Biologia Komórki - ćwiczenia[?]

Spis treści:

Cykl komórkowy u eucaryota 2

Struktura jądra interfazowego 4

Cytoszkielet 8

Kariotyp 11

Mitoza eukariontów 12

Cytokineza 14

Mejoza 16

• Cykl komórkowy u eucaryota

Cykl komórkowy - ściśle określona sekwencja etapów, przez które przechodzi komórka od chwili powstania do zakończenia podziału.

Cykl mitotyczny - zespół ściśle uporządkowanych i ukierunkowanych procesów molekularnych oraz kolejnych stadiów morfologicznych w komórce rodzicielskiej, które prowadzą do powstania 2 identycznych komórek potomnych.

Fazy cyklu:

G1 - wzrost komórki

- segregacja i dekondensacja chromosomów, degradacja wrzeciona. Odtworzenie otoczki jądrowej.

- synteza odpowiednich cyklin

- uzyskiwanie „licencji” chromatyny do replikacji (Origin of Replication - czynnik transkrypcyjny przyłączający się do odpowiedniego miejsca na DNA. Replication Licence Factor - dla uniknięcia poliploidyzacji wymusza pojedynczą replikację).

- kontrola uszkodzeń DNA (poziom białka p53 (strażnik genomu) rośnie w momencie detekcji uszkodzonego DNA, łączy się z nim w miejscach produkujących białko p21 będącym inhibitorem syntezy DNA → więzienie w fazie G1/G2.

- ostateczne przyzwolenie na replikację (hiperfosforylacja białka Rb odłącza go od białka E2F będącego istotnym czynnikiem rozluźniającym chromatynę (związany z acetylacją); w ten sposób chromatyna jest gotowa do replikacji).

- decyzja o przejściu do fazy G0, różnicowaniu (terminalnym, bądź tymczasowym), apoptozie.

G0 - komórki tymczasowo, bądź trwale są wyłączane z cyklu podziałowego (np. nasiona)

G1/S - faza “start”; warunkiem jest pomyślne ukończenie poprzedniej fazy.

[Cyklina B + kinaza p34^cdc2 → M-phase Promotion Factor]

S - replikacja DNA (najpierw euchromatyna, potem heterochromatyna)

G2 - synteza materiałów do wrzeciona podziałowego (α i β tubuliny, etc.)

- naprawa uszkodzeń DNA (p53)

- synteza MPF (cyklina D)

Kinazy i cykliny cyklu komórkowego:

• D (CDK4 lub CDK6) - ukończenie fazy G1 cyklu

• E (CDK2) - połowa G1 - S. Wymagana jest do wejścia komórki w

fazę S i do zainicjowania replikacji)

• A ( CDK2) - koniec G1 - wczesna profaza. Wymagana do przejścia prze fazę S i do kontroli replikacji DNA. Proteoliza w momencie rozpadu otoczki jądrowej (wczesna profaza).

• B (CDK1) - późna faza S i G2. Inicjuje wejście w mitozę. Substratami dla tego heterodimeru są: jądrowe laminy, białko jąderkowe (nukleoina), MAP-4, białka kompleksów porowych i centrosomów. Proteoliza między metafazą, a anafazą.

Cyklina B2 zlokalizowana w Aparacie Golgiego - odgrywa rolę w segregacji organelli poprzez ich fosforylację.

Geny cyklin D (D1, D2, D3) i E są potencjalnymi onkogenami. Ich nieprawidłowa, lub nadmierna ekspresja często występuje w różnych rodzajach nowotworów u człowieka (np. D1 - 63% przypadków raka płaskonabłonkowego przełyku). Nadmierna ekspresja D i E prowadzi do ciągłej aktywacji CDK4 i CDK6 które fosforylują pRb - przekroczenie punktu R i progresja cyklu komórkowego. Zmutowane białko Rb zachowuje się jak ufosforylowane (niezdolne do wiązania czynników transkrypcyjnych).

Mechanizmy działania systemów naprawczych:

• Brak czynników uszkadzających DNA - p53 wiąże się z białkiem MDM2, które ukierunkowuje go na szlak ubikwitynacji i degradacji zależnej od proteasomów.

• Uszkodzenie DNA - brak wiązania MDM2. Aktywne p53 indukuje transkrypcje inhibitora CDK - p21^pic1. Jeżeli usunięcie szkody jest niemożliwe → apoptoza.

Działanie MPF - kompleks p34^cdc2/cyklina z powodu fosforylacji Tyr¹⁵ i Thr¹⁴, a także Thr¹⁶¹ stanowi nieczynny MPF, zwany też pre-MPF. Po ukończeniu syntezy DNA następuje aktywacja fosfatazy cdc25, powodującej defosforylację zasad azotowych białka p34^cdc2. Jednymi z substratów MPF są m.in. histon H1 (wymagany do kondensacji chromatyny), laminy (uczestniczące w destrukcji otoczki jądrowej we wczesnej profazie), nukleolina (białko C23 zaangażowane w remontowanie struktury jąderka), białka Microtubule Association Products Stimulator ( stymulowane przez MPF mają wpływ na na wzrost mikrotubul). Rozkład cykliny B na przełomie metafazy i anafazy powoduje inaktywację i odwrócenie wszystkich zmian.

