Przeciwciała.

Cząsteczka przeciwciała składa się z dwóch lekkich i dwóch ciężkich łańcuchów polipeptydowych. Geny kodujące łańcuchy lekkie i ciężkie znajdują się na różnych chromosomach i posiadają własne mechanizmy generowania zmienności. Na N-końcach wszystkich łańcuchów znajdują się tzw. regiony zmienne,(oznaczane V_L i V_H odpowiednio dla łańcucha lekkiego i ciężkiego) odpowiedzialne za utworzenie miejsca rozpoznającego antygen. W obrębie regionu zmiennego większość zmienności, zarówno w wypadku łańcucha ciężkiego jak i lekkiego, koncentruje się w trzech regionach zwanych CDR1-3(complementarity determinning regions - regiony określające komplementarność). Pozostałe fragmenty sekwencji(tzw. zrąb, framework) mogą posłużyć do pogrupowania regionów zmiennych na podstawie ich podobieństwa lub nawet identyczności. C-końcowe części łańcuchów to regiony stałe, oznaczane C_L i C_H odpowiednio dla łańcucha lekkiego i ciężkiego

Istotnym w kontekście niniejszego artykułu jest zagadnienie źródła zmienności przeciwciał. Pierwszym czynnikiem determinującym tą zmienność jest ilość genów kodujących przeciwciała. Łańcuch lekki jest kodowany do 95 aminokwasu przez segment genów V, zawierający 35 potencjalnie funkcjonalnych genów(geny te są używane alternatywnie), dalsza część regionu zmiennego kodowana jest przez segment 5 genów J. Dla porównania, część stała łańcucha kodowana jest tylko przez jeden gen. W wypadku łańcucha również występuje zestaw genów V, ale każdemu z siedmiu genów C, kodujących część stałą łańcucha towarzyszy jeden gen J.

Wśród genów kodujących część zmienną łańcuchów ciężkich pomiędzy segmentami V i J występuje dodatkowy segment genów D, bardzo zróżnicowany pod względem liczby kodonów i sekwencji par zasad. Większa liczba genów D może się łączyć wydłużając kodowany fragment, dodatkowo geny te mogą być sczytywane w trzech ramkach odczytu bez generowania kodonu stop. U człowieka odkryto 30 genów D i kilkadziesiąt genów V. Rekombinacja segmentów VDJ decyduje o zmienności regionu CDR-3.

Rekombinacja genów pochodzących z kolejnych segmentów zachodzi w sposób przypadkowy, co samo w sobie jest źródłem zmienności, a dodatkowo nie jest ściśle zachowana długość łączonych genów, tzn. w łańcuchu lekkim aminokwas 96 jest kodowany przez kodon powstały z przypadkowego połączenia nukleotydów regionów V i J , natomiast w łańcuchy ciężkim zjawisko to może dotyczyć aż 10 nukleotydów na pograniczu pomiędzy genami D i J. Co więcej, enzym zwany końcową deoksynukleotydylotransferazą może dodawać w trakcie rekombinacji do końców -N regionów dodatkowe, przypadkowe nukleotydy bez obecności matrycy.

Ogromnie istotne jest nieustanne pojawianie się mutacji somatycznych w omawianych genach już po zakończeniu rekombinacji, co dodatkowo różnicuje przeciwciała. Zasadniczo źródłem zmienności CDR-1 są mutacje somatyczne, zmienność CDR-2 jest kodowana genomowo, a zmienność CDR-3 powstaje w wyniku rekombinancji. Być może u człowieka, podobnie jak u pewnych ssaków, występuje dodatkowo zjawisko konwersji genowej, polegające na wbudowywaniu się pseudogenów w regiony V i J. Potencjał repertuaru przeciwciał jest ogromny i przekracza o kilka rzędów wielkości liczbę limfocytów B powstających w życiu osobniczym.

Ponieważ za specyficzność przeciwciała odpowiadają głównie regiony zmienne, a z drugiej strony takie ważne zjawiska jak wydajna ekspresja, poprawne fałdowanie i ekspozycja cząsteczki są silnie ograniczane przez wielkość cząsteczki, to we wszelkich eksperymentach selekcyjnych in vitro pracuje się tylko na fragmentach cząsteczki przeciwciała. Dobór i skonstruowanie takich fragmentów nie jest zadaniem łatwym ani nie pozostaje bez wpływu na wyniki selekcji. Dwa najczęściej stosowane rodzaje fragmentów przeciwciał to fragment Fab, gdzie wykorzystywane są tylko domeny zmienne i pierwsze domeny stałe łańcuchów ciężkiego i lekkiego, i fragment scFv, gdzie wykorzystywane są tylko domeny zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego połączone polilinkerem. Polilinker jest niezbędny dla zapewnienia trwałości połączenia obu domen, podczas asocjacji których nie powstaje żadne wiązanie kowalencyjne, w takim przypadku mamy do czynienia z nietrwałym fragmentem Fv. Nie brak prób wprowadzenia bardziej rozbudowanych fragmentów przeciwciał do arsenału metod selekcji, takich jak diabodies czy triabodies.

Inne niż przeciwciała cząsteczki stosowane do selekcji elementów polipeptydowych o dużym powinowactwie nazywane są protein scaffolds (engineered scaffolds). Dobierane są one pod względem rozmiaru, stabilności i łatwości produkcji. Najczęściej stosowane są domeny fibronektyny typu trzeciego i syntetyczna ankiryna, ale wciąż trwają poszukiwania innych domen białkowych mogących służyć za rusztowanie dla selekcjonowanych polipeptydów.

Rodzina receptorów Toll

Każdy żywy organizm, aby utrzymać integralność i równowagę wewnętrzną, musi posiadać zdolność do rozpoznawania i unieszkodliwiania substancji stanowiących zagrożenie. Aby skutecznie móc pełnić tę funkcję, ewolucja zaopatrzyła nas w grupę białek odpowiedzialnych za rozpoznanie niebezpieczeństwa. Czytelnik z pewnością pomyśli w pierwszej kolejności o przeciwciałach. Przeciwciała to bardzo precyzyjna broń, ale w pierwszych etapach infekcji po prostu niedostępna. Powód jest prosty: zbyt dużo czasu (co najmniej kilka dni) zajmuje proliferacja limfocytów i synteza odpowiednich przeciwciał. Pod względem szybkości reakcji znacznie bardziej skuteczne są komórki dendrytyczne, tuczne i makrofagi. To one zostały zaopatrzone w broń "pierwszego kontaktu" pozwalającą na natychmiastowe rozpoczęcie działań obronnych i w wielu przypadkach na opanowanie infekcji bez angażowania limfocytów. Tą bronią są receptory należące do rodziny białek Toll. Rozpoznają one wzorce molekularne charakterystyczne dla określonego rodzaju patogenu (ang. Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMP) [1]. Przykładami PAMPs są lipopolisacharyd (LPS) występujący w błonie zewnętrznej bakterii gram-ujemnych, dwuniciowy RNA wirusów, niemetylowane wyspy CpG w DNA bakterii, wirusów i pierwotniaków, itd. Rozpoznanie takich molekularnych wzorców to sygnał do rozpoczęcia obrony.

Krótka historia odkrycia rodziny receptorów Toll

Przygoda z receptorami Toll rozpoczęła się w latach 80-tych, kiedy odkryto szereg genów i białek biorących udział w kształtowaniu osi grzbietowo-brzusznej embrionu Drosophila melanogaster. Jedno z tych białek, będące receptorem, nazwano Toll [2]. Przez długi czas wydawało się, że pełni ono rolę tylko w procesach rozwojowych. W 1996 roku ukazał się w czasopiśmie "Cell" artykuł stwierdzający znaczącą rolę receptora Toll w odpowiedzi przeciwgrzybiczej dorosłego osobnika [3]. Po tym odkryciu w 1997 roku zidentyfikowano ludzki gen będący homologiem genu kodującego białko Toll muszki owocowej. Ze względu na swoje podobieństwo do Toll, białko to nazwano Toll-like 4 (TLR4) [4,5]. Artykuł ukazał się w "Nature" i był przełomem w badaniach nad tymi receptorami oraz odpornością wrodzoną. Od tego momentu nasza wiedza na temat tych bardzo interesujących białek szybko zaczęła się powiększać.

Przedstawiciele rodziny receptorów Toll

Białka te zostały zgrupowane w jedną rodzinę ze względu na ich molekularną budowę. Należy podkreślić zaskakująco wysoką ewolucyjną konserwatywność tych receptorów. Białka o podobnej strukturze odnaleziono w wielu organizmach, począwszy od prostych do bardzo złożonych. Domeny charakterystyczne dla Toll pojawiają się również w innych rodzinach białek np. receptorów dla Interleukiny-1. Bardzo podobną budowę mają niektóre białka roślin (posiadają domeny LRR i TIR!), na przykład DRgN (ang. disease-resistance gene N) [6]. Ze względu na szerokie występowanie tych samych konserwatywnych fragmentów o istotnych funkcjach stworzono superrodzinę, do której należą również receptory Toll [7]. Wśród bezkręgowców, organizmem o najlepiej poznanej budowie i funkcjach receptorów Toll jest Drosophila melanogaster. W genomie muszki owocowej zidentyfikowano do tej pory 9 genów kodujących białka należące do rodziny Toll (nazwano je numerując kolejno Toll1, Toll2, itd.). Wszystkie te receptory biorą udział w rozwoju embrionalnym muszki, natomiast (oprócz receptora Toll1) nie udało się udowodnić, że pełnią również rolę w obronie organizmu przed patogenami. Białka te występują u wszystkich owadów, które pod tym względem przebadano. Przykładowo, 10 genów odkryto w genomie Anopheles gambiae'Caenorhabditis elegans posiada w swoim genomie tylko jeden gen tol-1 [10], będący homologiem receptora Toll. Białko TOL-1 pojawia się głównie w układzie nerwowym, a C. elegans charakteryzuje się specyficznym zachowaniem. Potrafi unikać bakterii, które są dla niego niebezpieczne np. Serratia marcescens. To pozwala przypuszczać, że być może białko to pełni rolę w kontroli zachowania organizmu w sytuacji zagrożenia. Byłaby to więc obrona przez odpowiednią reakcję całego ciała, a nie, jak to jest u większości organizmów, obrona prowadzona przez wyspecjalizowane komórki już po wtargnięciu obcej substancji do wnętrza ciała [11,12]. Receptory należące do rodziny białek Toll pojawiają się również u kręgowców, ale w obrębie tej grupy nazywane są białkami Toll-podobnymi (ang. Toll-like receptors, TLR). Zidentyfikowano 11 funkcjonalnych genów kodujących receptory Toll-like u myszy i 10 genów u człowieka [13]. Ich nazwy utworzone zostały przez numerację kolejnych receptorów np. TLR1, TLR2 itd. Występowanie ich stwierdzono również u szczura, Xenopus laevis, Danio rerio i innych kręgowców. Przekonanie o znaczącej roli tych receptorów w układzie odpornościowym jest w przypadku kręgowców mocno ugruntowane. Intrygujący jest natomiast brak dowodów na ich udział w rozwoju embrionalnym (tylko u Xenopus laevis stwierdzono udział białka MyD88 związanego z receptorami Toll-like, co nie dowodzi jednak udziału samych receptorów [14]), odwrotnie niż to jest w przypadku Drosophila melanogaster.

Budowa

Rodzina receptorów Toll to transbłonowe białka posiadające dwie charakterystyczne domeny (rys. 1). Zewnątrzkomórkowa domena występującą na N-końcu receptora zawiera powtórzenia bogate w leucynę (ang. leucine-rich repeats, LRR), każde o długości 24 - 29 aminokwasów i zawierające motyw XXLXLXX. Domena ta charakteryzuje się również występowaniem jednego lub kilku regionów bogatych w cysteinę. Wewnętrzkomórkowa domena na C-końcu receptora o długości około 200 aminokwasów, nie posiadająca aktywności enzymatycznej, wykazuje duże podobieństwo do domeny wewnątrzkomórkowej występującej w receptorach dla Interleukiny-1, dlatego nadano jej nazwę Toll/IL-1R (TIR). Domena TIR jest bardzo starą ewolucyjnie domeną odpowiedzialną za interakcję białko - białko (rys. 2,3) [15,16].

Ligandy

Mimo wielu podobieństw, między receptorami Toll bezkręgowców a receptorami Toll-like kręgowców są również różnice, zwłaszcza w wiązanych przez nie rodzajach ligandów. Receptor Toll1 muszki owocowej wiąże białko Spätzle, pocięte wcześniej przez specyficzne proteazy aktywowane kaskadowo przez obce ciała. Receptor ten nie jest więc aktywowany bezpośrednio przez obce cząsteczki, w przeciwieństwie do TLR kręgowców. Receptory Toll-like rozpoznają obecność charakterystycznych wzorców molecularnych patogenów. Na przykład TLR4 wraz z białkiem MD-2 (białko związane z rodziną receptorów Toll ze względu na podobną budowę), związanym z domeną zewnątrzkomórkową receptora, rozpoznaje LPS oraz ewolucyjnie konserwatywne związki pochodzenia endogennego: białka szoku cieplnego (HSP60, HSP70, HSP90 i HSPGp96) oraz fragmenty białek i proteoglikanów substancji międzykomórkowej. TLR5 wiąże białko flagellinę występujące w wiciach bakterii. Z kolei reakcja na dwuniciowy RNA wirusów jest zależna od receptora Toll-like 3, a niemetylowane motywy CpG-DNA wiążą się do TLR9. Nieznane są jeszcze naturalne ligandy dla receptorów TLR7, TLR8 i TLR10. TLR1 i TLR6 tworzą heterodimery z TLR2, w wyniku czego mogą rozpoznawać wiele różnych wzorców molekularnych. Heterodimer utworzony z TLR2 i TLR6 rozpoznaje lipopeptydy mykoplazm (zawierające dwie reszty kwasów tłuszczowych) i składniki ściany komórkowej drożdży (Zymosan). TLR2 wspólnie z TLR1 wiąże lipopeptydy bakteryjne (zawierające trzy reszty kwasów tłuszczowych). Receptor Toll-like 2 jest również niezbędny do rozpoznawania peptydoglikanu bakterii Gram-dodatnich, aczkolwiek nie jest jeszcze znany partner, który mógłby utworzyć z nim heterodimer o takiej specyficzności. Sugeruje się, że może być to receptor Toll-like 10 [20-22]. Rozpoznanie tych wzorców prowadzi do aktywacji receptora i w wyniku tego szeregu białek związanych z nim wewnątrz komórki, co prowadzi do przekazania sygnału do jądra komórkowego i ekspresji wielu różnych genów. Jedna z dróg przekazywania sygnału jest charakterystyczna dla wszystkich receptorów Toll-like i została najwcześniej poznana. Tę drogę nazwano zależną od białka MyD88 i ona będzie omawiana w dalszej części pracy [7,13,15,16]. Należy jednak podkreślić, że oprócz drogi zależnej od MyD88, konkretny receptor może przekazać swój specyficzny sygnał za pomocą odrębnych szlaków.

