PCR - zasada działania i praktyczne zastosowanie

W 1983 roku narodziło się nowe narzędzie biologii molekularnej, które pozwoliło badać, klonować i sekwencjonować geny z pominięciem wektorów plazmidowych i fagowych i całej magii związanej z przenoszeniem kolonii bakteryjnych wykałaczką.

Kary Mullis otrzymał w 1993 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii za prace, w których 10 lat wcześniej wykazał, że używając prostych substratów i enzymu polimerazy DNA można w czasie kilku godzin uzyskać miliony kopii DNA o pożądanej sekwencji. W swojej pierwotnej wersji przeprowadzenie reakcji namnażania kopii DNA in vitro, zwanej często amplifikacją, wymagało dodania w każdym cyklu porcji enzymu - polimerazy z E. coli, który następnie ulegał zniszczeniu na etapie denaturacji DNA.

Niedogodność ta została pokonana dzięki zastosowaniu w 1987 roku polimerazy termostabilnej, pochodzącej z bakterii Thermophilus aquaticus żyjących w gorących źródłach wulkanicznych. Enzym ten jest wytrzymały na ogrzewanie nawet do 96°C, co jest niezbędne do roztopienia dwuniciowego DNA. Reakcję można zatem prowadzić bez otwierania probówki, stosując 30-40 cykli ogrzewania i chłodzenia. W łańcuchowej reakcji polimerazy (polymerase chain reaction - PCR) każda nowo kopiowana cząsteczka staje się matrycą dla dwóch następnych kopii, co decyduje o lawinowym tempie reakcji.

Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (z angielskiego Polymerase Chain Reaction), technika umożliwiająca amplifikację (namnażanie) fragmentów DNA in vitro przy użyciu polimerazy DNA.

PCR zrewolucjonizowała współczesną biologię molekularną, umożliwiając wyprodukowanie milionów kopii fragmentu DNA w zaledwie kilka godzin. Stosuje się ją w diagnostyce chorób dziedzicznych, ustalaniu ojcostwa, w kryminalistyce przy ustalaniu pochodzenia śladów krwi, do powielania DNA ze szczątków organizmów wymarłych, wykrywania wirusów we krwi, np. wirusa HIV.

Rysunek 1. Schemat budowy wirusa HIV: 1. nić RNA; 2. enzym odwrotna transkryptaza; 3. enzym integraza; 4. zewnętrzna otoczka wirusa utworzona: a. ze struktur lipidowych; b. z białka; 5. rdzeń zbudowany z białka; 6. otoczka rdzenia.

Amplifikacja pożądanego odcinka DNA spośród miliardów par zasad jest możliwa, ponieważ dobór odpowiedniej pary oligonukleotydów początkujących reakcję (czyli starterów) oraz odpowiedniej temperatury sprzyja ich dokładnemu dopasowaniu do matrycy DNA. Istnieje wiele reguł doboru starterów. Powinny się składać co najmniej z 18 nukleotydów, być komplementarne w stosunku do przeciwstawnych nici DNA, a odcinek DNA "oskrzydlony" parą starterów nie może być większy niż kilka tysięcy par nukleotydów. W praktyce po prostu jedne pary są dobre, inne nie działają. Liczba cząsteczek matrycy poddanej amplifikacji wynosi kilkaset do kilku tysięcy, co odpowiada ułamkom mikrograma genomowego DNA człowieka. Zastosowanie specjalnych procedur umożliwia amplifikowanie nawet pojedynczych cząsteczek DNA.

Do przeprowadzenia PCR potrzebne są:

1. substrat - matryca DNA (fragment DNA do skopiowania: wystarczy pojedyncza cząsteczka, może to być również fragment DNA nie oddzielony od genomu);

2. krótkie, jednoniciowe fragmenty DNA - oligonukleotydy, umożliwiające rozpoczęcie procesu replikacji (tzw. startery);

3. pozostałe substraty tej reakcji - nukleozydotrifosforany (ATP, GTP, CTP, TTP);

4. enzym katalizujący tę reakcję - polimeraza DNA.

Przebieg reakcji PCR charakteryzuje inkubacja w trzech temperaturach:

1. Reakcja rozpoczyna się denaturacją w 93-96°C, której zadaniem jest rozplecenie podwójnych nici DNA.

2. Po ochłodzeniu mieszaniny reakcyjnej do zazwyczaj empirycznie dobranej temperatury (42-68°C) następuje przyłączenie starterów do matrycy. Utworzenie takich krótkich odcinków dwuniciowych rozpoczyna proces replikacji - renaturacja - hybrydyzacja komplementarnych oligonukleotydów z rozplecionymi nićmi DNA.