Jedyną fazą, w której nie odbywają się procesy biosyntetyczne jest faza M.

• Struktura jądra interfazowego

Wydzielenie jądra to oddzielenie transkrypcji i translacji. U procaryota nie ma intronów - transkrypcja i translacja prawie równoległe. U eucaryota geny w postaci nieciągłej: pre-mRNA musi przejść proces dojrzewania (dotyczy ono wielu rodzajów RNA...)

Dojrzewanie:

• Nakładanie „Cap” na koniec 5'

• Uwypuklenie fragmentów niekodujących i ich późniejsze wycięcie.

• Połączenie całości RNA przez ligazy.

Wielkość jądra zależy od aktywności komórkowej. Przy dużym metabolizmie stosunek rozmiaru ^jądro/_{reszta komórki} jest duży.

Jądro:

1. Otoczka

2. Matriks (nuklepolazma)

3. Chromatyna

4. Jąderko

1. Otoczka - Nuclear Envelope

Zanika podczas fazy M; nie jest strukturą trwałą. Składa się z 2 błon rozdzielonych przestrzenią perynuklearną:

• Zewnętrzna - zachowuje ciągłość z ER, jest labilna i giętka. Zawiera białka charakterystyczne dla ER (cytochrom p450 i B5). Często ma rybosomy.

• Wewnętrzna - połączona z matriks jądrowym za pomocą lamin (LAP A, B, C), LAP2α i β (w jądrze).

Ogólny skład chemiczny błon otoczki jądrowej cechuje wysoka % zawartość białek (do 70% masy) oraz znaczący udział fosfolipidów odróżniający je od innych błon w komórce. Zidentyfikowano 4 główne klasy białek:

1. Transbłonowa glikoproteina - gp210; zespala wewnętrzną i zewnętrzna błonę otoczki jądrowej; niezbędna dla uformowania kompleksów porowych i ich stabilizacji.

2. Peryferyjne glikoproteiny kompleksu porowego; uczestniczą w wymianie jądrowo-cytoplazmatycznej.

3. Laminy - główne składniki blaszki, należące do rodziny filamentów pośrednich; odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu strukturalnej integralności błony.

4. Integralne białka błonowe - specyficzne dla wewnętrznej błony otoczki jądrowej, ściśle zasocjowane z blaszką, receptory dla niektórych lamin.

Morfologia Nuclear Pore Complex:

1. Kompleks szprych wraz z centralnym kompleksem kanałowym

2. Pierścień cytoplazmatyczny

3. Pierścień nukleoplazmatyczny

1. Podstawowy szkielet jądrowego kompleksu porowego; składa się z 8 szprych obejmujących centralny kompleks kanałowy. Jest ulokowany między pierścieniem cytoplazmatycznym i nukleoplazmatycznym.

2. Od strony cytoplazmy zwieńczony 8 krótkimi filamentami będących miejscem dokowania dla białek importowanych do jądra komórkowego. Dzięki zdolności do aktywnego, bądź biernego skracania mogą dostarczać dokowany materiał do centralnego kompleksu kanałowego.

3. Ulokowany na obrzeżu kompleksu porowego od strony nukleoplazmy. Jest połączony z „koszykiem jądrowym” zbudowanym z 8 filamentów. Rozgałęzienia każdego filamentu tworzą pierścień koszyka (odgrywa on rolę w transporcie jądrowo-cytoplazmatycznym)

Transport aktywny:

1. Białko zawierające Nulcear Localisation Signal łączy się z importyną α, potem z β i tworzy z nimi kompleks, który przez importynę β jest przyłączany do filamentów cytoplazmatycznych NPC.

2. W etapie translokacji tego kompleksu uczestniczy RanGDP. Wymiana RanGDP, na GTP warunkuje wiązanie RanGTP z importyną β i dysocjację transportowanej cząstki.

3. Importyna β wraz z RanGTP wraca do cytoplazmy (może też wracać niezależnie). Importyna α wymaga czynnika eksportu Cellular Apoptosis Susceptibility protein oraz RanGTP.

4. RanGTP jest przekształcane w nieaktywną formę RanGDP i oddysocjowuje obie importyny.

Eksport cząsteczek z jądra jest oparty na podobnym mechanizmie; tam jednak zamiast NLS występuje sekwencja Nulear Export Sequence.

2. Matriks

• Blaszka jądrowa - siateczka włókien białkowych wyścielająca wewnętrzną powierzchnie błony jądrowej. Stanowi szkielet dla otoczki jądrowej oraz służy do zakotwiczenia domen chromatynowych (lamina B).

Pojedyncza lamina składa się z 3 domen - rdzeń o strukturze helikalnej

- sekwencja sygnałowa NLS

- miejsce wiązania dla białek LAP

Laminy tworzą filamenty pośrednie; wyścielają błonę i tworzą składniki cytoszkieletu.

• Siateczka wewnątrz jądrowa

• Matriks jąderkowe - białka: B23, nukleolina, fibryllaryna

Białka budujące matriks: Laminy (A - w jądrach komórek zróżnicowanych, B - we wszystkich komórkach, C).