Mechanizm przekazywania sygnału

Po związaniu liganda do receptora Toll-like następuje kaskadowa aktywacja wielu białek, głównie kinaz serynowo-treoninowych. Dzieje się to za pośrednictwem białka adaptorowego MyD88 (ang. myeloid-differentiation marker) [7]. Schemat drogi przekazywania sygnału zależnej od białka MyD88 przedstawia rys. 4. Białko MyD88 jest niezbędne do zaistnienia reakcji zapalnej powstałej w wyniku aktywacji wszystkich receptorów Toll-like. Zbudowane jest ono z domeny TIR znajdującej się na C-końcu i domeny śmierci (ang. death domain, DD) występującej na końcu N. Wzajemne interakcje domen TIR receptora Toll-like i białka MyD88 oraz domen śmierci MyD88 i kinazy IRAK4 (ang. IL-1RI-associated protein kinases) indukują autofosforylację tego enzymu. IRAK4 jest przedstawicielką rodziny kinaz serynowo-treoninowych, do której należą cztery białka. IRAK4 po aktywacji fosforyluje przy okazji swoją kuzynkę - kinazę IRAK1. Równocześnie z aktywacją kinaz IRAK następuje rekrutacja do receptorowego kompleksu białka TRAF6, należącego do rodziny czynników związanych z receptorami dla czynnika nekrozy nowotworów (ang. tumor necrosis factor receptor-associated factor). Ufosforylowana kinaza IRAK1 wraz ze związanym z nią TRAF6 oddziela się od receptora, a następnie wiąże z kompleksem składającym się z kinazy TAK1 (ang. TGF-ß-activated kinase) oraz dwóch białek TAB1 i TAB2 (ang. TAK1-binding proteins). Nieaktywny kompleks pozostaje związany z błoną komórkową. Po przyłączeniu się białek IRAK1 i TRAF6 do kompleksu następuje jego uwolnienie z błony (oprócz IRAK1, która ulega degradacji). W cytoplazmie do kompleksu przyłączają się dwie ligazy Ubc13 i Uev1A katalizujące poliubikwitynację lizyny 63. Przyłączenie ubikwityn do TRAF6 aktywuje kinazę TAK1, która fosforyluje i aktywuje kompleks trzech podjednostek IKKs (ang. IkappaB kinases): dwóch podjednostek katalitycznych IKKalfa, IKKbeta i jednej podjednostki regulacyjnej NEMO/IKKgamma, oraz kinazę MKK6. Kompleks IKK fosforyluje białko rodziny inhibitorów NFkappaB - IkappaB, co powoduje jego rozpad i uwolnienie czynnika transkrypcyjnego NFkappaB, który teraz bez przeszkód może przedostać się do jądra [15,16,23]. Dodatkowo, kinaza MKK6 aktywuje kinazy JNK i p38, wszystkie należące do rodziny MAP kinaz (ang. mitogen activated protein), włączających następnie czynnik transkrypcyjny AP-1 [23]. Czynnik transkrypcyjny NFkappaB reguluje ekspresję wielu genów, m.in. aktywuje syntezę cytokin prozapalnych takich jak Interleukina 1, 6, 12, TNFalfa oraz chemokin (IL-8, RANTES i IP-10). Wzmaga także produkcję białek kompleksu zgodności tkankowej MHC oraz cząsteczek kostymulujących, takich jak CD40, CD80 i CD86. Poza tym reguluje ekspresję cykliny D1 i czynników antyapoptotycznych, co np. pozwala limfocytom rozpocząć proliferację i produkcję przeciwciał po stymulacji dodatkowymi czynnikami [21,23,24]. Transdukcja sygnału od receptora do jądra u muszki owocowej przebiega bardzo podobnie. Na każdym etapie tego procesu, białka występujące u ssaków posiadają swoje odpowiedniki u muszki owocowej, np. ssacze białko adaptorowe MyD88 ma swój homolog nazwany dMyD88. Podobnie, homologiem rodziny kinaz IRAK jest kinaza Pelle. Nawet czynnik transkrypcyjny DIF i jego inhibitor Cactus są homologami odpowiednio czynnika NFkappaB i IkappaB [8,9,11]. Sugeruje to, że szlak przekazywania sygnału przez receptory Toll został przetarty w dalekiej przeszłości i musi być niezwykle istotny, skoro ewolucja nie zmieniła go znacząco przez miliony lat.

Rodzina receptorów Toll to grupa białek pochodzących od wielu często odległych filogenetycznie gatunków, charakteryzująca się bardzo podobnym schematem budowy samych receptorów, jak i podobnym szlakiem przekazywania sygnału do wnętrza komórki. Wskazuje to na dużą konserwatywność ewolucyjną tych białek oraz na ich bardzo ważną funkcję w organizmie. Zarówno u muszki owocowej, jak i u człowieka są one elementem układu odpornościowego. Są niezbędne do zainicjowania odpowiedzi obronnej organizmu. Regulują pierwsze etapy tego procesu i decydują o wyborze drogi na jaką powinien wstąpić organizm w dalszych etapach obrony. Są również ważne podczas pierwszych etapów rozwoju, kontrolując tworzenie podstawowego planu budowy ciała. Pomimo ogromnego postępu, jaki dokonał się w ostatnich latach w badaniach receptorów Toll i Toll-like, wiele pytań pozostaje nadal bez odpowiedzi.

Białka ostrej fazy w reakcjach układu immunologicznego i diagnostyce chorób.

Pojęcie ostrej fazy wprowadzili w 1914 r. Abernethy i Avery. Opisali właściwości osocza gorączkującego chorego, które zawierało białka ostrej fazy.

Białka ostrej fazy to heterogenna grupa białek osocz, o niewielkich masach cząsteczkowych, których poziom zmienia się w przebiegu stanów zapalnych . Pełnią ważną role w odporności wrodzonej przeciwko mikroorganizmom ( szczególnie bakteriom i pierwotniakom ). Ograniczają uszkodzenia tkanek powodowane przez infekcje, urazy, nowotwory oraz inne choroby jak np. reumatoidalne zapalenie stawów. Cząsteczki uczestniczą także w samej naprawie tych tkanek. Poza tym ich poziom wzrasta także w przypadku procesów martwiczych takich jak oparzenia, czy zawał mięśnia sercowego.

Białka ostrej fazy to liczna grupa, w której znajdują się cząsteczki o różnorodnym działaniu.

BIAŁKO	FUNKCJE
CRP (białko C- reaktywne)	opsonina; aktywator dopełniacza
MBP (białko wiążące mannozę)	opsonina; aktywator dopełniacza
SAA (surowiczy amyloid A)	opsonina
AAT ( encja a1- antytrypsyna)	inhibitor proteaz (głównie elastazy uwalnianej z granulocytów wielojądrzastych)
CER (ceruloplazmina)	katalizuje utlenianie Fe i umożliwia jego wiązanie z transferyną; antyoksydant ochraniający tkanki w stanach ostrej fazy; akceptor jonów Cu
HAP (haptoglobina)	wiąże nieodwracalnie wolną hemoglobinę zabezpieczając przed nią nerki; oszczędza Fe
fibrynogen	bierze udział w krzepnięciu krwi
białka wiążące metale	usuwają jony metali niezbędne do wrostu bakterii
dopełniacz	udział w chemotaksji, opsonizacji i lizie

• Tabela 1. Główni przedstawiciele APP.

3. MIEJSCE SYNTEZY

W 1951r. Miller i współpracownicy wykazali, że APP syntezowane są przez hepatocyty, w odpowiedzi na produkty rozpadu uszkodzonych tkanek, cytokiny produkowane przez aktywowane limfocyty oraz interferon- g uwalniany z makrofagów i komórek NK. Białka ostrej fazy wytwarzane są w wątrobie de novo (synteza CRP wzrasta ponad 1000- krotnie w ciągu paru godzin) lub są obecne w bardzo małym stężeniu, które gwałtownie wzrasta w czasie infekcji ( fibrynogen ).

Główne cytokiny odpowiedzialne za idukcję syntezy APP to: IL- 6, IL- 1 oraz TNF. Wydzielanie APP na skutek działania IL- 6 odbywa się poprzez fosforylację czynnika transkrypcyjnego NF- IL6, który w wyniku takiej modyfikacji transportowany jest do jądra komórkowego, gdzie aktywuje transkrypcję genów dla APP. Natomiast IL- 1 i TNF fosforylują, a tym same degradują KB ( inhibitor czynnika transkrypcyjnego NFkB ) powodując uwolnienie NFkB i aktywację genów APP w jądrze komórkowym.

4. FUNKCJE APP

Fenomen ostrej fazy polega na odpowiedzi całego organizmu w wyniku toczącego się zapalenia, niezależnie od miejsca, w którym stan zapalny występuje. Białka ostrej fazy wpływają nie tylko na działanie układu immunologicznego ale także na wiele innych procesów np. wzrost wydzielania niektórych hormonów ( ACTH, glukokortykosteroidy ). Priorytetowe działanie APP polega na przywracaniu homeostazy organizmu, stąd też wynikają pozostałe funkcje pełnione przez opisywane cząsteczki:

1. wzmożona aktywacja układu dopełniacza,

2. opsonizacja mikroorganizmów,

3. ograniczanie uszkodzeń tkanek powodowanych przez bakterie oraz enzymy lizosomalne z komórek fagocytujących,

4. działanie chemotaktyczne.

5. GŁÓWNE APP CZŁOWIEKA

Białka ostrej fazy są różne gatunkowo. U człowieka podczas stanu zapalnego wzrasta poziom głównie dwóch białek: CRP oraz MBP.

CRP- nazwa cząsteczki pochodzi od zdolności reagowania z polisacharydem C pneumokoków. Białko to jest pentamerem zbudowanym z identycznych podjednostek, które syntezowane są w wątrobie. Stężenie CRP u zdrowych ludzi wynosi 1-10 mg/L, natomiast przy zakażeniu jego stężenie wzrasta nawet 1000 razy w ciągu 24-48 godzin, wyprzedzając tym samym w niektórych przypadkach objawy kliniczne.

Monitoring poziomu CRP może być użyteczny w śledzeniu takich schorzeń jak toczeń rumieniowaty, czy białaczki. Może być także stosowany jako wskaźnik odrzutów przy przeszczepach, a wysokie stężenie CRP we krwi pępowinowej świadczy o zakażeniu wewnątrzmaciczym.

CRP działa jako opsonina oraz aktywator układu dopełniacza na drodze klasycznej ( wiąże się ze składnikiem C1q ). Poza tym posiada zdolność wiązania się z DNA i innymi składnikami jądrowymi, co ułatwia usunięcie komórek patogenów z organizmu gospodarza.

MBP posiada podobne właściwości- opsonizuje drobnoustroje i aktywuje dopełniacz na drodze klasycznej. Konkretnie białko to posiada zdolność do wiązania się z mannozą glikoprotein oraz glikolipidów, występujących na powierzchni patogenów w nieco innej formie niż na powierzchni komórek gospodarza.

7. DIAGNOSTYCZNA ROLA APP

Śledzenie zmian poziomu mediatorów ostrej oraz samych białek ostrej fazy może być użytecznym sposobem w diagnostyce niektórych chorób. CRP może być samodzielnym czynnikiem prognostycznym w alkoholowych uszkodzeniach wątroby. Chorobie tej towarzyszy również podwyższony poziom TNF- a . Ta dysregulacja jest przyczyną powikłań metabolicznych, w wyniku których TNF staje się cytotoksyczny dla wątroby. Nadwrażliwość na TNF związana jest z nieadekwtną produkcją czynników hepatoprotekcyjnych. Białka ostrej fazy służą także w diagnostyce chorób genetycznych. Niski poziom ceruloplazminy ( poniżej 0,1g/L ) i wysokie stężenie dializowanej miedzi są wskaźnikami decydującymi o rozpoznaniu choroby Wilsona. Jest to bardzo rzadkie zaburzenie metaboliczne, spowodowane recesywną mutacją na chromosomie 13, w wyniku której chory nie posiada ceruloplazminy lub białka transportującego miedź. Wskutek tego upośledzone jest wydalanie miedzi z żółcią. Odkładający się w organizmie pierwiastek powoduje uszkodzenia wątroby, nerek i mózgu. Choroba ta objawia się dopiero u starszych dzieci, dlatego tak ważne jest jej szybke rozpoznanie. Daje to możliwość skutecznego leczenia pacjentów preparatami wiążącymi miedź ( np. penicylamina ).

Nanociała - od lamy do leku.

Człowiek od lat próbuje ujarzmić system immunologiczny, który czasem reaguje zbyt wolno w walce z wirusami czy bakteriami lub zwyczajnie nie dostrzega zagrożenia ze strony zdradliwych komórek nowotworowych, a innym razem reakcja jego, na przykład podczas odrzuconego przeszczepu, jest zbyt agresywna. W 1975 roku opracowano metodę produkcji przeciwciał monoklonalnych, które wydawały sie wreszcie odpowiednią "bronią" przeciwko chorobom systemu immunologicznego. Nadzieje te jednak zostały dość szybko ostudzone, gdyż produkcja przeciwciał monoklonalnych jest skomplikowana i wyjątkowo kosztowna. Cena rocznej kuracji trastuzumabem (herceptyną), skutecznego leku na raka piersi wynosi 38 tysięcy dolarów, omalizumab (xolar) stosowany u astmatyków kosztuje 11 tysięcy dolarów, a terapia infliksymabem (remicade) lekiem wykorzystywanym w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów wynosi ponad 4,5 tysiąca dolarów. Wysoka cena przeciwciał monoklonalnych wynika głównie z ich skomplikowanej struktury. Każde przeciwciało monoklonalne zbudowane jest z czterech łańcuchów: dwóch lekkich i dwóch ciężkich, dodatkowo posiadają dołączone łańcuchy polisacharydowe. Produkcja przeciwciał monoklonalnych rozpoczyna się od immunizacji myszy poprzez wstrzyknięcie jej odpowiedniego antygenu, co powoduje wytworzenie odpowiednich przeciwciał z limfocytów B. Wyizolowane limfocyty ulegają fuzji z komórkami szpiczaka. Komórki szpiczaka natomiast, jako komórki nowotworowe, nadają powstałej hybrydzie "nieśmiertelność" umożliwiającą dowolnie długą hodowlę in vitro oraz dostarczają wielu rybosomów i dobrze rozwiniętego aparatu Golgiego- co umożliwia wytwarzanie dużych ilości białek.

Niektóre firmy produkują przeciwciała monoklonalne poprzez izolacje i humanizację sekwencji DNA kodującej białko. Proces humanizacji pochłania wiele czasu, a powstałe ostatecznie cząsteczki są tak skomplikowane, że ich synteza z prostych składników nie jest możliwa. Dlatego też kolejnym minusem przeciwciał monoklonalnych jest konieczność stosowania skomplikowanych bioreaktorów do ich syntezy. Przeciwciała monoklonalne są nietrwałe w skrajnych pH i w wysokiej temperaturze, dlatego nie przechowywane w odpowiednich warunkach tracą swe właściwości i nie spełniają swej roli w organizmie. Również koniczność odwiedzania, przez pacjentów stosujących przeciwciała monoklonalne, klinik aby otrzymać zastrzyk może być ich kolejną wadą. Rozmiar przeciwciał monoklonalnych utrudnia im dostęp do wielu obszarów w organizmie i utrudnia działanie. Możliwe, że nawet obecnie stosowane przeciwciała monoklonalne pełniły by swe funkcje znacznie lepiej gdyby były mniejsze.