3. W czasie inkubacji w temperaturze 72°C następuje wydłużanie nici (elongacja). Począwszy od końca 3' startera enzym „dokłada” kolejne, komplementarne w stosunku do matrycy nukleotydy w tempie około kilkudziesięciu na sekundę. Synteza przebiega jednocześnie na obu komplementarnych niciach matrycy. Po elongacji następuje ponownie podgrzanie mieszaniny do temperatury denaturacji i cykl może się rozpocząć od nowa - replikacja DNA - polimeraza DNA, przyłączając ATP, GTP, CTP, TTP, buduje komplementarne nici DNA.

Ze względu na jednoczesne kopiowanie dwóch nici matrycy, po każdym cyklu następuje podwojenie liczby amplifikowanych cząsteczek DNA (rysunek 2. poniżej)

Rysunek 2. - podwojenie liczby amplifikowanych cząsteczek DNA

Zwiększanie się liczby syntezowanych cząsteczek w postępie geometrycznym, w którym teoretycznie po każdym cyklu ich liczba ulega podwojeniu, jest analogiczne do procesu rozszczepienia uranu w bombie atomowej. Liczba kopii DNA po zakończeniu około 30 cykli przekracza kilka milionów i można je uwidocznić na żelu agarozowym zwykłą metodą barwienia (rysunek 3.). Ilość taka (0,2-2 ug) wystarcza do analiz metodą trawienia restrykcyjnego, klonowania czy też sekwencjonowania.

Rysunek 3. - Kopie DNA na żelu agarozowym

Bardzo korzystną właściwością reakcji PCR jest możliwość zastosowania kilku par starterów jednocześnie, co prowadzi do amplifikacji kilku odcinków DNA w jednej probówce. Amplifikacja równoczesna (multiplex) skraca czas wymagany do przebadania większych obszarów DNA, a przede wszystkim stanowi niezbędną dla techniki PCR kontrolę wewnętrzną (w technikach laboratoryjnych kontrolą wewnętrzną nazywamy sprawdzenie poprawności oznaczenia przez dodanie standardu do każdej z badanych próbek).

Interpretując wyniki uzyskane metodą PCR, należy pamiętać, że najczęstszą przyczyną braku amplifikacji nie jest nieobecność sekwencji matrycowej DNA, lecz po prostu hamowanie enzymu polimerazy przez zanieczyszczenia lub błąd techniczny. Amplifikację równoczesną wykorzystano na przykład w diagnostyce molekularnej dystrofii mięśniowej Duchenne'a.

Brak amplifikacji któregoś z fragmentów genu świadczy o jego nieobecności (delecji). Większość przypadków tej choroby jest spowodowana delecjami bardzo dużego genu, zbudowanego z około 2,5 miliona par zasad. Równoczesne badanie 10 lub więcej fragmentów tego genu techniką PCR (rysunek 4.) przyspiesza badanie i niekiedy pozwala uniknąć konieczności wykonania czasochłonnej hybrydyzacji Southern blot.

Rysunek 4. - Badanie fragmentów genu techniką PCR

PCR jest stosowana praktycznie w każdej dziedzinie biologii molekularnej. Może być narzędziem w poszukiwaniu mutacji i zmienności genetycznej populacji, pozwala z niewiarygodną czułością wykazać obecność śladowej liczby komórek nowotworowych we krwi, prątków gruźlicy w plwocinie czy wirusa brodawczaka w wymazie z szyjki macicy. PCR zastępuje techniki hybrydyzacyjne w selekcji klonów z bibliotek genowych, umożliwia szybkie poszukiwanie nowych genów i ich lokalizację na chromosomach.

Wariant techniki PCR, poprzedzonej przepisaniem mRNA do cDNA (odwrotną transkrypcją), pozwala na stwierdzenie i ilościową ocenę liczby transkryptów genu, i w ten sposób szacuje tempo odczytu genu, czyli jego ekspresję. Za pomocą reakcji PCR można w dowolnym odcinku sekwencji genu wprowadzać mutacje. Zwierzęta laboratoryjne, u których sztucznie wprowadzono zmiany genomu (zwierzęta transgeniczne), a także mutacje genów w takich wektorach klonowania, które pozwalają na ich ekspresję, są współczesnym narzędziem badania molekularnego podłoża chorób.