W DNA sekwencje MatrixAssociatedRegion lub Scaffoold Attached Region - sekwencje łączące chromatynę z matriks jądrowym umożliwiające zajęcie despiralizującym chromosomom określonych domen i wyodrębnienie domen odpowiedzialnych za transkrypcję i translację. Niektóre sekwencje MAR mają znaczenie strukturalne i funkcjonalne (ich cechą charakterystyczną 70% sekwencji A + T). W sekwencjach MAR znajdują się rejony inicjujące replikację.

3. Chromatyna

• DNA

• Białka niehistonowe - High Mobility Group - A

- B (w eu i heterochromatynie)

- N (wewnątrz nukleosomów; odkształcanie i skracanie DNA ze względu na duże powinowactwo do białek histonowych)

• snRNA - dojrzewanie transkryptów; składanie (splicing) mRNA, etc.

• Histony

Częstość występowania sekwencji w 2n genomie:

• Unikalne - 2 na jeden 2n genom

• Średnio repetetywne - do 10³ na 2n genom. Sekwencje kodujące - mają geny dla rRNA, tRNA, histonów, białek zapasowych (rośliny). Kodują b. szerokie spektrum białek; nie wchodzą w skład heteromchromatyny.

• Wysocerepetetywne satelitarne DNA - do 10⁵ na 2n genom. W jądrze interfazowym w kondensacji (podobnie do RNA), nie podlegają transkrypcji, despiralizują podczas replikacji.

Stopnie upakowania materiału genetycznego:

1. Podwójna helisa DNA (10 nukleotydów na skręt)

2. Włókno nukleosomowe (6 nukleosomów na skręt)

3. Włókno solenoidowe (50 skrętów na pętlę - każda pętla to jednostka replikacyjna)

4. Chromatyna interfazowa

5. Chromosom metafazowy

Histony - małe, wybitnie zasadowe białka (najbardziej ze wszystkich poznanych). Ich ładunek wypadkowy + przyciąga DNA -.

H1, H2A, H2B - Arginina

H3, H4 - Arginina + Lizyna

Postranslacyjne modyfikacje histonu:

• Acetylacja - odwracalna; następuje podczas transkrypcji i translacji. Proces ten, powodując lokalne zmiany w upakowaniu chromatyny, ułatwia związanie polimeraz oraz innych białek przed rozpoczęciem transkrypcji lub translacji. Rozluźnia chromatynę

• Fosforylacja - odwracalna; zmiany w ufosforylowaniu histonów towarzyszą zjawiskom zachodzącym podczas fazy M: kondensacja chromosomów, rozpad otoczki jądrowej, montaż i wydłużenie wrzeciona podziałowego. Kondensacja i dekondensacja chromatyny.

• Metylacja - z reguły nieodwracalna; dotyczy głównie histonów argininowych H3 i H4. Związana ze strukturalnymi i funkcjonalnymi modyfikacjami w chromatynie po mitozie.

4. Jąderko

Duży stopień kondensacji białek; 3 obszary:

1. Składnik fibrylarny gęsty

2. Składnik granularny (na peryferycznej części) - podjednostki do wyeksportowania

3. Odcinki RNA kodujące rybosomowe RNA

Wakuole jąderkowe - miejsca o większej od otoczenia przejrzystości, związane z wyeksportowaniem pre-rRNA.

W jąderku zachodzi synteza pre-rRNA (fabryka rybosomów); geny dla rRNA występują w formie tandemowej:

- odcinki 18S (mała podjednostka rybosomowa)

- odcinki 28S i 5,8S (duża podjednostka rybosomowa), 5S RNA transkrybowane w matriks.

Jąderko pełni także funkcję więzienia dla białek mających pozostać nieaktywnymi - MDM2. inhibitor p53, w interfazie jest upakowany w jąderku.

Miejsce działania polimeraz:

Polimeraza I - jąderko (18S, 5,8S, 28S)

Polimeraza II - chromatyna (geny kodujące białka snRNA)

Polimeraza III - chromatyna (geny dla tRNA, 5S RNA, geny małych strukturalnych RNA)

Białka jąderkowe:

• B23 - białko „niańka” - ochrania pre-rRNA w trakcie transportu

• Nukleolina - ufosforylowana bierze udział w cięciu pre-RNA → ułatwia przyłączenie białek regulatorowych i endonukleaz

• Fibrylaryna - dojrzewanie

Typy morfologiczne jądra:

• Retikularny - dużo DNA ≈ 100 pikogramów; Barwią się hetero i euchromatyna.

• Duże chromosomy o ułożeniu 2 biegunowym - heterochromatyna przy centromerach

- euchromatyna przy telomerach

• Retikularny z chromocentrami - heterochromatyna w postaci chromocentrów (słabo wybarwiona)

Heterochromatyna fakultatywna - dotyczy chromosomów płciowych. Np. fenotyp żeński XX u świerszczy; dla wyrównania poziomu ekspresji genów pomiędzy chromosomami, jeden z nich ulega kondensacji. O kondensacji decyduje stopień zmetylowania związany z transkrypcją genu X Inactive Specific Transcript.

• Cytoszkielet

• Kształt

• Transportowanie i rozmieszczenie organelli i makromolekuł

• Wewnętrzna organizacja

• Ruch

• Skurcz

• Podział

• Fagocytoza

• Zjawisko adhezji komórkowej

Mikrotubule (25nm)

Polaryzacja mikrotubul związana jest z hydrolizą GTP i przyłączaniem α i β tubuliny. Koniec + ma większe powinowactwo do GTP, niż koniec -, dlatego polaryzacja MT jest wyraźnie uprzywilejowana na końcu +.