Między monoklonami a nanociałami

Pierwszą próbę zredukowania wielkości przeciwciał monoklonalnych podjeli naukowcy zajmujący się inżynierią białkową. Odcieli oni fragment Fc przeciwciała odpowiedzialny między innymi za aktywację limfocytów T cytotoksycznych. Dlatego też same fragmenty Fab przeciwciała, czyli fragmenty wiążące dany epitop antygenu, nie były w stanie spełniać tej funkcji. Mimo wszystko, przeciwciała z odciętym fragmentem Fc przynoszą wymierne korzyści, gdyż zachowują one zdolność wiązania cząsteczek, toksyn czy patogenów, a ich produkcja jest możliwa przez bakterie, drożdże i inne grzyby, co znacząco obniża koszty stosowania. Fragmenty Fab są na tyle małe, że możliwe jest wniknięcie ich do wnętrza guza, co przy wykorzystaniu technologii immunotoksycznych pozwala na zniszczenie komórek rakowych. Niestety okres życia fragmentów Fab jest rzędu godzin a nie tygodni jak w przypadku pełnych przeciwciał, gdyż bardzo szybko się rozpadają i zbyt szybko przenoszą się poza naczynia krwionośne. Może to być zaletą dla przykładu opisanego powyżej, czyli oddziaływania na guza , ale w przypadku pozostałych funkcji nie jest to pożądane. Firma Domantis z Wielkiej Brytanii usunęła dodatkowo łańcuchy lekkie fragmentów Fab i pozostawiła jedynie łańcuchy ciężkie. Regiony te determinują swoistość przeciwciał, gdyż one właśnie tworzą miejsca wiążące antygen. Z tego powodu regiony te nazywa się często CDR (ang. complementarity determining region), czyli regionami determinującymi dopasowanie. Domantis nazwała swoje dzieło przeciwciałami domenowymi, są one najbardziej zbliżone wielkością do nanociał. Jednak również przeciwciała domenowe nie są idealne, przez swoją hydrofobową naturę agregują ze sobą już w fazie ich syntezy w bakterii, co obniża wydajność produkcji i utrudnia działanie.

Odkrycie i produkcja nanociał

W 1989 roku Muyldermans znalazł sie w grupie biologów prowadzonych przez Raymonda Hamersa z Universite Libre. Podczas badań prowadzonych w ramach studenckiego projektu nad zwalczaniem pasożytów przez dromadera i bawoła wodnego, uzyskano wydawało się błędne wyniki. We krwi oprócz czterołańcuchowych przeciwciał zaobserwowano dodatkowo obecność cząsteczek zbudowanych jedynie z dwóch łańcuchów ciężkich. Po paru latach badań Hamers, Muyldermans i inni opisali na łamach Nature szczegóły tego odkrycia. Tak narodziły się nanociała, a wkrótce po nich powstał w Belgii Ablynx. Dlaczego takie wyjątkowe cząsteczki powstały właśnie u wielbłądowatych? Nie jest to niestety do końca wyjaśnione. W skład rodziny wielbłądowatych, ssaków rzędu parzystokopytnych, wchodzi sześć gatunków: afrykański dromader(wielbłąd jednogarbny Camelus dromedarius) i azjatycki baktrian (wielbłąd dwugarbny Camelus bactrianus), występująca na kontynencie amerykańskim lama (Lama glama)i jej dziki przodek gwanako (Lama guanicoe) oraz alpaka (Lama pacos) i jej dziki przodek wigoń (Lama vicugna). Wielbłądowate są dobrze przystosowane do bytowania w niesprzyjających, pustynnych i wysokogórskich warunkach. Ich zdolność utraty wody może wynosić do 30% masy ciała, podczas gdy dla innych ssaków już 12% jest wielkością śmiertelną. Duża odporność na odwodnienie wynika m.in. z ich zdolności do zmiany temperatury ciała w ciągu dnia, umożliwiającej obniżenie parowania, a także z obecności odpornych na zmiany siły jonowej erytrocytów.

Produkcja nanociał rozpoczyna się od poddania immunizacji lamy, która wytwarza przeciwko danemu antygenowi zarówno przeciwciała standardowe jak i przeciwciała składające się wyłącznie z łańuchów ciężkich. Po pobraniu próbki krwi przeciwciała zawierające łańcuchy ciężkie są identyfikowane, a następnie wyodrębniana jest sekwencja DNA kodująca to przeciwciało. Ostatecznie sekwencja ta jest skracana do fragmentu zawierającego pojedynczy region zmienny łańcucha ciężkiego i już możliwa jest masowa produkcja nanociał. O łatwości ich produkcji świadczy fakt wytworzenia w 2002 roku przez holenderskich biologów z Unilever Research ponad kilograma nanociał z hodowli drożdży prowadzonej w standardowym bioreaktorze o pojemności 15 tysięcy liltrów, co odpowiada 67 mg na litr hodowli, z kolei naukowcy z Ablynx twierdzą, że są w stanie otrzymać conajmniej kilogram nanociał z litra hodowli.

Wyjątkowe cechy nanociał

Nanociała wydają się być pozbawione wad swoich "poprzedników". Zaskakującym faktem jest zdolność nanociał, pomimo nieobecności prawie połowy regionów CDR, do wiązania antygenów z takim samym powinowactwem jak dziesięć razy większych standardowych przeciwciał. W przeciwieństwie do fragmentów Fab nanociała nie zlepiają się ze sobą. Te skrócone immunoglobuliny mogą penetrować miejsca niedostępne dla zwykłych przeciwciał- centra katalityczne enzymów czy fragmenty błony komórkowej. Nie wykazują charakteru hydrofobowego jak przeciwciała domenowe, są odporniejsze na wysoką temperaturę i ekstremalne pH. Ich produkcja, ze względu na prostą budowę jest tańsza i mniej skomplikowana. Nanociała produkowane przez firmę Ablynx są stabilne w temperaturze pokojowej, co pozwala na ich długotrwałe przechowywanie bez konieczności chłodzenia. Najistotniejszą zaletą nanociał jest jednak ich zdolność do wiązania się z wieloma białkami i związkami innego typu. Zespół de Haarda "spiął" nanociała swoiście rozpoznające docelowy antygen z nanociałami przeciwko albuminie, co wydłużyło czas ich życia we krwi do wielu tygodni. Revets, Muyldermans i Patrick de Baetselier z VIB osiągnęli coś więcej. Udało im się stworzyć cząsteczkę dwuczynnościową. Mianowicie zaprojektowali nanociała tak, by wiązały się do receptorów na komórkach nowotworowych i połączyli je ze specjalnym enzymem katalizującym przekształcenie pewnego nieszkodliwego związku (prolek) w toksynę. Dzięki temu stworzone cząsteczki mogą w "spoczynku" oczekiwać na rozwój nowotworu, a następnie katalizować powstawanie toksyny, która ten nowotwór zniszczy. Doświadczenie to przeprowadzono na myszach: część z nich poddano klasycznej chemioterapii, a część terapii zmodyfikowanych nanociał. Nanociała zniszczyły tylko komórki nowotworowe, pozostawiając nienaruszone otaczające tkanki, natomiast myszy poddane chemioterapii nie zostały całkiem wyleczone (pomijając liczne, znane skutki uboczne chemioterapii). Została opracowana technika humanizacji nanociał jednak nie przeprowadzono dotychczas wymaganych badań klinicznych. Udała się również kamelizacja (ang. camelization), czyli upodobnienie ludzkich ciężkich łańcuchów do wielbłądzich domen VHH. Zaletą tego procesu jest wysoka homologia, w porównaniu do wielbłądzich przeciwciał, z ludzkimi przeciwciałami, co rozwiązuje problem wywołania odpowiedzi immunologicznej. Podczas, gdy źródłem łańcuchów VHH może być tylko wielbłąd lub lama, kamelizowane ludzkie fragmenty VHH wytwarza się in vitro.

Człowiek od lat próbuje ujarzmić system immunologiczny, który czasem reaguje zbyt wolno w walce z wirusami czy bakteriami, czasem zwyczajnie nie dostrzega zagrożenia ze strony zdradliwych komórek nowotworowych, a innym razem reakcja, na przykład podczas odrzuconego przeszczepu, jest zbyt agresywna. Kilka lat temu ogromną nadzieję wzbudziły terapię przeciwciałami monoklonalnymi. Możliwe, że teraz zostaną one zastąpione czymś doskonalszym, zarówno pod względem skuteczności jak i kosztów produkcji. Nanociała rzeczywiście wydają się być znaczącym przełomem w dotychczasowych zdobyczach immunologii. Ich prostota, tanie koszty produkcji i małe rozmiary wróżą szybsze rozwiązanie wielu problemów nękających naukowców do tej pory. Celem firmy Ablynx jest zastąpienie dotychczas stosowanych przeciwciał monoklonalnych w terapii nowotworów, reumatoidalnego zapalenia stawów i astmy swoim produktem. Do czasu przeprowadzenia testów klinicznych nie jesteśmy jednak w stanie stwierdzić, czy rzeczywiście się to uda. Przeprowadzone badania nad myszami i nad pawianami dostarczają pozytywnych wyników, jednak nie możemy być do końca pewni jak zachowa się skomplikowany ludzki system immunologiczny.

Komórki dendrytyczne w terapii, czyli jak zaprogramować organizm do walki z nowotworem

• Komórki dendrytyczne (dendritic cells, DC) to populacja komórek układu immunologicznego, odgrywająca kluczową rolę w odpowiedzi na wniknięcie patogenu. Odkrycia tej grupy komórek dokonał w 1868 roku niemiecki anatom Paul Langerhans, który obserwując pod mikroskopem skrawki skóry barwione przy pomocy chlorku złota zauważył charakterystyczne komórki o dendrytycznych wypustkach. Na cześć odkrywcy komórki te nazwane zostały komórkami Langerhansa. Oprócz skóry, komórki dendrytyczne zidentyfikowane zostały również w innych tkankach, zwłaszcza tych, które najbardziej narażone są na kontakt ze środowiskiem zewnętrznym, m. in. w płucach, błonie śluzowej przewodu pokarmowego oraz we krwi, gdzie wyodrębnić można dwie subpopulacje komórek dendrytycznych - komórki mieloidalne i plazmocytoidalne, różniące się rodzajem receptorów powierzchniowych oraz profilem produkowanych cytokin.

• Mimo ogromnej różnorodności komórek dendrytycznych, wszystkie łączy spełnianie tej samej funkcji w organizmie - prezentacji antygenu limfocytom T (są to tzw. komórki APC - antigen presenting cells). Oprócz komórek dendrytycznych funkcje tę pełnić mogą także makrofagi oraz limfocyty B, jednak prezentacja antygenu przez komórki dendrytyczne jest najefektywniejsza.

• Obecne w narządach komórki dendrytyczne to tak zwane stadium niedojrzałe (immature dendritic cells, iDC), charakteryzujące się bardzo dużymi zdolnościami do fagocytozy i małym potencjałem do aktywacji limfocytów T. Gdy w fagocytowanym płynie znajdzie się bakteria lub jej fragmenty, komórka dendrytyczna rozpoznaje je dzięki receptorom TLR, ulega aktywacji i dojrzewa. Dojrzała komórka dendrytyczna (mature dendritic cell, mDC) przestaje fagocytować, a na jej powierzchni pojawia się cała gama cząsteczek powierzchniowych, między innymi receptorów dla chemokin (substancji przyciągających komórki) i dojrzała komórka dendrytyczna migruje do najbliższego węzła chłonnego. Pochłonięty przez komórkę antygen, którym może być na przykład białko bakteryjne, ulega wewnątrzkomórkowej obróbce, przyłączeniu do cząsteczki MHC klasy II oraz prezentacji na powierzchni komórki. W węźle chłonnym tak przekształcony antygen może zostać zaprezentowany specyficznemu, naiwnemu limfocytowi pomocniczemu Th, co zapoczątkowuje powstanie odpowiedzi immunologicznej, specyficznej wobec prezentowanego antygenu. Jednak do skutecznej aktywacji limfocyt Th potrzebuje aż trzech sygnałów:

• Sygnał I: rozpoznanie antygenu połączonego z MHC II przez receptor TCR i cząsteczkę CD4;

• Sygnał II: połączenie cząsteczek CD80/86 na powierzchni komórki dendrytycznej z CD28 na powierzchni limfocytu;

• Sygnał III: połączenie receptora CD40 na komórce dendrytycznej ze swoim liganiem na powierzchni limfocytu T (CD40L) lub stymulacja interleukiną 12 (IL-12) i interferonem γ (INF- γ).

• Samo rozpoznanie antygenu przez receptor TCR (brak sygnału II. i III.) nie jest wystarczające do wywołania odpowiedzi immunologicznej - taki limfocyt przechodzi w stan anergii (braku reaktywności) i wkrótce ulega apoptozie.

• Komórki dendrytyczne zdolne są również do prezentacji antygenów w połączeniu z cząsteczkami MHC klasy I. Są to głównie antygeny pochodzące z wnętrza komórki, np. białka wirusowe. Taka prezentacja antygenu umożliwia aktywację limfocytów T cytotoksycznych (Tc) i rozpoczęcia przez nie niszczenia komórek zarażonych wirusem.

Obiecujące początki szczepionek z wykorzystaniem komórek dendrytycznych.

• Poznanie funkcji komórek dendrytycznych oraz zbadanie mechanizmu, dzięki któremu komórka dendrytyczna jest zdolna do efektywnej prezentacji antygenu zwróciło uwagę naukowców na możliwości terapeutycznego wykorzystania tych komórek, przez wszystkim do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciw antygenom nowotworowym, które zwykle nie są rozpoznawane przez komórki układu odporności. Pierwotna koncepcja terapii z wykorzystaniem komórek dendrytycznych zakładała możliwość wyizolowania tych komórek z krwi, „nakarmienie” ich antygenem nowotworowym i ponowne podanie do organizmu pacjenta w celu wywołania odpowiedzi na ten antygen. Wyniki pierwszych prób zastosowania takiej terapii zostały opublikowane w 1996r (Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells , Hsu et al.). Badania te przeprowadzono na grupie 4 pacjentów z chłoniakiem pochodzącym z limfocytów B. Nowatorska terapia polegała na wyizolowaniu z krwi obwodowej monocytów lub komórek macierzystych krwi CD34+ (obie populacje mogą być prekursorami komórek dendrytycznych) i przekształceniu ich w niedojrzałe komórki dendrytyczne, dzięki hodowli w obecności odpowiednich cytokin (IL-4, GM-CSF). Do hodowli z tak powstałymi komórkami dendrytycznymi dodawano następnie czynniki powodujące ich dojrzewanie i aktywację oraz mieszaniny antygenów nowotworowych (na przykład zlizowane komórki nowotworowe). Otrzymane dojrzałe, aktywne komórki dendrytyczne, prezentujące antygeny nowotworu podawano pacjentom w postaci szczepionki i monitorowano powstawanie odpowiedzi immunologicznej przeciw nowotworowi.

• Obecność specyficznych limfocytów T rozpoznających antygeny rakowe stwierdzono we wszystkich czterech badanych przypadkach. Mimo, iż te pionierskie badania prowadzone były na niewielkiej grupie pacjentów, dostarczyły informacji istotnych dla dalszego projektowania szczepionek z komórkami dendrytycznymi. Po pierwsze wykazano, że taka terapia może działać (odpowiedź antynowotworowa wykształciła się u wszystkich badanych pacjentów) i jest bezpieczna (jedyne efekty uboczne to niewysoka gorączka i stwardnienie w miejscu podania szczepionki). Podkreślono też znaczenie stanu komórek dendrytycznych podawanych pacjentom - tylko niewielki procent tych komórek był zdolny do migracji z miejsca podania do węzłów chłonnych, co mogło być skutkiem nieodpowiednio przeprowadzonego procesu dojrzewania.

Nowy kierunek badań.