Odpowiednio dobrane parametry reakcji PCR mogą zapewnić tak swoisty jej przebieg, że obecność jednego niekomplementarnego nukleotydu na końcu 3' startera może ją skutecznie zahamować. Zaprojektowanie dwóch wersji starterów, komplementarnych w stosunku do dwóch alleli różniących się tylko jednym nukleotydem, umożliwia wykrywanie takich mutacji, które nie powodują zmiany miejsca trawienia restrykcyjnego (rysunek 5).

Rysunek 5. - dwie wersje starterów, komplementarnych w stosunku do dwóch alleli różniących się tylko jednym nukleotydem, umożliwia wykrywanie takich mutacji, które nie powodują zmiany miejsca trawienia restrykcyjnego

Pary starterów wrażliwych na mutację punktową pozwalają poprzez amplifikację (amplification refractory mutation system - ARMS) rozpoznać często występujące mutacje punktowe. System ARMS ma jednak w diagnostyce molekularnej znacznie potężniejszą konkurencję. Są to metody oparte na reakcji ligacji DNA, która wykazuje znacznie większą wrażliwość na zmiany sekwencji nukleotydowych, a ponadto do wykrycia jej produktów można użyć sprzętu dostępnego w wielu laboratoriach klinicznych.

Efektywne zespolenie dwóch nici DNA wymaga, by znajdowały się one w idealnym ustawieniu obok siebie, unieruchomione poprzez połączenie ze wspólną komplementarną matrycą. Jeśli takie warunki są spełnione, to ligacja powoduje powstanie hybrydy, której jedną z nici jest matryca, a drugą nić powstała przez zespolenie dwóch dokładnie dopasowanych fragmentów komplementarnych w stosunku do matrycy. Naturalną funkcją ligaz jest naprawa pęknięć jednej z nici DNA - zjawiska częstego podczas rozplatania cząsteczki DNA w czasie transkrypcji i replikacji. Zastosowanie ligazy do wykrywania mutacji opiera się na wymaganej przez enzym dokładności dopasowania fragmentów DNA, jak przy pęknięciu jednej z jego nici.

Ligaza używana jest także w eksperymentach z klonowaniem DNA do połączenia fragmentów DNA powstałych po trawieniu enzymem restrykcyjnym (restryktazą). Restryktazy często powodują takie przecięcie cząsteczki DNA, że jedna z nici powstałych fragmentów jest dłuższa o kilka nukleotydów (tzw. lepkie końce). Ułatwia to ponowne zestawienie fragmentów restrykcyjnych i ich ligację. Stosowana w laboratoriach ligaza jest kodowana w naturze przez bakteriofagi T4 i potrafi połączyć w specjalnych warunkach również dwie cząsteczki DNA, których obie nici zostały równo obcięte (tzw. tępe końce).

Diagnostyka wrodzonego niedoboru antytrypsyny, jednej z częstych przyczyn rozedmy płuc i marskości wątroby, opiera się na wykryciu wariantu (allelu) genu alfa1-antytrypsyny (alfa-AT) o nazwie Pi Z. Zamiana jednego nukleotydu (guaniny na adeninę - G1024A) nie zmienia żadnego miejsca restrykcyjnego allelu Z. W celu jej wykrycia amplifikuje się fragment genu zawierający miejsce mutacji. Matrycą do reakcji ligacji jest jedna z nici amplifikowanej, a następnie denaturowanej cząsteczki DNA. W reakcji tej uczestniczą ponadto dwa oligonukleotydy komplementarne do matrycy. Jeden jest chemicznie związany z podłożem plastykowej płytki testowej, drugi znajduje się w roztworze reakcyjnym i zawiera dodatkową modyfikację w postaci reszty biotynylowej na końcu 5' (rysunek 6.).

Rysunek 6. - Reakcja ligacji, której matrycą jest jedna z nici amplifikowanej, a następnie denaturowanej cząsteczki DNA.

W przypadku zgodności sekwencji znakowanego oligonukleotydu z badaną matrycą (produktem amplifikacji) następuje ligacja i związanie reszty biotynylowej za pośrednictwem hybrydy DNA z podłożem płytki. System ten nazywany jest w skrócie badaniem ligacji oligonukleotydów (oligonucleotide ligation assay - OLA). Wykrywanie reszt biotynylowych reakcją immunoenzymatyczną poprzez streptawidynę i sprzęganie z enzymatyczną reakcją barwną jest jedną z powszechniej stosowanych kolorymetrycznych technik pomiarowych. Za pomocą opisanej metody, w zależności od sekwencji użytego znakowanego oligonukleotydu, można wykryć prawidłowy lub zmutowany allel genu alfa-AT.