MT zakotwiczone są w Microtubule Organisation Center - głównym jego składnikiem jest γ tubulina; występuje w kinetochorach, ciałkach podstawowych rzęsek i wici.

Centrosom zwierzęcy - 2 centriole ustawione pod kątem 90^o

	Komórka zwierzęca	Komórka roślinna
			Interfaza	1 MTOC	Sieć kortykalna (MTOC b. liczne - przy jądrze, plastydach, błonie...)
			Preprofaza	-	Pierścień PPB
			Podział	Budują wrzeciono	Budują wrzeciono
			Cytokineza	-	Fragmoplast

Białka Microtubule Associated Proteins:

• MAP stabilizujące - łączące sie z bocznymi powierzchniami mikrotubul w miejscu acetylacji lub fosforylacji tubuliny α

• Białka tau - w większości komórek, w aksonach łączy mikrotubule w pęczki. Jego brak zaburza tworzenie aksonów.

• MAP2 - utrzymują uporządkowaną strukturę MT w dendrytach i aksonach.

• Kateniny - łączą MT z innymi elementami cytoszkieletu

• MAP łączące koniec + z innymi strukturami

• Białka oczapkowujące - białka kompleksu Tip Attachement Complex (TAP); przyczepiają MT do ER.

• MAP umożliwiające ruch na MT; białka motoryczne

• Kinezyna - zbudowane z 2 łańcuchów ciężkich (zdolność hydrolizy ATP) i lekkich (zdolność przyłączania ładunku). Transport od - do +; sekrecja. Razem z dyneiną bierze udział w segregacji chromosomów.

• Dyneina - zbudowana z łańcuchów ciężkich, pośrednich i lekkich. Transport od + do -; wchłanianie, zakotwiczają Ap. Golgiego; motor molekularny rzęsek i wici.

• Dynamina - Kieruje aktywnym ruchem ślizgowym jednej MT po drugiej; zaangażowana w endocytozę.

• KAR3 i NCD

W komórce roślinnej:

• MAP65 - łączy 2 równolegle nachodzące na siebie MT

• MAP190 - występują we wrzecionie kariokinetycznym

Związki zaburzające organizacje MT:

• Kolchicyna - wiąże się z wolnymi heterodimerami α tubuliny i uniemożliwia powstanie MT; przeważają procesy depolimeryzacji.

• Winkrystyna i Winblastyna - strącają MT

• Taksol - stabilizuje MT; wiąże MT uniemożliwiając ich rozpad, ale nie przeszkadza w polimeryzacji.

• D₂O - Stabilizuje MT

Mikrofilamenty (filamenty Aktynowe 5-8 nm)

Filamenty aktynowe, zbudowane z monomerów aktyny G, stanowią do 20% wszystkich białek w komórce eukariotycznej. Są zlokalizowane jedynie pod błoną plazmatyczną i stanowią część korową cytoplazmy określając jej kształt i mechaniczne właściwości.

Polimeryzacja aktyny wymaga:

• ATP, które przy każdorazowym dołączeniu podjednostki do filamentu jest hydrolizowane do ADP

• Jonów K⁺ i Mg²⁺

Koniec + (lotkowy) filamentu polimeryzuje 10 razy szybciej niż koniec - (grotowy)

Filamenty aktynowe tworzą różne formy organizacji:

• Mikrokosmki

• Włókna naprężeniowe - Jeden koniec tych włókien umieszczony w płytce przylegania, w której komórka jest przytwierdzona do macierzy zewnątrzkomórkowej. Drugi koniec może być przyłączony do innej płytki przylegania bądź, do filamentów pośrednich otaczających jądro.

• Lamellipodia - wypustki wysuwane z powierzchni komórki będące gęsta siecią filamentów aktynowych. Filamenty aktynowe mają swoje końce + skierowane do krawędzi błony komórkowej. Marszczenie błony komórkowej występuje wtedy, gdy lamellipodium nie może przymocować się do podłoża.

• Filopodia - stożek wzrostowy rozwijającego się aksonu komórki nerwowej.

• Pierścień kurczliwy - złożony z filamentów aktyny i miozyny, rozdziela 2 komórki siostrzane w trakcie cytokinezy (zależny od [Ca²⁺]).

Actin Binding Proteins - białka wiążące aktynę:

• Tropomiozyna - białka przełączające kontrolujące skurcz mięśnia.

• Profilina - rodzina białek wiążących monomery aktynowe; często związana z błoną, wiąże się w stosunku 1:1, reguluje poziom aktyny włókienkowatej.

• Tymozyna β4 - potencjalny inhibitor polimeryzacji aktyny. W niektórych komórkach (np. płytki krwi człowieka) całkowicie blokuje polimeryzacje monomerycznej aktyny poprzez wiązanie się z nią.

• Spektryna - związana z błoną erytrocytów i stanowi grotowy koniec białka wiążącego. W tych komórkach błona jest podtrzymywana przez sieć tetramerów spektryny.

• Fibryna - łączą filamenty aktynowe w równoległe szeregi (pęczki).