• W miarę poszerzania wiedzy nad komórkami dendrytycznymi i identyfikacji charakterystycznych dla tej populacji receptorów powierzchniowych zaczęto zastanawiać się nad możliwością pominięcia w terapii etapu hodowli komórek dendrytycznych i „karmienia” ich antygenem poza organizmem pacjenta (ex vivo). Założeniami nowej ścieżki badań nad szczepionkami z wykorzystaniem DC było podawanie pacjentom antygenów nowotworowych w połączeniu z cząsteczkami rozpoznawanymi przez receptory obecne na powierzchni komórek dendrytycznych. Docelowe receptory, które mogłyby być celami w tak zaprojektowanej terapii musiałyby spełniać dwa warunki:

• ich występowanie powinno ograniczać się tylko do komórek dendrytycznych (w przeciwnym razie taka terapia mogłaby wywołać nieporządane efekty uboczne);

• receptory takie powinny być zaangażowane w procesy transportu antygenu do wnętrza komórki (internalizacji).

RECEPTOR DOCELOWY	WYSTĘPOWANIE
Receptor mannozy	iDC (niski poziom na mDC), makrofagi, monocyty, niektóre komórki śródbłonka i nabłonka, mięśnie gładkie tchawicy
CD205	mDC (niski poziom na iDC), komórki nabłonka grasicy, monocyty, limfocyty B, T, komórki NK
DC-SIGN	iDC (niski poziom na mDC), monocyty, megakariocyty
LOX-1	iDC, makrofagi, fibroblasty, komórki mięśni gładkich, komórki śródbłonka
Dektyna-1	iDC (niski poziom na mDC), monocyty, makrofagi, neutrofile, eozynofile, limfocyty B, niektóre limfocyty T
FcγR	mDC (niski poziom na iDC), monocyty, makrofagi, neutrofile, eozynofile
CD11c-CD18	DC, monocyty, makrofagi, granulocyty, komórki NK, zaktywowane limfocyty B
MACI	DC, monocyty, makrofagi, granulocyty, komórki NK
CD40	DC, limfocyty B, makrofagi, komórki śródbłonka, keratynocyty, fibroblasty, komórki nabłonka grasicy, hematopoetyczne komórki prekursorowi CD34+

Tabela 1. Niektóre receptory wykorzystywane w badaniach nad szczepionkami z komórkami dendrytycznymi.

• Antygen, który dzięki połączeniu z receptorem za pośrednictwem ligandu lub przeciwciała, dostałby się do wnętrza komórki, ulegałby odpowiedniej obróbce i przyłączeniu do cząsteczek MHC. Kompleksy MHC-antygen prezentowane na powierzchni komórki dendrytycznej limfocytom T powodowałyby aktywacje limfocytów i powstanie specyficznej odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom nowotworu.

• Komórki dendrytyczne posiadają unikalną wśród komórek APC możliwość prezentacji antygenów egzogennych równocześnie w połączeniu z cząsteczkami MHC II (co jest zjawiskiem typowym) oraz MHC I (w połączeniu z tą cząsteczką prezentowane są zazwyczaj antygeny wewnątrzkomórkowe). Zjawisko to określane jest jako krzyżowa prezentacja antygenu. Prezentacja antygenu w kontekście MHC II powoduje aktywację limfocytów Th, które mogą indukować odpowiedź humoralną na dany antygen (pobudzenie limfocytów B do produkcji specyficznych przeciwciał), natomiast antygeny prezentowane w połączeniu z MHC I mogą być rozpoznane przez limfocyty Tc, co prowadzi do wykształcenia odpowiedzi cytotoksycznej. Celem projektowanej terapii z wykorzystaniem komórek dendrytycznych powinno być więc takie podanie antygenu, aby był on prezentowany przez obie klasy cząsteczek MHC.

• Najbardziej obiecujące badania prowadzone są nad trzema receptorami:

• Receptor mannozy;

• DC-SIGN (CD209);

• CD205 (DEC205).

• Receptory te należą do rodziny receptorów dla lektyn typu C (CLR, C-type lectin receptors). Są to powierzchniowe receptory transmembranowe (przechodzące przez błonę komórki), zdolne do specyficznego rozpoznawania reszt węglowodanowych i zaangażowane w transport substancji do wnętrza komórki. Występują na wielu typach komórek dendrytycznych. Terapia z wykorzystaniem tej rodziny receptorów wykorzystuje dwa mechanizmy:

• internalizację antygenu połączonego z liganiem rozpoznawanym przez receptor;

• pochłanianie antygenu przyłączonego do przeciwciała skierowanego specyficznie przeciwko określonemu receptorowi.

• Receptor mannozy:

• Badania kliniczne nad wykorzystaniem tego receptora w terapii prowadzono głównie na pacjentach z zaawansowaną chorobą nowotworową piersi, dwunastnicy, żołądka i jelita grubego. Chorym podawano ligandy dla tego receptora (mannan lub mannozę) połączone z antygenem specyficznym dla danego typu nowotworu. Terapia taka skutkowała wykształceniem odpowiedzi humoralnej przeciwko podawanemu antygenowi u ponad połowy pacjentów oraz powstaniem odpowiedzi limfocytów cytotoksycznych u części z nich. Wadą tego receptora w kontekście stosowania go w tego typu terapii jest jego niska specyficzność względem ligandu oraz występowanie nie tylko na komórkach dendrytycznych, ale też na makrofagach, monocytach, niektórych typach komórek śródbłonka, a nawet na powierzchni komórek mięśni gładkich (wiąże się to z możliwością wystąpienia wielu efektów ubocznych).

• DC-SIGN (CD209):

• Możliwość wykorzystania cząsteczki DC-SIGN do dostarczenia antygenu komórkom dendrytycznym zwróciła uwagę naukowców z powodu występowania tego receptora głównie na tej subpopulacji komórek (niewielkie ilości tej cząsteczki wykryto także na makrofagach). Ograniczenie występowania DC-SIGN głównie do komórek dendrytycznych daje możliwość dokładniejszego adresowania dostarczanych antygenów, a tym samym zmniejszenie efektów ubocznych. Niestety badania nad zastosowaniem tego receptora w terapii są dosyć trudne - u myszy (głównym modelu badawczym w immunologii) DC-SIGN występuje na powierzchni DC w wielu formach, które nie są odpowiednikami ludzkich form DC-SIGN. Do tej pory prowadzone testy na ludzkich komórkach dendrytycznych w hodowli (in vitro) oraz na małpach (in vivo) wykazały, że antygen nowotworowy połączony z przeciwciałem anty-DC-SIGN był pobierany do wnętrza komórki i skutecznie prezentowany limfocytom Th i Tc.

• CD205 (DEC205):

• Główną wadą tego receptora jest jego wysoki poziom nie tylko na powierzchni komórek dendrytycznych, ale też na limfocytach B, T, monocytach, komórkach NK i komórkach nabłonka (inna nazwa tej cząsteczki to DEC - Dendritic and Epithelial Cells). Prowadzone na myszach badania wykazały jednak, że adresowanie antygenu nowotworowego do komórek dendrytycznych z wykorzystaniem CD205 powoduje bardzo skuteczną prezentację białka nowotworu przez cząsteczki MHC I i MHC II oraz powstanie odpowiedzi cytotoksycznej i humoralnej przeciwko komórkom rakowym. Badania nad DEC205 nie ograniczają się jednak do projektowania terapii antynowotworowej. Bardzo obiecujące wyniki przyniosły również testy, w których białko ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), połączone z przeciwciałem anty-DEC205 dostarczane było do ludzkich komórek dendrytycznych hodowanych in vitro i skutkowało efektywną prezentacją antygenu wirusa przez cząsteczki MHC I i MHC II (hodowane wspólnie z komórkami dendrytycznymi limfocyty T zostały aktywowane).

Do sukcesu jeszcze bardzo długa droga…

• Terapia wykorzystująca komórki dendrytyczne, mimo obiecujących wyników przeprowadzonych dotąd testów, wymaga jeszcze rozpatrzenia wielu aspektów i przeprowadzenia licznych badań. Trudności z zaprojektowaniem tego typu szczepionki wynikają głównie z wciąż niedostatecznej wiedzy na temat tej zróżnicowanej populacji komórek. Aby skonstruować jak najlepszą terapię oparta na komórkach dendrytycznych trzeba wziąć pod uwagę m. in. następujące zjawiska:

• rodzaj receptora, który jest wykorzystywany do dostarczania antygenu może mieć wpływ na rodzaj odpowiedzi immunologicznej - różne receptory aktywują różne ścieżki sygnałów wewnątrz komórki, niektóre z receptorów przekazują sygnał do aktywacji, inne mogą hamować aktywację;

• komórki inne niż DC, posiadające docelowy receptor na swojej powierzchni, mogą modulować odpowiedź immunologiczną;

• niektóre receptory obecne są tylko na określonym rodzaju komórek dendrytycznych (np. tylko na plazmocytoidalnych DC), co można wykorzystać do adresowania antygenów do ściśle ustalonych subpopulacji DC;

• należy pamiętać, że często samo dostarczenie antygenów do receptorów komórek dendrytycznych, bez podania czynników promujących ich dojrzewanie i aktywację, może prowadzić do wykształcenia tolerancji na dany antygen (potencjalna możliwość zastosowania DC w leczeniu alergii!).

• Obie prezentowane w tym artykule możliwości wykorzystania komórek dendrytycznych w terapii antynowotworowej - dostarczanie antygenu do komórki poza organizmem pacjenta (ex vivo) i jako kompleks antygen-ligand/przeciwciało bezpośrednio do organizmu (in vivo) - mają liczne wady, ale także wiele zalet, które sprawiają, że szczepionki oparte na DC są dobrze rokującą na przyszłość metodą walki z nowotworem.

Receptory TLR i ich rola w indukcji odpowiedzi immunologicznej

Organizm ludzki (jak i każdy inny) posiada zestaw mechanizmów, chroniący go przed działaniem czynników patogennych (na działanie których stale jest narażony) czyli odporność. Odporność kręgowców składa się z odporności swoistej zarówno komórkowej jak i humoralnej, w funkcjonowaniu której główną rolę odgrywają limfocyty T i B oraz filogenetycznie starszej, stanowiącej pierwszą linię obrony odporności nieswoistej. Drobnoustroje posiadają pewne charakterystyczne struktury niezbędne do ich prawidłowego funkcjonowania, a nieobecne u organizmów wyższych. Należą do nich np. peptydoglikan czy lipopolisacharyd - składniki bakteryjnej ściany komórkowej, mannany występujące w ścianie drożdży jak też dwuniciowy RNA stanowiący genom niektórych wirusów. Struktury te są określane jako PAMP (pathogen associated molecular patterns) czyli wzorce molekularne związane z patogenami. Komórki odpowiedzi nieswoistej rozpoznają właśnie cząstki PAMP. Rozpoznanie następuje poprzez receptory rozpoznające wzorce - PRR (pattern recognition receptors). Najważniejszą grupą receptorów PRR poznaną stosunkowo niedawno są receptory TLR (toll-podobne).

Skąd nazwa receptory Toll-podobne

Białko (receptor) Toll uczestniczy w rozwoju embrionalnym muszki owocowej (Drosophila melanogaster) - ściślej w różnicowaniu strony grzbietowej i brzusznej rozwijających się zarodków tych owadów. Nazwa toll z niemieckiego oznacza „dziwaczny”, wzięła się stąd że mutanty muszek wyglądają nienormalnie (co związane jest z zaburzeniami w rozwoju). Białko to zostało odkryte przez Christiane Nusslein-Volhard. W 1996r. Jules A. Hoffmann i współpracownicy z CNRS w Sztrasburgu wykazali, że białko to uczestniczy również w reakcjach obronnych tych owadów - jest elementem obrony przeciwgrzybiczej i przeciwbakteryjnej.

Odkrycie Hoffmanna przyczyniło się do wyjaśnienia kilku wcześniej opisanych faktów. Mianowicie w 1991r. Nick J. Gay z University of Cambridge dokonał ważnego odkrycia. Przeszukując bazy danych zawierające sekwencje znanych wówczas genów w poszukiwaniu białek podobnych do Toll zauważył, że fragment tego białka przypomina wewnątrzkomórkowy odcinek ludzkiego receptora cytokiny IL1. (Recepror ten został odkryty w 1988r. przez Johna E. Sims i współpracowników z firmy Immunex w Seattle - obecnie nazwa interleukina 1 obejmuje rodzinę co najmniej 10 cząsteczek - istnieje więc również przynajmniej 10 receptorów tych cząstek). W roku 1997 odkryto pierwsze białko, które przypominało receptor Toll Drosophili melanogaster na całej długości (najpierw Ruslan Medzhitov i Charles A. Janeway junior z Yale University a następnie kolejne pięć przez Fernando Bazan i współpracownicy DNAX Kalifornia). Początkowa nazwa - ludzkie białka Toll została zamieniona na receptory Toll - podobne. Odkrycie i poznanie roli tych receptorów to jedno z największych odkryć z dziedziny immunologii.

Powszechność receptorów TLR

Na chwilę obecną znanych jest 10 ludzkich TLR (TLR 1 - 10). Większość z nich występuje na powierzchni komórek - w błonie komórkowej (a niektóre spośród nich znajdują się w pęcherzykach cytoplazmatycznych) szeregu komórek. Ich ekspresje wykazano w makrofagach, komórkach dendrytycznych, limfocytach B, eozynofilach, neutrofilach, komórkach tucznych, komórkach nabłonka naczyń, keratynocytach, fibroblastach, adipocytach, kardiomiocytach. W większości zostały zidentyfikowane również ligandy PAMP receptorów TLR. Ich zestawienie znajduje się w poniższej tabeli.

Receptor TLR	Rodzaj ligandu, który jest rozpoznawany przez receptor
TLR2	peptydoglikan, lipoproteiny, kwasy lipotejchojowe, bakteryjne poryny, lippoarabinomannan
TLR3	dwuniciowy RNA
TLR4	lipopolisacharyd (LPS), TLR4 jest pierwszym odkrytym i najlepiej poznanym ludzkim receptorem Toll - podobnym.
TLR5	flagellina - białko rzęsek bakteryjnych
TLR7	pojedyncza nić RNA
TLR8	pojedyncza nić RNA
TLR9	niemetylowane sekwencje CpG
TLR10	TLR10 to słabo poznany receptor, jego ligand obecnie nieznany

Tabela 1. Zestawienie receptorów TLR i ich głównych ligandów PAMP

Receptory TLR mogą również tworzyć homo i heterodimery, które rozpoznają inne cząstki PAMP. TLR2 połączony z TLR6 rozpoznaje zymosan - składnik ściany komórkowej drożdży. U myszy zidentyfikowano 11 receptorów TLR, jednak ich obecność nie jest cechą charakteryzującą jedynie ssaki. Występują u tak odległych ewolucyjnie organizmów jak nicienie (1 eceptor toll podobny), a nawet rośliny (białko N tytoniu, uczestniczące w obronie przeciwwirusowej - mozaiki tytoniowej, czy też liczne białka rzodkiewnika pospolitego), co ukazuje na jak wczesnym etapie rozwoju życia na Ziemi powstały.

Budowa receptorów TLR

TLR są receptorami transbłonowymi. Część zewnątrzkomórkową stanowią domeny bogate w reszty leucynowe - LRR (leucine- rich repeats), część cytoplazmatyczną domena wykazująca wysoką homologię z receptorem IL-1R1 czyli TIR (Toll-IL-1R).

