Ćwiczenie III

Badanie aktywności promotora yy i jego represji przez produkty genów yefM oraz kompleksu białek yefM-yoeB, poprzez oznaczanie aktywności β-galaktozydazy w fuzji transkrypcyjnej

β-galaktozydaza jest enzymem biorącym udział w katabolizmie laktozy. Białko to jest kodowane przez gen lacZ znajdujący się w operonie laktozowym. Aktywność tego enzymu można badać, stosując sztuczny substrat, O-nitrofenylo- β-galaktozyd (ONPG). β-galaktozydaza katalizuje rozkład ONPG, a jednym z produktów reakcji jest nitrofenol mający żółte zabarwienie. Intensywność tego zabarwienia mierzy się spekrtrofotometrycznie.

Gen lacZ jest jednym z najczęściej stosowanych genów reporterowych służących do określania wydajności ekspresji innych genów lub badania aktywności różnych promotorów. W tym celu konstruuje się fuzje genowe lub operonowe (transkrypcyjne), w których gen lacZ jest przyłączony do innego genu przy zachowaniu zgodności ramki odczytu lub też znajduje się pod kontrolą badanego promotora. Aktywność β-galaktozydazy w komórce jest wprost proporcjonalna do ilości tego enzymu, a ilość ta jest wprost proporcjonalna do ilości i aktywności translacyjnej odpowiednich transkryptów RNA. Mierząc aktywność β-galaktozydazy w szczepach bakteryjnych zawierających odpowiednie fuzje można wnioskować o wydajności ekspresji badanego genu lub aktywności badanego promotora. Doświadczenia te należy oczywiście wykonywać w szczepach zawierających mutację w genie lacZ, tak by jedynie aktywne cząsteczki β-galaktozydazy mogły powstać tylko w oparciu o odpowiednią fuzję genową lub operonową. Fuzje te mogą być ulokowane na chromosomie bakteryjnym (fuzje jednokopijne) lub na plazmidzie (fuzje wielokopijne).

Aktywność β-galaktozydazy mierzy się po lizie komórek i oznacza w tzw. jednostkach Millera.

Materiały:

• szczepy E. coli: MG1655/pRS415/pBAD33/

MG1655/pRSyy/pBAD33/

MG1655/pRSyy/pBAD33YefM/

MG1655/pRSyy/pBAD33YoeB/

MG1655/pRSyy/pBAD33YefMYoeB/

• plazmid pRSyy jest pochodną plazmidu pRS415 i zawiera fuzję promotora yy z genem reporterowym lacZ; niesie oporność na ampicylinę.

• plazmidy pBAD33YefM, pBADYoeB oraz pBAD33YefMYoeB są pochodnymi plazmidu pBAD33 i niosą geny antytoksyny i kompleksu toksyna:antytoksyna pod kontrolą indukowalnego L-arabinozą promotora p_ara; niosą oporność na chloramfenikol.

• pożywka LB

• roztwory antybiotyków: ampicyliny, chloramfenikolu

• 20% roztwór L-arabinozy

• chloroform

• bufor Z (bufor fosforanowy z KCl, MgSO₄, SDS i β-merkaptoetanolem)

• substrat reakcji - roztwór ONPG (roztwór 0.4% O-nitrofenylo- β-galaktozydu w buforze fosforanowym)

• roztwór stopujący - 1M Na₂CO₃

Wykonanie:

1. Odmłodzić hodowle nocne (przygotowane przez prowadzącego) w 10 ml LB z antybiotykami (1:50) do OD₆₀₀=0.2 a następnie dodać L-arabinozę do stężenia 0.2% i inkubować z wytrząsaniem przez 1 godzinę

2. Próby pobrać po 1 godzinie od momentu dodania roztworu L-arabinozy i zmierzyć i zapisać wartość OD₆₀₀

3. Do dwóch probówek zawierających 100 μl chloroformu i 1,5 ml buforu Z dodać po 100 μl z pobranej próbki hodowli

4. Zawartość każdej z tych probówek wymieszać przez worteksowanie przez 15 sekund

5. Inkubować na stole przez 10 minut

6. Do każdej próbki dodać 400 μl roztworu ONPG i włączyć stoper

7. Inkubować na stole do momentu pojawienia się żółtej barwy roztworu

8. Dodać 1 ml 1M Na₂CO₃ i wyłączyć stoper. Zanotować dokładny czas, jaki upłynął od momentu dodania ONPG

9. Po skończeniu eksperymentu zmierzyć wartość OD₄₂₀ wszystkich prób

10. Obliczyć aktywność β-galaktozydazy wg wzoru:

aktywność β-gal = V_T x (OD₄₂₀/OD₆₀₀ x Δt x Vs) x 1000

gdzie:

V_T = objętość próbki (w ml)

Δt = czas (w min.) od momentu dodania ONPG do momentu dodania Na₂CO₃

V_S = objętość hodowli bakteryjnej w próbce = 0,1ml

Zagadnienia do samodzielnego przygotowania:

1. Teoria operonu na przykładzie operonu laktozowego, regulacja aktywności tego operonu

2. Fuzje genowe i operonowe: sposoby konstrukcji i zastosowanie w badaniu ekspresji genów

3. Geny reporterowe, przykłady, charakterystyka, wykorzystanie

4. Gen lacZ: charakterystyka produktu tego genu, oznaczanie aktywności β-galaktozydazy; podłoża, na których można testować aktywność β-galaktozydazy

Literatura:

1. Gajewski W. „Genetyka ogólna i molekularna”

2. Węgleński P. „Genetyka molekularna”

3. Kotełko K., Sedlaczek L., Lachowicz T.M. „Biologia bakterii”

4. Kunicki-Goldfinger W.J.H. „Życie bakterii”

5. Kur J. „Podstawy inżynierii genetycznej: teoria, ćwiczenia, testy”

Mapa plazmidu pRS415

Promotor pyy został wklonowany pomiędzy miejsca restrykcyjne EcoRI i BamHI, tak aby kontrolować ekspresję genu lacZ.

Plazmid posiada origin replikacji pMB1 i oporność na ampicylinę (amp).

Mapa plazmidu BAD33

Plazmid ten zawiera:

• Gen oporności na chloramfenikol - cat

• Origin replikacji - p15a

• Promotor p_ara indukowany L-arabinozą

• Polilinker

• Geny yefM i yefMyoeB zostały wklonowane między miejsca restrykcyjne PstI i HindIII