• α-aktynina - wiąże filamenty, pomaga zakotwiczyć końce włókienek naprężeniowych w obszarze błony zwanym płytką przylegania, gdzie komórka łączy się z macierzą zewnątrzkomórkową.

• Filamina - białko tworzące żel, które przyczynia się do tworzenia gęstej, lepkiej sieci przez sieciowanie filamentów aktynowych.

Związki zaburzające polimeryzację filamentów aktynowych:

Cytochalazyny - wydzielane przez śluzowce wiążą się z końcem + filamentu aktynowego, nowe monomery nie mogą być dołączane - w efekcie depolimeryzacja.

Falloidyna - wydzielana przez muchomor sromotnikowy. Stabilizuje filamenty aktynowe hamując depolimeryzację. Zjedzenie surowego mięsa neutralizuje.

Aktyna jest zaangażowana w fagocytozę.

Filamenty pośrednie (10nm)

• Trwała, włóknista struktura, odporna na rozciąganie - nadaje komórce wytrzymałości.

• Brak polaryzacji

• Występują w jądrze komórkowym tworząc laminę jądrową otoczki jądrowej.

• Pełnią funkcje podporowe

Struktura filamentów pośrednich:

Monomery →α-helikalnie zwinięte dimery →tetramer (2 dimery zwinięte antyrównolegle)→protofilament (7 lub 8 splecionych kompleksów tetramerycznych).

Wytrzymałość na rozciąganie zależy w dużej mierze od naprzemiennego ułożenia dimerów każdego tetrameru.

Białka filamentów pośrednich:

• Keratyny - u człowieka, co najmniej 20 różnych. Występują w komórkach nabłonka, skóry. Ciężkie keratyny są swoiste dla włosów i paznokci. Tworzy heteropolimery.

• Wimentyna i białka pokrewne - najczęściej występujące filamenty pośrednie. Obecne w fibroblastach i komórkach śródbłonka (tkanka łączna). W odróżnieniu od keratyn mogą tworzyć polimery z jednego rodzaju białka, homopolimery.

• Białka NeuroFilamentów - rozciągają się wzdłuż neuronu. Nadają długim wypustkom komórek nerwowych odporność na rozciąganie. Odgrywają istotną rolę w mocowaniu komórek nabłonkowych do:

1. Połączeń komórkowych nazywanych desmosomami, kotwiczących przylegające komórki.

2. Hemidesmosomów, które wiążą komórki do blaszki podstawnej.

• Laminy jądrowe - 3 rodzaje A, B i C. Lamina jądrowa lub lamina włóknista składa się z sieci filamentów pośrednich na wewnętrznej powierzchni błony jądrowej i jest związana z porami jądrowymi. W odróżnieniu od innych filamentów laminy są demontowane (fosforylacja reszt serynowych umożliwia rozpuszczanie) podczas mitozy.

Typ III - zawierające wimentynę, desminę, białko tk. glejowej, peryferynę.

Typ IV - w neurofilamentach

Typ V - filamenty jądrowe/laminy

Typ VI filamenty nestyny (w rozwijajacych sieneuronach)

• Kariotyp

Kariotyp - zespół chromosomów danego osobnika lub gatunku.

Do analizy kariotypu wykorzystuje się komórki w stadium metafazy:

• Komórki merystematyczne

• Komórki macierzyste ziaren pyłku

• Komórki gruczołów płciowych

• Komórki szpiku kostnego

• Limfocyty

• Płyn owodniowy

Cechy chromosomów:

- wielkość chromosomów (l. chromosomów (Ascaris megalocepa - 2), masa)

- Kształt; położenie przewężenia pierwotnego i wtórnego

• Metacentryczny - w środku

• Submetacentryczny - jedno trochę niżej od drugiego

• Akrocentryczny - jedno b. krótkie, 2 długie

• Telocentryczny - jedno ramię; telomer na końcu

Przewężenie wtórne mają chromosomy satelitarne (tam zlokalizowane są geny kodujące RNA).

Idiogram - graficzne przedstawienie kariotypu

• Dla ustalenia budowy chromosomu

• W cytodiagnostyce

• W celu określenia zmian ewolucyjnych genotypu, badanie bliskości pokrewieństwa

Metoda prążkowania (wykorzystano obecność eu i heterochromatyny)

• Metoda prążków G - stosuje się w podwyższonej temperaturze działanie alkaliów, następnie barwi się barwnikiem Giemsy

• Metoda prążków Q - trawi się trypsyną, barwi kwinokryną. Heterochromatyna uzyskuje żółte zabarwienie.

Białka niehistonowe mają inny stopień powiązania z chromatyna, po to zabiegi przed barwieniem.

Klasyfikacje kariotypu człowieka:

• Denverowska - grupy A do G (pod względem wielkości)

• Paryska - nazewnictwo prążków

Dysfunkcje chromosomalne:

• Nieprawidłowe rozdzielenie chromosomów (R!)

• Nieprawidłowe rozejście chromatyd siostrzanych (R!)

• Nieprawidłowe pierwsze podziały zygoty

Zmiany w lkiczbie chromosomów:

- Euploidia - zwielokrotniony haploidalny zespół chromosomów: 2n, 3n, 4n, etc.