Rola receptorów TLR w indukcji odpowiedzi immunologicznej

Znajdujący się na powierzchni komórek nabłonkowych dróg oddechowych TLR 4 rozpoznając czynnik patogenny (ściślej PAMP), aktywuje te komórki do wydzielania defensyn - niszczących drobnoustroje jak również szeregu cytokin m.in. hemokin uczestniczących w przyciągnięciu do miejsca inwazji komórek układu odpornościowego (m.in.makrofagów, komórek dendrytycznych, komórek tucznych, limfocytów). Makrofagi pojawiające się w miejscu infekcji również posiadają na swojej powierzchni receptory TLR. Po rozpoznaniu swoistego PAMP receptory toll-podobne aktywują makrofagi do wytwarzania cytokin prozapalnych takich jak: IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF. Indukowane makrofagi zyskują również zdolność zwiększonej fagocytozy (są mikroorganizmy, których makrofagi nieaktywowane nie są w stanie skutecznie niwelować jak np. Mycobacterium tuberculosis). Inną cechą pojawiającą się po aktywacji jest wytwarzanie RFT - reaktywnych form tlenu, oraz NO uczestniczących w niszczeniu drobnoustroju. Makrofagi zyskują również zdolność prezentacji antygenu.

Bakterie (ich fragmenty) działają aktywująco na komórki tuczne również poprzez receptory TLR (natomiast alergeny czy np. pasożyty aktywują komórki tuczne poprzez IgE połączone z ich błoną) . Receptory toll- podobne (2,4,6,8) indukują komórki tuczne do wydzielania mediatorów stanu zapalnego jak histamina, PGD2, LTB4, zwiększających przepuszczalność naczyń krwionośnych co umożliwia napływ składników osocza (m.in. przeciwciał czy składników dopełniacza). Nadmiar tych mediatorów prowadzić może do uogólnionej (systemowej) reakcji zapalnej - wstrząsu anafilaktycznego. Inną cytokiną wydzielaną przez komórki tuczne w dużej ilości zaraz po aktywacji jest TNF, będący silnym stymulatorem neutrofili (działanie chemotaktyczne). Komórki tuczne zyskują również zdolność prezentacji antygenu.

Inna grupa komórek aktywowanych podczas indukcji odpowiedzi immunologicznej z pośrednictwem TLR to komórki dendrytyczne. Znajdująca się w tkankach niedojrzała postać tych komórek posiada silne własności endocytarne. Jeśli podczas tego procesu do jej wnętrza dostanie się bakteria, komórka dendrytyczna zmienia swoje właściwości - na jej powierzchni pojawiają się receptory dla chemokin i komórka migruje naczyniem limfatycznym do węzła limfatycznego. Tu kończy się proces jej dojrzewania - na powierzchni pojawiają się cząsteczki kostymulujące (CD40, CD80, Cd86) oraz cząsteczki prezentujące antygen (MHC klasy I i II).

Przekaz sygnału

W poprzednich akapitach opisano pokrótce budowę, funkcje oraz ligandy oddziałujące z receptorami TLR. Do pełnego zrozumienia mechanizmu aktywacji odporności nieswoistej potrzebna jest charakterystyka przekazu sygnału od receptora toll-podobnego do jądra komórkowego. W wyniku tej transdukcji dochodzi do ekspresji cytokin i innych cząstek sygnałowych. Mechanizmy te są badane w wielu laboatoriach na świecie, gdyż z możliwością ich regulacji wiąże się obecnie wielkie nadzieje (co zostało opisane po części w następnym akapicie). W przekazie sygnału z wyjątkiem receptora TLR 3 uczestniczy białko adaptorowe o nazwie MyD88 (myeloid differentiation factor 88). W momencie pobudzenia receptora TLR białko MyD88 łączy się poprzez domenę TIR z receptorem TLR. Związanie to następuje bezpośrednio (dla TLR5, TLR7, TLR90), natomiast w przypadku TLR 2 i TLR4 następuje to za pośrednictwem białka TIRAP (TIR-domain-containing adapter protein). W dalszej kolejności dochodzi do aktywacji kinazy IRAK4 (IL-1-1r1-associated protein kinase), która poprzez fosforylacje aktywuje następną kinazę - IRAK1. W wyniku tego procesu IRAK1 jest uwalniana do cytoplazmy, gdzie łączy się z białkiem TRAF6 (czynnik związany z receptorem czynnika martwicy nowotworu - TNF-receptor associated factor). Dochodzi do pobudzenia kompleksu TAK1/TAB, który aktywuje kinazę czynnika IκB oraz kinazę MAP (mitogen-activated protein). Kinaza czynnika IκB fosforyluje ten czynnik czyniąc go nieaktywnym. Czynnik IκB to inhibitor czynnika NF-κB. A więc w wyniku opisanych procesów powstaje aktywny NF-κB (nuclear factor- κB), który wnika do jądra. Jako czynnik transkrypcyjny włącza on ekspresje genów kodujących aktywatory odpowiedzi immunologicznej m.in. cytokiny indukujące proces zapalny. Opisany powyżej proces transdukcji sygnału jest najlepiej poznany, istnieją jednak również drogi przekazu z udziałem odmiennych białek. W wyniku przekazu sygnału w przypadku każdego z typów TLR aktywacji ulegają odmienne zestawy genów. Receptory rozpoznające wirusy (TLR3 i TLR7) indukuję wytwarzanie interferonów - najważniejszych cytokin przeciwwirusowych, natomiast receptory wiążące ligandy bakteryjne (np.TLR2 czy TLR4) spowodują wytworzenie odmiennej grupy cytokin.

Nadzieje i perspektywy

Poznanie roli TLR w indukcji odpowiedzi immunologicznej stworzyło perspektywę do działania, niejako na nowym polu dla szeregu laboratoriów na całym świecie. Osoby z np. źle funkcjonującym TLR4 są jak się szacuje pięciokrotnie bardziej narażone na poważne infekcje bakteryjne, gdyż mechanizmy jej zwalczania są upośledzone już na etapie pierwotnego rozpoznania drobnoustroju. Identyfikacja pacjentów posiadających zmutowany gen dlaTLR4 mogła by decydować o rozpoczęciu intensywnej antybiotykoterapii. W przyszłości być może stosowane będą czynniki, które usprawnią bądź to mechanizmy rozpoznania PAMP przez TLR lub zaburzoną drogę przekazu sygnału. Równie niebezpieczna dla organizmu jest zbyt silna odpowiedź immunologiczna, występująca m.in. w posocznicy. Zaobserwowano również rolę TLR w patogenezie chorób autoimmunizacyjnych. W przypadku przewlekłej choroby o takim podłożu - tocznia układowego rumieniowatego najprawdopodobniej TLR 9 rozpoznaje DNA pochodzący z własnych komórek. Dla opisanych przypadków skuteczną metodą terapii jest (w fazie badań) blokowanie odpowiedzi komórek na ligand dla receptorów TLR. Dokonuje się tego poprzez zapobieganie wiązania ligandu do receptora za pomocą dostępnych przeciwciał mono, poliklonalnych anty-TLR. Blokuje się również transdukcje sygnału poprzez np. inaktywacje enzymów lub hamowanie interakcji białko-białko w opisanej wcześniej kaskadzie. Nadzieje wiązane z ogólnie pojętą modyfikacją receptorów TLR dotyczą również produkcji skutecznych szczepionek. Potrzeba taka wynika m.in. z powstawania nowych wirusów i możliwości użycia niektórych z nich jako broni biologicznej. Poczyniono wstępne badania nad substancjami aktywującymi receptor TLR9, który wywołuje silną odpowiedź immunologiczną.

Jeszcze stosunkowo niedawno bo10 lat temu odporność nieswoista traktowana była jako małoprecyzyjna. Przeciwstawiano jej limfocyty B i T, które bądź to poprzez wydzielane przeciwciała lub poprzez receptory (TRC) rozpoznawały antygen z dużą dokładnością. Odkrycie receptorów TLR zmieniło ten sposób myślenia. Poznanie ich roli w indukcji odpowiedzi immunologicznej to jedno z ważniejszych odkryć z dziedziny immunologii. Dalsze poznanie procesów, w których one uczestniczą niesie nadzieje na skuteczną walkę z szeregiem chorób: zarówno tych powodowanych infekcjami szczególnie bakteryjnymi, jak również powodowanych nieprawidłową odpowiedzią układu immunologicznego (zbyt silna odpowiedź, choroby autoimmunizacyjne).

Mechanizmy cytotoksyczności limfocytów

Efektorowe limfocyty T mogą różnicować do trzech funkcjonalnych klas komórek pod wpływem róznych antygenów znajdujących się na powierzchni komórki docelowej. Antygeny pochodzące od bakterii wewnątrzkomórkowych są transportowane na powierzchnię komórki przez cząsteczki MHC klasy I i są prezentowane dla limfocytów T CD8. Komórki te różnicują do limfocytów cytotoksycznych. Mają zdolność do swoistego rozpoznawania i wybiórczego degradowania komórek docelowych w odróżnieniu do cytotoksycznych makrofagów i granulocytów, które oddziaływują z komórkami nieswoiście. Odgrywają one kluczowa rolę w odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym (np. przeciwko wirusom, pierwotniakom), jak również w mniejszym stopniu biorą udział w zabijaniu komórek nowotworowych, komórek pochodzących z przeszczepów allogenicznych, a nawet niektórych wolno żyjących bakterii.

Limfocyty cytotoksyczne indukują proces apoptotyczny w komórce docelowej . Jest to możliwe dzięki wykorzystaniu dwóch podstawowych mechanizmów cytotoksyczności. Pierwszym z nich jest mechanizm związany z wydzieleniem z komórki zawartości ziaren cytotoksycznych, natomiast drugim jest mechanizm związany z aktywacją swoistych receptorów dla cząsteczek należących do nadrodziny TNF, które znajdują się na komórkach docelowych.

REAKCJA CYTOTOKSYCZNA ZALEŻNA OD ZIAREN CYTOLITYCZNYCH

1) Rozpoznanie i związanie komórki docelowej przez limfocyt

Do połączenia komórki limfocytu Tc z komórką docelową dochodzi głównie dzięki interakcjom miedzy cząsteczkami adhezyjnymi, które występują na obydwu typach komórek. Znane są specyficzne pary receptor- ligand występujące na komórce efektorowej i docelowej takie jak:

• LFA-1 - ICAM-1 (LFA - lymphocyte function-associated antygen jest łańcuchem β2 integryny, której ekspresja zachodzi we wszystkich komórkach T) Cząsteczki CD2 i β1 integryny mogą zastępować LFA-1 w przypadku jego braku. ) (ICAM - intercellular adhesion molecules- należą do rodziny immunoglobulin, ICAM-2, and ICAM-3 również oddziaływuja z LFA-1)

• LFA-2 - LFA-3

• CD28 - B7 ( cząsteczki B7 są homodimerami i należą do nadrodziny immunoglobulin i występują tylko na komórkach zdolnych do stymulacji proliferacji limfocytów T, receptorem dla cząsteczki B7 na powierzchni limfocytów T jest CD28)

• CD2 - LFA-3

Aby doszło do połączenia się komórki efektorowej z docelową niezbędne są również jony Ca²⁺ i Mg²⁺ bez których nie dojdzie do interakcji. Do połączenia nie dojdzie również w niskich temperaturach, co jest związane z zahamowaniem oddziaływania LFA-1 oraz ICAM-1, które jest procesem wysoce endoergicznym i wymagającym obecności kationów Ca²⁺ i Mg²⁺.

Połączenie komórki efektorowej z docelową nie wystarcza jednak do przeprowadzenia ataku cytotoksycznego. Kolejnym niezbędnym czynnikiem jest dodatkowy, swoisty sygnał aktywacyjny, który jest następnie odbierany przez TCR, receptory komórek NK lub FcγRIII w komórkach K. Prócz tych receptorów do aktywacji limfocytów dochodzi również na skutek interakcji cząsteczek powierzchniowych np.CD8 z cząsteczkami MHC klasy I.

2) Aktywacja komórki docelowej i wydzielanie czynników cytotoksycznych

Po związaniu komórki efektorowej z docelową dochodzi do powstania licznych zmian w strukturze komórek m.in. reorganizacji filamentów aktynowych znajdujących się tuż pod powierzchnią błony komórkowej i jednoczesnego przemieszczenia centrioli co skutkuje maksymalnym zwiększeniem powierzchni styku między komórkami, przesunięciem aparatów Golgiego i ziaren cytoplazmatycznych do bieguna, który sąsiaduje z komórką docelową. Zjawisko to nazwane jest polaryzacją. Proces ten jest kluczowy do przeprowadzenia egzocytozy, czyli ostatecznego efektu cytotoksycznego.

Limfocyty wydzielają na drodze egzocytozy do przestrzeni międzykomórkowej czynniki cytotoksyczne znajdujące się we wnętrzu ziaren cytolitycznych, jak również nie związanych z strukturami ziaren. Mechanizm degranulacji nie jest do końca poznany, choć prawdopodobne jest, że proces ten jest analogiczny do wydzielania neurotransmiterów do przestrzeni międzysynaptycznych lub też do reakcji korowej oocytu tuz po wniknięciu plemnika do jego wnętrza. Stymulacja limfocytów Tc do uwolnienia zawartości ziaren jest prawdopodobnie aktywowana pośrednio przez TCR, jak również kluczową rolę w tym procesie odgrywają jony Ca²⁺. Udowodniono, że działanie inhibitora transferazy rybozylowej ADP powoduje zahamowanie wnikania Ca²⁺do wnętrza komórki, co skutkuje zablokowaniem degranulacji ziaren cytolitycznych. Natomiast zwiększenie stężenia Ca²⁺ przez dodanie jonomycyny stymuluje przemieszczenie ziaren, jednak bez wydzielenia ich zawartości. Do pełnego procesu uwolnienia czynników zachodzi po zadziałaniu dodatkowego czynnika aktywującego np. estru forbolu. Ostateczny efekt cytotoksyczny jest konsekwencją działania kilku sygnałów aktywujących, bowiem aktywacja komórki za pośrednictwem kompleksu TCR/CD3 jak również CD2 lub CD7 powodują wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca²⁺. Działanie czynników na komórkę docelową określane jest terminem zadania „ śmiertelnego ciosu” jako, że związki te są w stanie bezpośrednio niszczyć i zabijać.

3)Recyrkulacja limfocytów Tc

Limfocyty Tc, które uwolniły do przestrzeni międzykomórkowej zawartość ziaren, zadając „śmiertelny cios”, odłączają się od komórki docelowej w celu zaatakowania kolejnej komórki. Konieczny jest pewien odstęp czasowy pomiędzy zaatakowaniem kolejnych ofiar zwany okresem refrakcji, który jest niezbędny do odtworzenia ziaren i produkcji nowych czynników cytotoksycznych.

Czynniki cytotoksyczne związane z ziarnami cytolitycznymi limfocytów Tc

Czynniki te zlokalizowane są w specjalnych przestrzeniach błonowych, które zostały utworzone przez aparat Golgiego. Mają cechy pęcherzyków wydzielniczych, jak również lizosomów. Ziarna otoczono są pojedynczą błoną cytoplazmatyczną. Wewnątrz ziarna widoczne jest mocno zagęszczone skupisko czynników zwane rdzeniem, jak również liczne, mniejsze pęcherzyki znajdujące się w części korowej ziarna. Wnętrze pęcherzyków ma kwaśne pH, w ich błonie obecne są receptory dla mannozo-6-fosforanu i białko błonowe związane z lizosomom (LAMP - lysosome- associated membrane protein), które są typowe dla struktur lizosomalnych. Prócz tych cech charakterystycznych w ziarnach cytolitycznych obecne są również enzymy lizosomalne takie jak: α- glikozydaza, α-L-fukozydaza, arylosulfataza, β-glukuronidaza, β-heksozaminidaza, kwaśna fosfataza oraz katepsyny.

