oczyszczania otrzymuje się insulinę o czystości powyżej 99,5%

Masa	Etap procesu	Wyd.
25500 kg	fermentacja	-
14300kg	Uzyskanie ciałek inkluzyjnych	90%
6250kg	Chemiczne konwersje (cięcie za pomocą CNBr, tworzenie mostków di siarczkowych) procesy oczyszczania	60%
3000kg	Enzymatyczne konwersje	90%
15kg	Końcowe oczyszczanie, jonowymienna chromatografia RPHPLC , filtracja żelowa, ultrawirowanie, krystalizacja	60%

Diagnostyka fenyloketonurii

Fenyloketonuria- choroba polegająca na zaburzeniu w przemianie aminokwasów aromatycznych związana z niedoborem hydrolazy fenyloalaninowej (PAH). Gen PAH występuje w jednej kopii i składa się z 13 egzonów (eksonów) o długości sumarycznej 2,3kpz i 12 intronów o długości 85kpz.

Fenyloketonuria to wynik zmiany jednego aminokwasu argininy na tryptofan jako wynik pojedynczej mutacji (->T w egzonie 12-tym).

Gen PAH ulega ekspresji w wątrobie dlatego nie można do wykrycia fenyloketonurii zastosować klasycznych metod diagnostyki prenatalnej. Test wykonuje się po urodzeniu.

Terapia zachowawcza (dieta uboga w aminokwasy aromatycze) wprowadzona zaraz po urodzeniu pozwala na uniknięcie nieodwracalnych uszkodzeń tkanki mózgowej wywołanej toksycznymi produktami niewłaściwego metabolizmu fenyloalaniny. W badaniach DNA członkowie rodzin obciążonych fenyloketonurią znaleziono polimorfizm restrykcyjny obszaru genu PAH dla ośmiu enzymów restrykcyjnych m.in. Msp I (użycie tego enzymu do analizy pozwala na postawienie diagnozy z 98,5%pewnością)

SZCEPIONKI.

---