- Aneuploidia - niepełny zespół chromosomów

• Monosomia 2n-1 (zespół Turnera 45 X₀)

• Trisomia 2n+1 (zespół Downa 47 XX/ 47 XY, zespół Klinefeltera 47 XXY i więcej)

Zespół Downa - trisomia chromosomu 21 (najmniejszy chromosom). Może być ttakże wywołany delecją - skróceniem i przemieszczeniem fragmentu chromosomu. Za zespół Downa odpowiedzialny jest odcinek Guard - gen kodujący syntezę puryn, SOD.

Zespół Turnera - monosomia chromosomu 23. U kobiet z zespołem Turnera nie ma ciałka Baara - nie ma heterochromatyny fakultatywnej.

• Mitoza eukariontów

Proces synchroniczny we wszystkich chromosomach. Ruchy generowane przez MT; w mniejszym stopniu przez mikrofilamenty.

Profaza - separacja centrosomów (zwierzęta); ustalanie się 2-biegunowości (rośliny)

MPF - aktywacja przez defosforylację kinazy B (p34) (przy Ter 15 i Tyr 14). Przez fosfatazę cdc25

Telofaza/G1 - fosforylacja histonu H1 (kondensacja chromatyny).

Prometafaza - Po rozpadzie otoczki jądrowej; przyłączenie MT do kinetochorów, kongresja chromosomów do płytki metafazalnej. Silne naprężenia między włóknami.

Metafaza - równowaga polimeryzacji i depolimeryzacji utrzymuje chromosomy w płaszczyźnie równikowej.

Anafaza - depolimeryzacja przy + przez kinezynę katastroficzną Cenp-E

• A - przy centromerach. Połączenie między siostrzanymi chromatydami przerwane. Skracanie włókien kinetochorowych na końcu + → chromosomy odciągane w kierunku biegunów. Kompleks APC/cdc20 aktywuje kinezyny, co wyzwala dysocjację końca +.

• B - przy włóknach biegunowych. Związana. W tej fazie aktywny MPF nie stabilizuje płytki → wzajemny ślizg z wydłużaniem włókien birgunowych - bieguny oddalają się od siebie.

Powstanie dwubiegunowości:

S/G2 - podział centrosomu

M - utworzenie kompletnego wrzeciona pierwotnego; nie opłaszczającego i nie wnikającego do jądra.

MT biegunowe łączą białka z rodziny kinezyn - w momencie, gdy MPF jest aktywne, stabilizują MT biegunowe.

Przewężenie pierwotne - DNA heterochromatynowe ≈200nm (chromosom 700-800nm). Różni się składem nici nukleosomowych - zmodyfikowany histon H3 (znaczenie dla asocjacji białek kinetochoru)

Kohezyny - syntetyzowane w trakcie fazy S. Łączą 2 chromatydy ze sobą (po całej linii). W profazie hydroliza kohezyny - zostaje tylko w okolicy przewężenia pierwotnego i przy centromerze.

Dojrzały centromer - kohezyny, kinetochor + DNA heterochromatynowe.

Kohezyny - spajają 2 chromatydy po ukończeniu replikacji.

Sister Chromatin Cohesion - Scc1, Scc3.

Sekuryna - inhibitor separaz Pds1 i Pds5

Separaza - hydrolaza kohezyny

Dyneina - aktywan w stanie aktywnego MPF:

• I etap ruchów kongregacji chromosomów → ruch do kinetochorów

• II etap ruchów kongregacji chromosomów → ruch do płytki metafazalnej (kinezyna)

MAD2 - wiąże w jeden nieaktywny kompleks cdc20/APC (APC ufosforylowany uruchamia proces ubikwitynacji proteosomalnej: sekuryny, kohezyny i cykliny β)

Kinetochor bez mikrotubul asocjuje MAD2 - ono tworzy kompleks cdc20 i APC unieczynniając je. Stan ten trwa aż do metafazy.. Gdy MT przyłączą się do kinetochoru MAD2 oddysocjowuje.

Polokinaza fosforyluje kohezynę odczepiając ją. W 1-szym podziale R! kohezyna zostaje, dopiero w 2-gim zanika.

Kategorie białek kinetochorowych:

• Cytokineza

Cytokineza u zwierząt

Prometafaza/metafaza - decyzja o ułożeniu wrzeciona kariokinetycznego (bierze w tym udział dyneina i F-aktyna wraz z MT)

Punkt krytyczny istnienia wrzeciona - zła lokalizacja - STOP

Organizacja pierścienia:

Pierścień kurczliwy, aktynomiozynowy (mechanizm ślizgu F-aktyna + miozyna II). Cześć włókien aktynomiozynowych jest transportowana do obszaru równikowego ze strefy kortykalnej. Tam też, pod koniec anafazy, zachodzi polimeryzacja włókien F-aktynowych.

Pierścień aktynowy musi być przytwierdzony do błony: talina, anilina (istnieją tu liczne aberacje)

Czas i miejsce położenia pierścienia:

Sygnał pochodzi ze struktur wrzeciona anafazowego (MT lub same chromosomy). Mechanizm jednak nie jest jednakowy we wszystkich komórkach.

Mid Body- Antyrównoległe zachodzenie włókien biegunowych. Najważniejsze białka w tej strefie należą do rodziny kinezyn mitotycznych tworząc kompleks z polokinazą. Delecja upośledza cytokinezę.