Jednymi z najbardziej znanych czynników cytotoksycznych są perforyna, granzymy, granulizyny, wewnątrzkomórkowe białko limfocytów T ( T cell intracellular antygen-1,p40-TIA-1)

1) Perforyna

Perforyna jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej od 68 do 70 kDa, składająca się z 555 aminokwasów, która ma zdolność wnikania w strukturę błony komórek docelowych, gdzie polimeryzuje tworząc transmembranowe kanały. Gen dla perforyny zawiera tylko 3 egzony. Cząsteczka perforyny składa się z 4 domen, gdzie C-końcowa domena zbudowana jest z 124 aminokwasów, a N-końcowa domena z 43 aminokwasów ( obydwie te domeny występują tylko w cząsteczce perforyny). Z kolei środkowa część cząsteczki składa się z dwóch domen, które wykazują 20% homologi do odpowiednich domen w składnikach C6, C7, C8 i C9 dopełniacza. Jedna z nich jest bogata w cysteinę, druga natomiast zawiera sekwencje aminokwasów zdolne do wytworzenia jednego odcinka o strukturze α-helikalnej i dwóch odcinków o strukturze β-harmonijki. Wskazuje to na charakter hydrofobowy tej domeny, która może być odpowiedzialna za wnikanie wewnątrz dwuwarstwy lipidowej. Miejsce wiązania jonów Ca²⁺, które odgrywają kluczową rolę w mechanizmie działania porfiryny, znajduje się na domenie N-końcowej.

Pory zbudowane z polimerów porfiryny tworzą cylindryczną strukturę hydrofobową o średnicy około16 nm co jest równoznaczne około 20 cząsteczkom perforyny. Nie wiadomo czy struktura kanału jest najpierw konstruowana , dopiero potem wbudowywane wewnątrz błony czy też rozbudowywana jest już w dwuwarstwie lipidowej. Proces polimeryzacji porfiryny i wbudowanie do błony komórkowej jest ściśle zależny od Ca²⁺ lub Sr²⁺ , które powodują zmiany konformacyjne porfiryny, która występuje w ziarnach cytolitycznych w nieaktywnej formie globularnej. Obecność Ca²⁺ umożliwia przyłączenie monomeru porfiryny do błony komórkowej. W ziarnach cytolitycznych stwierdzono również obecność kalretikuliny, białka wiążącego Ca²⁺ i posiadającego C-końcową domenę KDEL, która zapewnia pozostawanie w świetle aparatu Golgiego. Kalretikulina odpowiada prawdopodobnie za wiązanie Ca²⁺ co uniemożliwia polimeryzację porfiryny wewnątrz ziaren i tworzenie kanałów w ich błonach, jak również może pełnić fukcję opiekuńczą, ponieważ globularna forma jest mniej podatna na uszkodzenia. Po wydzieleniu porfiryny do przestrzeni międzybłonowej kalretikulina pozostaje związana z porfiryną pomagając jej w perforacji błony. Związanie perforyny z błoną zachodzi prawdopodobnie przez fosfolipidy błonowy - fosfatydylocholinę - która ma zdolność wiązania Ca²⁺ co powoduje wzrost powinowactwa perforyny do fosfatydylocholiny. Jak wykazano jony Ca²⁺ mogą również powodować zahamowanie polimeryzacji porfiryny lub też czopowania utworzonych kanałów transmembranowych co ma miejsce w warunkach niskiego pH i wysokiego stężenia Ca²⁺ i Zn²⁺ .Innymi inhibitorami porfiryny są również niektóre lipoproteidy i białka S osocza krwi, które konkurując z perforyną o przyłączenie do błony uniemożliwiają tworzenie porów.

Inną możliwością związania perforyny z błoną jest współudział niektórych receptorów błonowych lub tez tak jak w przypadku komórek NK, które wydzielają czynnik aktywujący płytki PAF, który po związaniu z perforyną umożliwia jej interakcje z receptorem PAF znajdującym się w błonie.

Powstałe pory umożliwiają gwałtowne wnikanie wody, soli, a nawet biopolimerów do wnętrza komórki , jak również wydzielanie na ekstraktu wewnątrzkomórkowego. Skutkiem zaistniałych zmian jest zniszczenie integralności błony, nieprawidłowo funkcjonująca gospodarka mineralna i w efekcie pęknięcie komórki.

Na skutek wniknięcia do wewnątrz komórki dużej ilości Ca2+ aktywowane są liczne endonukleazy, które degradują DNA kierując komórkę docelową na drogę apoptozy. Gen na perforyne ulega ekspresji głownie w komórkach ( słaba ekspresja zachodzi w komórkach makrofagów, astrocytach, stymulowanych komórkach macierzystych szpiku) . Działanie niektórych cytokin tj. IL-2, IL-4, IL-7 IL-12, G-CSF jak również pektyny, jonofory wapniowe stymulują ekspresję tego genu. Z kolei hamowanie ekspresji tego genu jest obserwowane w wyniku działania TGF- β

2) Granzymy (Fragmentyny)

Granzymy ( granule-associated enzymes) są proteazami serynowymi, które występują tylko w ziarnach cytolitycznych . Ich druga nazwa - fragmentyny- pochodzi od posiadanej zdolności do fragmentowania DNA komórki docelowej. Do tej pory wyróżniono ok. 12 różnych granzymów występujących u gryzoni i u ludzi.

Granzym	Występowanie	Masa cząsteczkowa [kDa]	Glikozylacja	Aktywność enzymatyczna	Miejsce cięcia
A*	Cz, M, Sz	60 (dimer)	+	tryptaza	Arg/Lys
B*	Cz, M, Sz	27-32	-	Asp-aza	Asp/Glu
C	M, Sz	27	+	?	Asn/Ser
D	M	35-50	+	?	Phe/Leu
E	M	35-45	+	?	Phe/Leu
F	M, Sz	35-40	+	?	Phe/Leu
G	M	30	+/-	?	Phe/Leu
H	Cz	30	?	chymaza	Phe/Leu
I	Sz	30	?	?	?
J	Sz	30	?	?	?
K*	Cz, Sz	28	?	tryptaza	?
M (Met-aza 1)	Cz, Sz	30	+/-	Met-aza	Met/Leu

Tabela 1. Granzymy i ich właściwości

Skróty zastosowane w tabeli: Cz- człowiek, M- mysz, Sz - szczur * U człowieka granzymy A, B i K mają odpowiednio nazwę granzymy 1, 2 i 3

Wykazano, że geny kodujące granzymy charakteryzują się dużym stopniem homologii z genami innych proteaz serynowych tj. chymazy, elastazy, trypsyny, tryptazy.

Granzymy biorą czynny udział w procesie cytotoksycznym bezpośrednio działając na DNA , jak również prawdopodobnie aktywują perforynę i inne czynniki cytotoksyczne. Po wniknięciu granzymów do wnętrza komórki docelowej przez pory utworzone przez perforynę przekierowują komórkę na drogę apoptozy na skutek wykazywania właściwości proteolitycznych. Dla przykładu granzym B tnie niektóre proenzymy z rodziny kaspaz, które w wyniku modyfikacji przekształcają się w aktywne cząsteczki (np. kaspaza 3) biorące bezpośredni udział w stymulacji i przebiegu apoptozy. Prócz tego, granzym B w wyniku cięcia proteolitycznego aktywuje białko Bid, które należy do białek z rodziny Bcl-2 wykazujących właściwości proapoptotyczne (inicjacja szlaku apoptotycznego związanego z mitochondriami). Jedynie granzym B wykazuje zdolność do aktywacji kaspaz. Inne graznymy wiążą białka chromatyny powodując ich cięcie, dzięki czemu ułatwiony jest dostęp do DNA dla endonukleaz.Jednym z takich białek jest granzym A, który wiąże się z histonami i białkami macierzy jądrowej ( m.in. nukleiną bogatą w lizynę) a następnie degraduje te białka. Wykazano również, że granzymy niszczą białka cytoplazmatyczne i organelle komórkowe. Prócz podstawowych funkcji w efekcie cytotoksycznym, granzymy biorą udział w lokalnych procesach zapalnych hydrolizując składniki macierzy pozakomórkowej tj. kolagen typu IV i proteoglikany. Granzym A wykazuje zdolność stymulacji proliferacji limfocytów B, z kolei granzym B ma właściwości antyproliferacyjne względem komórek nowotworowych.

3)Wewnątrzkomórkowe białko limfocytów T p40-ITA-1

Białko p40-ITA-1 o masie 40 kDa obecne jest w błonie ziaren cytolitycznych i składa się z trzech domen wykazujących zdolność do wiązania RNA. Prawdopodobnie białko to jest odpowiedzialne za degradację RNA komórki docelowej, które wnika do wnętrza przez kanały perforynowe. Wykazano rowneiz obecność w ziarnach cytolitycznych innego białka o masie ok. 15kDa, które było wiązane przez przeciwciała przeciwko p40-ITA-1 , które nazwano GMP-17 ( granule membrane protein 17). Wykazuje on duży stopień homologi do niektórych kanałów wapniowych bramkowanych napięciem tak więc możliwe jest, że jest ono odpowiedzialne za regulację kanałów wapniowych podczas reakcji cytolitycznej.

4)Granulizyna

Granulizyna jest białkiem należącym do rodziny sapozyn, które wykazują zdolność wiązania lipidów. Ekspresja genu na granulizyne daje dwa główne produkty białkowe o masie 15kDa i 9kDa. Białka te są odpowiedzialne za przeprowadzenie lizy błony komórkowej bakterii gramdodatnich i gramujemnych, pierwotniaków i innych drobnoustrojów. Granulizyna jest również zdolna do degradacji błon mitochondrialnych i aktywacji kaspazy 9 prowadząc do indukcji apoptozy.

Jak komórka zabezpiecza się przed działaniem własnych czynników cytotoksycznych?

Mechanizm ochronny komórek efektorowych nie jest jeszcze dokładnie poznany. Prawdopodobne jest, że obecne w ziarnach glikozaminoglikany ( np. siarczan chondroityny A) neutralizuje i transportuje cząsteczki perforyny i granzymów, pełniąc funkcje ochronne limfocytów. Prócz tych zabezpieczeń w błonie limfocytów znajdują się białka o właściwościach zbliżonych do HRF ( czynnik restrykcji homologicznej - ma zdolność do wiązania składników C8 i C9 układu dopełniacza) , które wiążą wolną perforynę uniemożliwiają zniszczenie komórki efektorowej.

Zabezpieczenie przed efektem cytolitycznym może również się odbywać na etapie hamowania indukcji szlaku apoptotycznego. Tak więc aktywność granzymów może być regulowana przez serpiny np. wirusowe białko CrmA, które hamując aktywność kaspaz uniemożliwiają indukcje apoptozy. W komórkach ssaków do tej pory zidentyfikowano 10 serpin, z których najlepiej poznaną jest PI-9, która hamuje aktywność granzymu B. PI-9 występuje w cytozolu limfocytów Tc i komórkach NK chroniąc je przed własnymi granzymami.

REAKCJA CYTOTOKSYCZNA ZALEŻNA OD RECEPTORÓW DLA CZĄSTECZEK NADRODZINY TNF

Reakcja cytotoksyczna zależna od receptorów dla cząsteczek rodziny TNF polega na oddziaływaniu ligandów produkowanych przez komórki efektorowe, dla receptory znajdują się na komórkach docelowych. Po związaniu ligandu z receptorem generowany jest sygnał indukujący w komórce docelowej szlak apoptotyczny. Następnie limfocyt oddziela się i ulega recyrkulacji podobnie jak w przypadku mechanizmu zależnego od ziaren cytolitycznych. Istnieje również wydzielanie cytotoksycznych ligandów przez limfocyty Tc które wiążą się z receptorami na powierzchni komórek docelowych, wówczas związanie komórki efektorowej do ofiary nie jest konieczne ( tu efekt cytotoksyczny nie jest swoisty)

Wyżej omawiane ligandy należą do nadrodziny TNF, których receptory są zlokalizowane w błonie komórek docelowych. Część cytoplazmatyczna tych receptorów zawiera tzw „domenę śmierci”. Do cząsteczek tych należą: Apo-1L/FasL (CD95L), TRAIL, TNF, LT-α. Cząsteczki te w wyniku związania z receptorami na komórce docelowej pobudzają zależne od „domeny śmierci” mechanizmy komórkowe zmierzające do stymulacji kaspaz i w konsekwencji indukcji apoptozy.

Czynnikiem odgrywającą kluczową rolę w procesie cytolitycznym zależnym od receptorów dla cząsteczek rodziny TNF u limfocytów jest FasL, który łączy się z receptorem Fas. Receptor ten jest uniwersalny dla wielu typów komórek. Głównie limfocyty Tc CD4+ działają za pomocą FasL, limfocyty Tc CD8+ wykorzystują mechanizm zależny od FasL w dużo mniejszym stopniu.

Efekt cytolitycznym zależny od receptorów dla cząsteczek rodziny TNF w głównej mierze zależy od ekspresji liganda przez komórkę efektorową , jak również syntezę odpowiednich receptorów na powierzchni komórki docelowej. Pobudzenie ekspresji FasL zachodzi za pośrednictwem TCR wspomaganym przez niektóre cytokiny tj. IL-2, IL-12, IFN-γ, natomiast ekspresja Fas jest stymulowana przez IFN-γ i TNF

Inne mechanizmy

Istotnym czynnikiem wydzielanym przez aktywowane limfocyty Tc , który nie powoduje bezpośrednio efektu cytolitycznego, ale go reguluje jest leukoregulina. Białko to o masie 50kDa zwiększa wrażliwość komórek docelowych na działanie czynników cytotoksycznych, jak również leków cytostatycznych.

Wykazano również, że niektóre metabolity np. ATP uwalniane przez limfocyty mogą indukować szlak apoptotyczny w docelowych komórkach nowotworowych i tymocytach. Działanie ATP zachodzi za pośrednictwem receptorów purynergicznych P2z, które tworzą bardzo duże kanały transmembranowe w obecności ATP. Skutkuje to zaburzeniem gospodarki mineralnej, szokiem tonicznym i umożliwieniem wniknięcia innych czynników cytotoksycznych.

Alergia - nadwrażliwość typu I

Przez wiele lat prowadzono wnikliwe badania nad tym czym są alergeny, jaka jest ich struktura i funkcja. Stwierdzono, że alergeny to antygeny, które zdolne są do wywołania reakcji alergicznych. Stosunkowo niedawno udało się natomiast określić pierwotną strukturę chemiczną wielu alergenów na podstawie technik z wielu dziedzin nauk biologicznych i chemicznych min. dzięki biologii molekularnej. Na podstawie tej znajomości strukturalnej dokonano klasyfikacji alergenów. Według najnowszych wytycznych nazwa alergenu składa się z trzech członów:

1. człon I - nazwa rodzajowa

2. człon II - nazwa gatunkowa

3. człon III - liczba arabska

np.: Phl p 5 = alergen tymotki łąkowej (Phleum pratense)

STRUKTURA ALERGENÓW

• ALEGRENY BIAŁKOWE

Naturalne alergeny:

- białka globularne

- masa cząsteczkowa 10-40 kDa

- często występuje domena cukrowa

- dobrze rozpuszczalne w wodzie

• ALERGENY WIELOCZĄSTECZKOWE:

Do tej grupy alergenów należą związki chemiczne stosowane jako leki, które mają charakter haptenów. Do najbardziej znanych leków które wykazują zdolności do wywołania alergii należą antybiotyki z grupy penilcylin, narkotyczne leki przeciwbólowe takie jak morfina czy petydyna ale także leki stosowana w anestezjologii jako środki zwiotczające oraz znoszące przekaźnictwo nerwowo-mięśniowe w płytce ruchowej. W przypadku penicyliny determinantę antygenową stanowi pierścień b-laktamowy oraz tiazolidynowy. Znaczący wpływ na właściwości alergizujące mają także zanieczyszczenia, które stanowią pozostałości po procesie produkcyjnym. Warto także wspomnieć ,że dość silne uczulającym lekiem jest kompleks kwasu penicyloilowego z białkami osocza . Pamiętać należy zatem ze leki tej grupy mogą wywołać wstrząs anafilaktyczny. Przykładem narkotycznego leku przeciwbólowego jest morfina, której determinantę antygenową stanowi pierścień cykloheksynylowy z grupą hydroksylową i grupa metylowa związana z azotem. Natomiast suksametonium jest lekiem powszechnie stosowanym w anestezjologii a determinantę antygenową stanowią trzecio i czwartorzędowe grupy amonowe, które mają zdolność do wiązania się ze swoistymi IgE obecnymi w surowicy pacjenta.