Innym, bardziej zaawansowanym przykładem połączenia reakcji amplifikacji PCR i ligacji jest molekularna diagnostyka mukowiscydozy. Choroba ta powodowana jest mutacjami genu CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), który koduje białko błonowe o właściwościach kanału dla jonów chlorkowych.

Dotychczas opisano kilkaset (w większości punktowych) mutacji genu CFTR. Wśród nich przeważają mutacje występujące tylko w pojedynczych rodzinach, stąd ich nazwa „mutacje prywatne”. Tylko niespełna 30 różnego typu mutacji jest bardziej rozpowszechnionych (95% chorych na mukowiscydozę). Obecnie możliwe jest wykonanie jednoczesnego badania pod kątem wszystkich tych mutacji w jednej probówce (rysunek 7).

Rysunek 7. - Mutacja genu CFTR u chorego na mukowicsydozę.

W teście diagnostycznym wykorzystano reakcję PCR typu multiplex, pozwalającą amplifikować 15 odcinków genu jednocześnie. Do mieszaniny reakcyjnej zawierającej produkty amplifikacji dodaje się aż 60 par oligonukleotydów, które są komplementarne w stosunku do każdego z alleli genu CFTR. Na podstawie długości fragmentów powstałych po reakcji ligacji, które w celu ułatwienia ich identyfikacji znakowane są jednym z 3 barwników fluorescencyjnych, można wykryć obecność nieprawidłowych alleli wśród 31 mutacji genu CFTR.

Molekularna genetyka kombinatoryczna - tak brzmi nazwa technik badawczych, w których wykorzystywane są różnice w sekwencjach nukleotydowych badanych fragmentów DNA - ma szczególnie rozległe zastosowania. W ten sposób poszukuje się na przykład genów homologicznych. Geny homologiczne powstały w czasie ewolucji z jednego wspólnego genu, natomiast współcześnie są rozproszone na różnych chromosomach i pełnią nieco odmienne funkcje.

Geny kolagenu, których jest co najmniej 17, są doskonałym przykładem zarówno homologii sekwencji, jak i podobieństwa budowy polipeptydu. Kolagen typu I występuje w kościach, skórze i ścięgnach, typ II i X - w chrząstkach, typ III - w naczyniach krwionośnych, a typ IV - w błonach podstawnych. Jeszcze inny typ kolagenu (VII) produkowany jest tylko przez keratynocyty.

Na podstawie poznanych dotychczas genów kolagenu zaprojektowano takie startery, które umożliwiły amplifikację nieznanych jeszcze podjednostek tego białka. W ten sposób odkryto gen podjednostki 5 kolagenu typu IV (COLIVA5), który występuje praktycznie tylko w kłębkach nerkowych. Mutacje genu COLIVA5 są przyczyną rodzinnej nefropatii (zespół Alporta).

Materiałem stosowanym do badania ekspresji genów w tkankach oraz jej zmian wynikłych z choroby, zastosowanego leczenia czy nawet starzenia się - jest mRNA (rysunek 8).

Rysunek 8. - mRNA jako materiał stosowany do badania ekspresji genów w tkankach oraz jej zmian wynikłych z choroby, zastosowanego leczenia czy nawet starzenia się.

Reakcja odwrotnej transkrypcji zainicjowana przez mieszaninę 64 możliwych 6-nukleotydowych starterów powoduje przepisanie do komplementarnego DNA transkryptów wszystkich aktywnych genów. Otrzymany cDNA amplifikuje się w reakcji PCR. Użycie specjalnych, arbitralnie wybranych starterów oligonukleotydowych, których liczba sięga nawet 80, powoduje pojawienie się kilkuset amplifikowanych fragmentów. Jakkolwiek sekwencje starterów są dobrane "na ślepo", to ich liczba, a także niewielka długość (10-12 nukleotydów) zapewnia amplifikację produktów wszystkich aktywniejszych genów. Mieszaninę produktów reakcji PCR porównuje się za pomocą elektroforezy na żelu akrylamidowym, poszukując różnic między próbką badaną i kontrolną.

Znalezienie prążków, które się zmieniają w badanym układzie eksperymentalnym, to znaczy pojawiają się, znikają lub zmieniają intensywność - jest dowodem zmiany liczby cząsteczek mRNA. Po wycięciu z żelu takie prążki są reamplifikowane, sekwencjonowane i porównywane z bazami sekwencji genetycznych znanych już genów. Technika taka nosi nazwę pokazu różnicowego (differential display) i stosowana jest szczególnie chętnie na modelach zwierzęcych chorób człowieka.