• Inter Centromeric Proteins (InCeP) - są zlokalizowane w centromerze chromosomu (białka przejściowe chromosomowe).

• Passanger Chromosome Proteins - w trakcie cytokinezy transportowane w rejon bruzdy podziałowej.

• Aurora B - związana częściowo z chromosomami - przy cytokinezie w okolicy bruzdy.

W trkacie cytokinezy komórki dodatkowo obracają się wokół własnych osi (jak baloniki...)

Cytokineza u roślin

Kariokinezy bez cytokinez - komórki wydzielnicze, bielmo jądrowe

Cytokineza polega na wytworzeniu pomiędzy 2 sąsiednimi jądrami ściany; nic się nie wpukla.

Pasmo preprofazowe - charakterystyczne dla końcowych etapów fazy S i całej G₂. Jego powstanie związane jest z aktywnością MPF. Składa się z MT i mikrofilamentów aktynowych. Wyznacza strukturę podziałów; zlokalizowane pod plazmolemmą w okolicy jądra (ścisła korelacja przestrzenna i czynnościowa). MT od powierzchni otoczki polimeryzują do pasma preprofazowego. W preprofazie pasmo zaczyna zanikać, w metafazie znika całkowicie - depolimeryzacja MT oraz degradacja mikrofilamentów aktynowych. Obszar pod plazmolemmą pozbawiony aktyny stanowi wyznakowany obszar dla fragmoplastu/przegrody pierwotnej.

Fragmoplast - wrzeciono cytokinetyczne. Powstaje pod koniec anafazy między grupami siostrzanych chromosomów; budują je resztki wrzeciona kariokinetycznego.

Białka kinazynopodobne

Rodzja białka	Funkcja	Lokalizacja
			BIM C (+)	Białka motoryczne	Wzdłuż MT; duże ilości w płaszczyźnie podziałowej
			Ncd kar3 (-)
			ATPAKRP (+)		Na końcu +

Pod plazmolemmą gromadzone są pęcherzyki sekrecyjne wydzielane z Ap. Golgiego (polisacharydy i glikoproteiny). Ich sekrecja zachodzi wzdłuż MT.

• Za pośrednictwem wyrostków pęcherzyki łączą się - tworzy się przegroda pierwotna, dopiero w dalszych etapach odkładana jest na niej celuloza.

• W okolicach przegrody pierwotnej jest syntetyzowana kalloza (część składników z diktiosomów) - stabilizuje ścianę komórkową.

• W rosnącej przegrodzie pierwotnej syntaksyna (KNOLLE); białko wbudowane w błony pęcherzyków, decyduje o miejscu wbudowania.

Kofeina - inhibitor cytokinezy. Nie hamuje etapu łączenia się pęcherzyków. Najprawdopodobniej działa przez zmianę koncentracji Ca²⁺ (bez nich nie ma cytokinezy). Likwiduje gradient poprzez otwarcie kanałów w błonach i wypływ Ca²⁺. Deficyt tych jonów hamuje syntezę kallozy, co z kolei destabilizuje przegrodę pierwotną.

• Mejoza

• 1 podział redukcyjny

• 2 podział wyrównawczy (ostateczna redukcja DNA 2c → 1c)

Pomiędzy podziałami mejotycznymi zachodzi interkineza - blokowanie replikacji.

Mejoza postzygotyczna - cykl haploidalny; zygota → 4 spory w komórce wegetatyenej.

Mejoza prezygotyczna - w komórkach gonad; komórka macierzysta → gamety

Inicjacja cyklu R!

• Przed fazą S (G₁/S)

• Ime1 - czynnik transkrypcyjny odpowiedzialny za wejście w mejozę

• Stres odżywczy (dostępność makroelementów) powoduje odblokowanie genu ime1 kodującego IME2

• SIC 1 - inhibitor fazy S (kompleksu C1B/CDK) nieaktywny po ufosforylowaniu.

Premejotyczna faza S

• Niecałe DNA zreplikowane - 0,3% nie (jeśli replikacja przebiega w całości to zachodzi mitoza)

• Faza S mejotyczna jest dłuższa od mitotycznej ze względu na zaangażowanie mniejszej liczby replikonów.

• Dołączana jest kohezyna mejotyczna (połączenie chromatyd siostrzanych)

Po zakończeniu fazy S→ G₂/M→ Mejoza

Za kondensację chromatyny i połączenie chromatyd odpowiada kompleks kondensyn i kohezyn:

• Białka rodziny Structural Maintanance Chromosome (SMC II, SMC IV) oraz Sister Chromatine Cohesion (SCC I, SCC III).

• Ich podjednostki zbudowane z heterodimerów; charakteryzują się elastycznością.

• Podjednostki regulatorowe specyficzne dla kohezyn mitotycznych i mejotycznych (W kohezynie mejotycznej RED VIII zastępuje SCC I - stąd ich odrębne właściwości). Kompleks kohezyny tworzy pierścień zbudowany z heterodimerów SMC I i SMC III + regulatory; obejmuje chromatyny.

Profaza I mejotyczna

Leptoten - rozpoczyna się kondensacja chromatyny, rekombinacja, łączenie chromatyd w kompleks synaptonemalny. W jądrze chromosomy zmieniają swoje położenie → podczepiają się telomerami pod otoczkę jądrową, zbliżają się do siebie nawzajem → chromosomy homologiczne mają ułatwiony kontakt; powstaje kompleks synaptonemalny.