CZYNNIKI WARUNKUJĄCE WYSTĄPIENIE ALERGII

Na podstawie wielu badań i obserwacji dokonano podziału czynników wywołujących alergię na genetyczne i środowiskowe.

• Czynniki genetyczne:

Z biegiem lat, kiedy badania i obserwacje nad wpływem alergenów na organizm nabierały coraz większego rozmachu udowodniono jednoznacznie, że na ryzyko wystąpienia alergii mają wpływ obciążenia rodzinne. Stwierdzono, że rodzice z alergią posiadają dzieci o wiele częściej chore na alergię niż rodzice, którzy nie są alergikami. Badania pokazują iż prawdopodobieństwo wystąpienia alergii u potomstwa wynosi 50% w przypadku gdy oboje rodzice są alergikami. Warto zaznaczyć, że jeśli jeden z rodziców wykazuje alergie to szansa wystąpienia jej u dzieci wynosi 30%. Ciekawym aspektem jest to, iż obserwuje się, że na alergię częściej zapadają chłopcy niż dziewczynki, natomiast ryzyko wystąpienia alergii u potomstwa będzie większe w przypadku gdy alergikiem jest matka a nie ojciec. Znając prawa jakimi rządzą się reakcje alergiczne zaczęto poszukiwać zależności między alergią a genami i wykazanie predyspozycji do alergii. Badania przeprowadzone aby wyjaśnić ten problem pokazały, że nie istnieje jeden gen, który byłby odpowiedzialny za alergię. Stwierdzono zatem, że za wystąpienie schorzeń alergicznych odpowiedzialne są interakcje wielu genów kodujących białka uczestniczących w reakcjach immunologicznych.

Przykłady:

• Zależność między markerem w obrębie regionu 5q31-q33 a zwiększonym stężeniem IgE w surowicy. W regionie tym mieszczą się min geny dla cytokin IL-3, IL-5, IL-13 odpowiedzialnych za kontrolę wytwarzania przeciwciał IgE

• Marker chromosomowy alergii - 12q14.3-q24.1 W tym regionie mieści się min. gen dla IFN-g oraz gen dla białka STAT 6, które stanowi krytyczny sygnał dla rozwoju limfocytów pomocniczych Th2

• Gen zlokalizowany w chromosomie 11 w regionie 11q13. W egzonie 6 tego genu w kilku miejscach mogą występować, różne nukleotydy, które po procesie translacji mogą dać różne aminokwasy w pozycji 181 i 183. Wykazano, że jeśli w pozycji 181 i 181 wystąpi leucyna to koreluje to z wystąpieniem alergii.

• Czynniki środowiskowe:

Czynniki infekcyjne	Czynniki toksyczne
Endotoksyny bakteryjne	Dwutlenek siarki
Bakterie przewodu pokarmowego	Tlenek azotu
Niektóre szczepionki	Cząsteczki spalin silników Diesla
Zakażenia RSV	Dym papierosowy
Rynowirusy	Niektóre leki np. antybiotyki

Tabela 2. Czynniki środowiskowe warunkujące wystąpienie alergii

MECHANIZM REAKCJI ALERGICZNEJ

Mechanizm reakcji alergicznej po raz pierwszy został opisany przez Prausnitza i Kustnera w 1921 roku. Ogólnie mówiąc reakcje nadwrażliwości typu I są wynikiem pobudzenia przez alergen komórek tucznych uczulonych IgE.

Kolejne etapy to:

• prezentacja antygenu

• produkcja IgE

• aktywacja komórek tucznych

• uwolnienie mediatorów

• objawy kliniczne.

Po pierwszym kontakcie alergenu z błoną śluzową następuje złożona seria zdarzeń wiodąca do produkcji IgE. Produkcja IgE przez limfocyty B zależy od prezentacji alergenu przez komórki prezentujące antygen (APC) oraz od koordynacji między limfocytami B i limfocytami Th2. Limfocyty Th2 wydzielają cytokiny pobudzające proliferację komórek B, co sprzyja produkcji antygenowo swoistych IgE. Wyprodukowane miejscowo IgE uczulają najpierw miejscowe komórki tuczne, natomiast nadmiar IgE przedostaje się do krążenia gdzie dochodzi do wiązania ze swoistymi receptorami Fce (FcεRI) na krążących bazofilach i komórkach tucznych rozsianych po tkankach całego ciała. Gdy alergen dociera do uczulonej komórki tucznej, wywołuje wiązanie krzyżowe powierzchniowych IgE. Dochodzi zatem do wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca2+, co z kolei prowadzi do uwolnienia mediatorów takich jak histamina, proteazy oraz dochodzi do syntezy mediatorów lipidowych w postaci leukotrienów czy prostaglandyn. Te wymienione związki wywołują kliniczne objawy alergii. Warto nadmienić także, że komórki tuczne uwalniają cytokiny, które mogą nasilać reakcję zapalną i produkcję IgE.

Przebieg odpowiedzi immunologicznej na alergen

• Reakcja natychmiastowa (anafilaktyczna)

Bezpośrednią przyczyną wystąpienia tej reakcji są uwolnione z komórek tucznych i bazofili mediatory zwłaszcza histamina. Ten typ reakcji zachodzi bardzo szybko bo już po kilku minutach od momentu kontaktu z alergenem i ustępuje w ciągu godziny. Zespół objawów klinicznych który jest odbiciem reakcji natychmiastowej określany jest jako anafilaksja. Reakcje anafilaktyczne mogą występować z różnym nasileniem przy udziale różnych narządów i układów. W przypadku łagodnej reakcji wystąpić może pokrzywka bądź objawy świądu natomiast w najcięższej postaci reakcji anafilaktycznych może dojść do poważnej niewydolności układu krążenia i oddychania. Jest to wstrząs anafilaktyczny. Taka postać anafilaksji może powodować śmierć pacjenta. Wraz ze wzrostem uwalnianych mediatorów rośnie nasilenie objawów. Oprócz reakcji anafilaktycznych występują także reakcje u podstaw których leżą nieimmunologiczne mechanizmy aktywacji komórek tucznych. Taki typ reakcji określany jest mianem reakcji anafilaktoidalnych.

• Reakcja późna (LPR)

Ten typ reakcji zachodzi wówczas gdy dochodzi do częstego lub ciągłego narażenia na alergen co w konsekwencji prowadzi do przewlekłego stanu zapalnego oraz nieodwracalnego uszkodzenia tkanek, utrwalając np. astmę. Reakcja późnej fazy osiąga największe nasilenie w 6-10 godzin od kontaktu z alergenem. Pierwotnym podłożem LPR jest reakcja alergenu ze związanymi z komórkami tucznymi swoistymi przeciwciałami IgE. Nasilenie reakcji jest proporcjonalne do reakcji występującej w fazie natychmiastowej. Nieco inaczej wygląda degranulacja podczas reakcji późnej. Dochodzi do niej pod wpływem głównie leukotrienów a nie jak w przypadku reakcji natychmiastowej pod wpływem histaminy, trypazy czy prostaglandyn. Obraz kliniczny też jest odmienny. Jako przykład mogą posłużyć objawy kataru siennego które podczas reakcji natychmiastowej objawiają się w postaci kichania oraz występowania obfitej wydzieliny natomiast w przypadku reakcji późnej dochodzi do obrzęku i przekrwienia błony śluzowej co objawia się „zatkaniem” nosa.

Podstawowe objawy alergii:

• Katar

• Kaszel

• Kichanie

• Zapalenie spojówek

• Częste infekcje dróg oddechowych

• Objawy duszności

• Swędzące zmiany skórne

Immunoterapia swoista - ODCZULANIE

Immunoterapia swoista czyli odczulanie polega na podawaniu wzrastających dawek alergenu. Po raz pierwszy metoda ta została zastosowana w 1911 roku przez Noona. W rzeczywistości mechanizmy działania tej terapii nie są dokładnie poznane. Wiadomo jednak, że podczas immunoterapii alergenem dochodzi do wielu zmian w parametrach immunologicznych. Dochodzi min do indukcji przeciwciał IgA i IgG swoistych wobec alergenu (przeciwciała blokujące). Sądzi się iż ich zadaniem jest blokowanie poprzez wiązanie się z alergenem, uniemożliwiając tym samym wiązanie się z przeciwciałami IgE. Inne rozważanie zakłada możliwość hamowania wytwarzania IgE poprzez swoiste limfocyty B w wyniku interakcji kompleksów IgE-alergen z receptorami FcεRII na powierzchni tych komórek. U pacjentów chorych na alergię obserwuje się większe stężenie IgE we krwi w stosunku do osób zdrowych. Takie wyniki są najprawdopodobniej związane z zaburzeniami mechanizmów blokujących powstawanie IgE. Dodatkowo wykazano nasilenie stężenia swoistych IgE podczas zwiększonego sezonu na dany alergen. Podczas odczulania alergenem wykazano zwolnienie przyrostu swoistych IgE ale nie zawsze koreluje to ze zmniejszeniem objawów klinicznych. Na przestrzeni lat coraz wnikliwiej badano na czym polega immunoterapia swoista. Wiele badań wskazuje również na to, że zmniejszone wydzielanie IgE po immunoterapii jest w dużym stopniu wynikiem wzrostu liczby i aktywacji limfocytów pomocniczych Th1 wytwarzających miejscowo IFN-γ i IL-2 oraz spadku aktywności limfocytów Th2 które wytwarzają IL-4.

Immunoterapia nowotworów

Zdecydowana większość pacjentów obciążonych chorobą nowotworową leczona jest obecnie konwencjonalnymi metodami stosowanymi w onkologii tj. chemioterapią, radioterapią bądź chirurgicznie. Niestety techniki te (zwłaszcza chemio- i radioterapia ) wykazują bardzo silne działania niepożądane a skutki uboczne ich stosowania nierzadko wpływają na organizm tak destruktywnie jak rozwijający się nowotwór. Celem naukowców jest opracowanie metod pozwalających na wybiórcze i specyficzne „rozprawienie się” z komórkami guza. Jedną z bardzo obiecujących i bujnie rozwijających się dziedzin terapii nowotworowej jest tzw. immunoterapia obejmująca zespół metod leczenia, które modyfikując status immunologiczny pacjenta skutkują regresją a nawet i całkowitym usunięciem komórek rakowych. Immunoterapia zazwyczaj stosowana jest jako uzupełnienie konwencjonalnych metod leczenia, jednak dzięki sukcesom w ostatnich latach, wydaję się, iż na trwałe znalazła sobie miejsce we współczesnej onkologii.

2. TYPY IMMUNOTERAPII

Klasyczny podział immunoterapii nowotworów wyróżnia:

• IMMUNOTERAPIĘ CZYNNĄ - efekt terapeutyczny uzyskiwany jest na drodze wzmagania reaktywności immunologicznej pacjenta

• IMMUNOTERAPIĘ BIERNĄ - opartą na podawaniu przeciwciał

• IMMUNOTERAPIĘ ADOPTYWNĄ - polegającą na podawaniu komórek układu odpornościowego

Obecnie coraz powszechniej przyjmuje się jednak podział immunoterapii oparty na sposobie indukowania odpowiedzi przeciwnowotworowej tj.:

• IMMUNOTERAPIĘ NIESWOISTĄ obejmującą:

• preparaty immunostymulujące [ang. immunostimulants] i cytokiny

• monocyty, komórki LAK [ang. lymphokine activated killer] i in.

• IMMUNOTERAPIĘ SWOISTĄ obejmującą:

• „szczepionki” antynowotworowe [ang. cancer vaccines]

• przeciwciała monoklonalne

• limfocyty (głównie limfocyty T)

2.1 IMMUNOTERAPIA NIESWOISTA

Początków immunoterapii nieswoistej należy szukać na przełomie XIX i XX w. kiedy to amerykański chirurg William Coley podawał swym pacjentom jałowe nadsącze z hodowli bakterii Streptococcus pyogenes i Serratia mercescens (tzw. toksyny Coleya), uzyskując pewną skuteczność w leczniu nowotworów złośliwych. W świetle dzisiejszych badań efekt ten był najprawdopodobniej skutkiem indukcji wytwarzania w zastymulowanym preparatem bakteryjnym organizmie zwiększonych ilości TNF [ang. Tumor necrosis factor] oraz IL-1, 12, 15 i 18.

2.1.1 PREPARATY IMMUNOSTYMULUJĄCE I CYTOKINY

Preparaty immunostymulujące są substancjami działającymi nieswoiście, których celem jest wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej chorego. Spośród wielu dotychczas testowanych preparatów szczególnie skuteczne okazały się:

• Levamisol - lek immunostymulujący, którego skojarzenie z chemioterapią 5-FU (5-fluorouracyl) wybitnie obniżyło remisje nowotworów u pacjentów po resekcji guza okrężnicy

• BCG [franc. bacille Calmette Guerin] - preparat atenuowanych prątków gruźlicy; stosowany w nowotworach pęcherza moczowego, po resekcji guza w postaci wlewów dopęcherzowych

Aktualnie przeprowadzane są badania nad innymi adjuwantami m. in.:

• QS-21 - skojarzony ze szczepionkami antynowotworowymi (patrz niżej) w immunoterapii czerniaka

• DETOX

• DNP

Z kolei użyteczność cytokin w immunoterapii określona jest przez ich własności modulujące proliferację i funkcjonowanie wielu komórek organizmu m. in. takie jak: bezpośredni efekt cytotoksyczny, hamowanie proliferacji komórek rakowych, uwrażliwienie guza na efekt cytotoksyczny, aktywacja komórek układu immunologicznego, ułatwianie ich migracji i prezentacji antygenu etc. Najpowszechniej i najskuteczniej stosowanymi dotychczas cytokinami zarejestrowanymi w onkologii są:

• IFN-α - wykorzystywany w leczeniu od 1986 r.; skuteczny w schorzeniach tj. białaczka włochatokomórkowa, przewlekła białaczka szpikowa, mięsak Kaposiego, czerniak, nowotwory nerki

• IL-2 - zarejestrowana w 1992 r. przez FDA; stosowana w leczeniu raka nerki i czerniaka

Inne zastosowanie cytokin w immunoterapii polega na ich działaniu ochronnym, ograniczającym niepożądane efekty wywoływane chemio- i radioterapią (głównie ich destrukcyjny wpływ na czynność szpiku kostnego pacjenta) oraz użyciem cytostatyków. Do tego typy cytokin należą:

• G-CSF [ang. granulocyte colony-stimulating factor] - pobudzający proliferację granulocytów w szpiku

• GM-CSF [ang. granulocyte-macrophage colony-stimulating factor] - pobudzający proliferację granulocytów i makrofagów w szpiku

• IL-11 - pobudzająca powstawanie płytek krwi

• Erytropoetyna - pobudzająca regenerację erytrocytów

Inżynieria genetyczna umożliwiła wykorzystanie nie tyle gotowych cytokin, co genów je kodujących, w celu zwiększenia efektywności innych typów reakcji stosowanych w immunoterapii.