Obecnie są już dostępne w sprzedaży pierwsze macierze oligonukleotydowe. Są to zestawy oligonukleotydów, ułożonych poprzez związanie końca 5' cząsteczki z podłożem, na mikropłytkach o rozmiarach kilku centymetrów kwadratowych. Tak jak w prawdziwych, posortowanych macierzach matematycznych, oligonukleotydy sąsiadujące w wierszach i kolumnach są do siebie najbardziej podobne, niekiedy różnią się tylko jednym nukleotydem. Wysoki stopień uporządkowania oligonukleotydów w matrycy pozwala korzystać z niej jako dogodnej alternatywy elektroforezy. Dzięki technikom hybrydyzacji i ligacji produktów PCR wybrane geny mogą być na macierzach charakteryzowane pod względem zmienności sekwencji nukleotydowej, a nawet sekwencjonowane (rysunek 9).

Rysunek 9. - hybrydyzacjia i ligacjia produktów PCR

Po raz pierwszy macierz oligonukleotydową wykorzystano do charakterystyki regionu wirusa HIV o dużej zmienności. W tym przypadku użyto znakowanych fluorochromami starterów dla wykazania wiązania amplifikowanego materiału wirusa z komplementarnymi oligonukleotydami macierzy. Dotychczas produkowane układy macierzy (chipy) zawierają ponad 80 tysięcy oligonukleotydów, a współczesne możliwości technologiczne pozwalają umieścić na niewielkiej powierzchni nawet kilkaset tysięcy różnych sekwencji. Ze względu na możliwości wielokrotnego użycia macierzy zdolności przepustowe diagnostyki usługowej wydają się w tej technice ogromne.

Diagnostyka molekularna otwarła nowe możliwości medycyny, zwłaszcza w dziedzinie profilaktyki. Większość badań molekularnych, które jeszcze przed 10 laty służyły poradnictwu rodzinnemu dla osób obciążonych ryzykiem genetycznym, zaczyna się powszechnie stosować w celu identyfikacji zagrożenia częstymi chorobami.

Od kilku lat w słownictwie naukowym przewija się termin medycyna molekularna. Dziedzina ta zapewne wyrosła z pogranicza patofizjologii i genetyki molekularnej, ale jej zasięg jest znacznie szerszy. Medycyna molekularna obejmuje diagnostykę genetyczną na poziomie DNA, mechanizmy cząsteczkowe przekaźnictwa sygnałowego i molekularną regulację ekspresji genetycznej. Celem tych badań jest poznanie związków między zmiennością genetyczną ludzi a ryzykiem częstych chorób. Do medycyny molekularnej należą również próby profilaktyki i leczenia chorób, o ile diagnoza dotyczy stanu podatności, ustalonego badaniem genomu, albo jeśli terapia ingeruje w ekspresję genów.

Wśród palących problemów medycyny molekularnej jeden nie ma bezpośredniego związku z postępem w diagnostyce na poziomie genów. Obawa przed eugenicznymi konsekwencjami medycyny molekularnej w najbliższych latach będzie zapewne częstym tematem sporów. Eugenika jest nauką z pogranicza genetyki, pragnącą praktycznie wykorzystać wiedzę o dziedziczeniu w celu poprawy gatunku. Jeśli gromadzone w wielu laboratoriach próbki DNA pacjentów pozwalają już dzisiaj ustalić nosicielstwo mukowiscydozy, skłonność do zakrzepicy czy neurasteniczne cechy osobowości, to w najbliższej przyszłości dołączy do tych rozpoznań ryzyko zawału serca, miażdżycy, nadciśnienia tętniczego, cukrzycy, nowotworów itd.

Informacje te przekazane pacjentom wraz z zaleceniem stosownej profilaktyki są szansą na poprawę stanu zdrowia społeczeństwa. Te same informacje w rękach pracodawcy czy też towarzystw ubezpieczeniowych mogą się stać przyczyną napiętnowania i dyskryminacji. Medycyna molekularna jest dynamiczną gałęzią medycyny, której rozwój nabrał lawinowego impetu wraz z wprowadzeniem technik opartych na amplifikacji PCR. Stanowi ona także nowe wyzwanie dla lekarzy kierujących się zasadami etyki lekarskiej, niezmiennymi od czasów Hipokratesa.

PCR - ZASADA DZIAŁANIA I PRAKTYCZNE ZASTOSOWANIE- Anna Król

UNIWERSYTET WARMIŃSKO - MAZURSKI - WYDZIAŁ BIOLOGII - Biotechnologii rok akademicki 2004/2005 1

---