Rozpoczyna się proces rekombinacji - występują 2-niciowe pęknięcia w chromatydach (działanie białka Spo11), co stanowi sygnał do rozpoczęcia rekombinacji. Rozpoczyna się przyłączenie do chromosomów białek warunkujących kompleks synaptonemalny.

Zygoten - parowanie chromosomów homologicznych w biwalenty (białka SCP pełnią rolę szyn przytwierdzających 2 chromosomy). Podjednostki budujące kompleks synaptonemalny:

Element lateralny	Element centralny
			RED1, Aop 1	Zip 1 (drożdże)	Białka filamentowe mające powinowactwo do DNA
			SCP2, SCP3	SCP1 (ssaki)

Do pęknięć przyłączają się endonukleazy (białka „ściągające izolację” z chromosomów).

Następuje przestrzenna zmiana ułożenia DNA oraz postreplikacyjna naprawa DNA. W węzłach rekombinacyjnych oraz wczesnych węzłach rekombinacyjnych zlokalizowane białka regulujące procesy zygotenu.

Pachyten - endonukleaza rozcina fragmenty chromatyd homologicznych; crossing-over.

W późnych węzłach rekombinacyjnych znajdują się enzymy odpowiedzialne za cięcie w regionie Holiday Junction (ich liczba ściśle skorelowana z miejscem, w którym nastąpił crossing-over).

Endonukleaza DNA - pęknięcia 2-niciowe
	Helikazy - rozwinięcie nici
	Białka SSBP - stabilizacja rozwiniętego 1-niciowego RNA
	Topoizomeraza I DNA - zwijają/rozwijają DNA
	Topoizomeraza II DNA - porządkowanie struktury DNA
	Egzonukleaza
	Polimeraza DNA
	Enzymy rekombinacyjne
	Enzym RuVC - rozcięcie Holiday'a

Do zadziałania punktu kontrolnego w pachytenie konieczne jest zajście 2-niciowych pęknięć.

Fosforylacja białek kompleksu synaptonemalnego gwarantuje ciągłość pachytenu; ich defosforylacja wyjście z tej fazy.

DCD1, RED3 - białka wykrywające uszkodzenia DNA. Przenoszą uszkodzenia na konkretną kinazę - fosforylacja kompleksu synaptonemalnego.

Diploten - rozkłada się kompleks synaptonemalny

Chromosomy homologiczne utrzymują chizamy + kohezyny

Widoczna postępująca kondensacja.

Podczas oogenezy - chromosomy szczoteczkowe - silnie zdespiralizowane; utworzone przez 2 homologiczne chromatydy. Każda z nich odpowiada jednej b. długiej cząsteczce DNA. Ciągła długa chromatyda jest pofałdowana i tworzy pętle rozsunięte na boki porozdzielane silnie skręconymi gęstymi odcinkami - chromomerami. Na pętlach zachodzi aktywna transkrypcja RNA (mRNA, 5 S RNA, snRNA); chromomery są pod tym względem nieaktywne. W czasie transkrypcji RNA wiąże się w kompleksy rybonukleinowo-proteinowe, które odsuwają się od pętli i przemieszczają z jądra do cytoplazmy. W pętlach znajdują się liniowo ułożone sekwencje DNA porozdzielane niekodującymi odcinkami DNA - przerywnikami.

Diakineza - Pod koniec zanika otoczka jądrowa

Maksimum kondensacji chromatyny

Pod koniec kongresja do płytki metafazalnej

W mejozie także istnieje punkt kontrolny wrzeciona.

Kohezyna mejotyczna - połączenie siostrzanych chromatyd aż do przejścia Metafaza/Anafaza. W metafazie proteoliza kohezyny między ramionami - chromatydy połączone tylko w centromerach.

• Do końca metafazy chromosomy połączone w biwalent

- w mejozie z crossing-over dzięki chaiazmom + kohezyna

- w mejozie achiazmatycznej dzięki nie rozpadnięciu się kompleksu synaptonemalnego.

• Podczas Anafazy I kohezyny w centromerach nie ulegają proteolizie

• Kinetochory 2 siostrzanych chromatyd współzorientowane - biegną do jednego bieguna wrzeciona.

Aurora B razem z kohezyną usytuawia się w chromosomach między centromerem, a chiazmą, nie przy samym centromerze.

Fosforylacja kohezyny Aurorę B może ją uwrażliwiać na działanie separazy MPF

Podczas mejozy pewna pula cykliny B jest aktywna.

Funkcja	Składniki		Lokalizacja w kinetochorze
	Strukturalna	Cenp-A Cenp-C		Odnalezione na zewnątrz DNS; syntetyzowane w fazie S	Domena wewnętrzna
	Motoryczna	Dyneina - dynaktyna Cenp-E (kinezyna katastroficzna +)		Domena zewnętrzna i część fibrylarna.
	Punkt kontrolny wrzeciona			MAD2 - Mitotic Arrest Deficient Bub1- Kinezyna fosforylująca MAD2		Domena środkowa (obecne tylko przed połączeniem Z MT)
	Nukleacja mikrotubul MTOC			γ - tubulina (tylko u roślin)

1

---