2.1.2 KOMÓRKI LAK I MONOCYTY

Kliniczne badania nad użyciem komórek LAK [ang. lymphokine activated killer] rozpoczęto ponad 20 lat temu. Pacjentom podawano duże dawki IL-2 w celu stymulacji prekursorów komórek LAK do proliferacji, limfocyty te następnie odzyskiwano z krwi, namnażano i spowrotem aplikowano chorym. Skuteczność tej terapii badano w stosunku do czerniaka, raka nerki i wątroby jednak nie okazała się ona specjalnie efektywna. Monocyty wykorzystywane są obecnie jako źródło komórek fagocytujących - makrofagów, które po stymulacji in vitro (rekombinowanymi cytokinami, głównie INF-γ - najsilniejszym znanym aktywatorem makrofagów)i podaniu miejscowym wykazują lokalny efekt terapeutyczny.

2.2 IMMUNOTERAPIA SWOISTA

2.2.1 SZCZEPIONKI ANTYNOWOTWOROWE

U przeważającej większości pacjentów obarczonych nowotworami dochodzi do silnego upośledzenia funkcjonowania ich układu immunologicznego - celem stosowania „szczepionek” antynowotworowych jest indukcja swoistych mechanizmów odporności podobnie jak ma to miejsce przy użyciu klasycznych szczepień przeciwko chorobom zakaźnym. Trzeba jednak podkreślić, że o ile w wypadku chorób zakaźnych stosowanie szczepionek ma charakter profilaktyczny o tyle podawanie „szczepień” nowotworowych zmierza do wyleczenia schorzenia już istniejącego. Potencjalnie jako „szczepionki” można stosować:

• całe komórki nowotworowe

• białka/peptydy w tym białka szoku cieplnego HSP [ang. heat shock proteins]

• komórki dendrytyczne [ang. dendritic cells DC]

• gangliozydy

• DNA/RNA

Aktualnie w tej formie terapii chorym aplikuje się komórki rakowe lub ich antygeny w połączeniu z tzw. adjuwantami czyli substancjami powodującymi wzmocnienie lub pojawienie się odpowiedzi na dany antygen np. BCG, QS-21, związki glinu. Szczepionki z komórek nowotworowych można podzielić na:

• autologiczne - oparte wyłącznie na materiale komórkowym pobranym od pacjenta

• allogeniczne - oparte o mieszaninę materiału komórkowego pochodzącego od różnych chorych

Wydaje się, że tego typu podejście może być szczególnie użyteczne w leczeniu nowotworów o dobrze określonych antygenach tj. czerniak (melanoma) - najbardziej zaawansowane badania kliniczne terapii szczepionkami dotyczą właśnie tego nowotworu. Ostatnio zarejestrowano lek pod nazwą Melacin będący mieszanką lizatów dwóch linii komórkowych melanoma połączonych z adjuwantem.

Innym, obiecującym wariantem immunoterapii szczepionkami jest zastosowanie odpowiednio przygotowanych komórek dendrytycznych [ang. dendritic cells DC].

Komórki dendrytyczne są najbardziej reaktywnymi i najskuteczniejszymi komórkami prezentującymi antygen [ang. antigen presenting cells APC], niezbędnymi do zainicjowania odpowiedzi immunologicznej. Przypuszczalnie, podanie wystarczająco dużej liczby DC, zdolnych do prezentacji antygenów nowotworowych (np. DC fuzjowane z komórkami rakowymi, transfekowane genami antygenów nowotworowych etc.) wywoła efektywną odpowiedź immunologiczną. Podejście takie wydaje się dobrze rokować w badaniach nad czerniakiem, rakiem prostaty i chłoniakami.

Postęp w dziedzinie technik rekombinacji DNA sprawił, że możliwe stało się wprowadzanie obcych genów do komórek organizmów wyższych w tym do komórek nowotworowych. Szczepionki immunologiczne najnowszej generacji polegają na genetycznej modyfikacji ex vivo komórek rakowych pacjenta przez transfer do nich genów dla cytokin (tj IL-2, IL-4, IL-7, TNF, GM-CSF i in.), cząsteczki CD80 czy antygenów nowotworowych pewnych wirusów (np. krowianki - antygen karcyno-embrionalny CEA, wirus Epsteina-Barra EBR i in.) a następnie immunizację pacjenta tak przygotowanym preparatem. Działanie to ma na celu maksymalną stymulację układu odpornościowego chorego. Ze względu na fakt, iż nowotwory złośliwe o etiologii wirusowej stanowią kilkanaście procent wszystkich ludzkich nowotworów złośliwych, wykorzystanie szczepionek z zastosowaniem wirusów i ich antygenów ma szanse spowodować przełom w ograniczaniu zachorowań na tego typy nowotwory.

2.2.2 PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNE

Przeciwciała monoklonalne (mAb ang. Monoclonal AntiBodies) są przeciwciałami, które wykazują jednakową swoistość względem danego antygenu i ewentualnie takie samo lub podobne powinowactwo do niego. Do leczenia nowotworów zastosowano je po raz pierwszy w 1982 r. a więc niecałe 7 lat po ich odkryciu przez Cesara Milsteina i Georgesa Koehle. Niestety początkowy entuzjazm ostudziły dalsze wyniki badań i testów klinicznych, gdyż okazało się, że na skuteczność immunoterapii z zastosowaniem tego typu przeciwciał wpływa ogromna gama czynników, dość często trudnych do wyeliminowania, związanych zarówno z samym przeciwciałem (np. krótki okres półtrwania w organizmie, wysoka immunogenność - jako obce białka wywołują u pacjenta odpowiedź immunologiczną, a powstające w jej wyniku antyprzeciwciała niwelują ich działanie), rozwijającym się nowotworem (tj. charakter zmiany, stopień ukrwienia i przepuszczalność naczyń guza, gęstość antygenu docelowego na jego komórkach etc.) oraz pacjentem poddawanym leczeniu (np. stopień reaktywności układu odpornościowego, wydolność nerek i wątroby). Aktualne badania zmierzające do poprawy skuteczności i zmniejszenia objawów niepożądanych działania przeciwciał monoklonalnych dotyczą m. in.

• modyfikacji struktury przeciwciał w celu obniżenia ich immunogenności (przeciwciała chimeryczne i humanizowane)

• zmniejszenia masy cząsteczkowej przeciwciał

• łączenia przeciwciał z toksynami (tzw. immunotoksyny), izotopami, cytostatykami

Kliniczne zastosowanie przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z toksynami ma na celu m.in. aktywację bądź modulację mechanizmów cytotoksycznych u chorego np. przeciwciała połączone z czynnikiem jadu kobry [ang. cobra venom factor] - aktywacja układu dopełniacza, przeciwciała połączone z IFN-α - aktywacja komórek NK [ang. natural killers] lub bezpośrednie działanie cytotoksyczne np. łączenie przeciwciał z radioizotopami, cytostatykami tj. winblastyna, metotreksat, daunomycyna, toksynami roślinnymi tj. rycyna, modecyna, saporyna.

Bardzo obiecujące i dobrze rokujące na przyszłość wydaje się być użycie w terapii tzw. przeciwciał monoklonalnych bispecyficznych (o podwójnej swoistości), których jedno ramię skierowane jest przeciwko strukturze docelowej na komórce guza, podczas gdy drugie ma na celu zwiększenie skuteczności antynowotworowej - np. poprzez sprzęgnięcie z toksyną czy skierowanie go przeciwko cząsteczkom powierzchniowym na komórkach efektorowych (tj.komórkach produkujących przeciwciała lub wykazująca własności regulatorowe, pomocnicze, cytotoksyczne).

Innym stosunkowo nowym podejściem jest zastosowanie tzw. terapii „przeciwciało - enzym - prolek”, w którym to przeciwciało zostaje sprzęgnięte z enzymem katalizującym konwersję nieczynnej formy leku (proleku) w formę aktywną. Rozwiązanie to pozwala skutecznie ograniczyć toksyczność stosowanych dotychczas chemioterapeutyków - efekt leczniczy realizowany jest głównie na poziomie zmiany nowotworowej.

2.2.3 LIMFOCYTY

Jak wspomniano, w klasycznym ujęciu immunoterapii stosowanie limfocytów należy do tzw. terapii adoptywnej. Wykazano, iż najskuteczniej działającą in vivo populacją tych komórek są komórki TIL [ang. tumor-infiltrating lymphocytes] - limfocyty naciekające guz. TIL migrują swoiście do guza, co w połączeniu np. z transfekowaniem ich genami dla TNF bądź IL-2 może skutecznie zwiększyć efektywność ich cytotoksycznego działania - zarówno bezpośredniego jak i pośredniego.

Najnowsze projekty badań immunoterapeutycznych opierają się na wykorzystaniu metod inżynierii genetycznej do wyprodukowania rekombinowanych, wysoce specyficznych względem komórek nowotworowych toksyn a także użycia immunoliposomów - tłuszczowych kulek, wypełnionych prekursorami chemioterapeutyków i ukierunkowanych na komórki guza swoistymi przeciwciałami. Immunoliposomy po endocytozie i fuzji z lizosomem komórki nowotworowej uwalniają aktywną formę leku. Obecne wyniki testów klinicznych jednoznacznie wskazują, że immunoterapia wpisuje się coraz silniej w kanon technik terapeutycznych stosowanych we współczesnej onkologii. Na razie w zdecydowanej większości przypadków pełni ona jednynie rolę uzupełniającą dla leczenia konwencjonalnego (chemioterapii, radioterapii i postępowania chirurgicznego). Niewątpliwie jednak można stwierdzić, że dziedzina ta, zmierzająca w swych głównych celach do uzyskania coraz bardziej wybiórczego efektu antynowotworowego (ochrona zdrowych tkanek) i zmniejszenia nierzadko bardzo silnych i trudnych do zniesienia dla pacjenta efektów niepożądanych towarzyszących stosowaniu metod standardowych, będzie stawać się dominującym orężem współczesnej medycyny w walce z chorobami nowotworowymi.

Wybuch tlenowy

Układ odpornościowy

Układ odpornościowy organizmu jest szeroko pojętą barierą dla czynników zewnętrznych mających charakter patogenu, a usiłujących zaburzyć jego integralność. To skomplikowany twór, na który składa się szereg powiązanych ze sobą reakcji, w które zaangażowanych jest wiele różnorakich molekół, komórek i całych narządów. Jeśli już jednak patogen wniknie do organizmu, układ odpornościowy jest aktywowany i mówimy wówczas o tzw. reakcji odpornościowej. Tę z kolei można podzielić na humoralna i komórkową. Wybuch tlenowy, którego specyfikę niniejszy artykuł zawiera, mieści się w ramach odporności komórkowej.

Odpowiedź komórkowa

Odpowiedź komórkowa organizmu opiera się na komórkach żernych zwanych fagocytami. Stanowią one nijako pierwszą linię obrony wobec patogenu, i ma ona charakter nieswoisty. Do fagocytów zaliczamy granulocyty, monocyty oraz ich pochodne - makrofagi. Określane są one także mianem „profesjonalnych komórek fagocytujących”, gdyż jako pierwsze docierają one do miejsc zapalnych, a w strukturze ich błon komorkowych zlokalizowane są receptory zwiększające efektywność fagocytozy.

Neutrofile i makrofagi

Neutrofile, czyli inaczej granulocyty obojętnochłonne to komórki mające średnicę około 12-15um. Posiadają charakterystyczne wypustki cytoplazmatyczne i wielopłatowe jądro. Zawierają cztery rodzaje pęcherzyków komórkowych otoczonych błoną, zwane powszechnie ziarnistościami. Zawierają one rozwinięty aparat enzymatyczny, który warunkuje ich aktywność bakteriobójczą. Posiadają intensywny metabolizm, a zwłaszcza wysoką glikolizę tlenową, fosforylacją oksydacyjną, oraz aktywne przemiany cyklu pentozo-fosforanowego.

Makrofagi to jedne z największych komorek układu odpornościowego. Ich wyznacznikiem jest drobne jądro, obfita cytoplazma, spore ilości wydłużonych mitochondriów, lizosomy oraz pinosomy. W peryferycznej części cytoplazma przyjmuje kształt charakterystycznych pseudopodiów. W zwiazku z dużą ruchliwością tych komórek, wyjątkowo dobrze rozwinięty jest cytoszkielet. Złożoność cytoplazmy oraz organelli komórkowych zależy od stopnia zaktywowania makrofaga, aczkolwiek obserwuje się wysoki metabolizm nawet w stanie spoczynkowym. Na powierzchni błony komorkowej znajduje się szereg charakterystycznych receptorów. Fenotypowy profil monocytów jest wysoce podobny do fenotypu makrofagów. Różnice to większa ekspresja cząstek CD14, ICAM1 (CD54), CD64 oraz MHCII u makrofagów. Monocyty kolei wykazują wyższa obecność cząstek układu dopełniacza (CD18, CR1, CR3, CD11b). Jaka jest róznica w działaniu między makrofagami a neutrofilami? Otóż makrofagi działają wolniej niż neutrofile, potrzebują także więcej czasu na zaktywowanie, przez co nijako działają mniej skutecznie. Ich przewaga objawia się w przypadku walki z gabarytowo dużym intruzem (grzyby, pierwotniaki), którego ze względu na własne duże gabaryty łatwiej i sprawniej może neutralizować.

Uproszczony schemat reakcji odpornościowej, prowadzący do wybuchu tlenowego.

Reakcję inicjuje wniknięcie patogenu do organizmu, co wyzwala kaskadę następujących po sobie procesów zwaną ostrą odpowiedzią zapalną. Dalej następuje wzrost przepuszczalności naczyń krwionośnych, wnikanie zaktywowanych neutrofili do zainfekowanej tkanki (proces marginalizacji i oddziaływania integryn) oraz pobudzanie płytek krwi. Komórki żerne są przyciągane do zainfekowanych tkanek poprzez czynniki chemotaktyczne (np. fragment dopełniacza C5a, formylpeptydy, leukotrieny), a proces migracji odbywa się zgodnie z gradientem czynnika chemotaktycznego. Chemotaksja doprowadza fagocyta do celu jakim jest patogen, który zopsonizowany czynnikiem chemotaktycznym ulega szybkiej internalizacji przez komórkę żerną (immunofagocytoza). W jej wnętrzu tworzy się pęcherzyk, zwany fagosomem, który ulega fuzji z lizosomem...

Na tym etapie dochodzi do właściwej neutralizacji patogenu: dewastacja jego struktury i całkowity rozpad. Procesy, które do tego się przyczyniają można ogólnie podzielić na dwie kategorie. Są to mechanizmy tlenowe oraz działające bez użycia tlenu.

Mechanizmy pozatlenowe.

Zaliczamy tu szereg czynników, przede wszystkim enzymatycznych. W wyniku degranulacji lizosomu do wnętrza pęcherzyka, zostaje uwolnionych szereg enzymów litycznych: elastaza, kolagenazy, lipazy, deoksyrybonukleazy, polisacharydazy, sulfatazy, fosfatazy. Najbardziej charakterystyczne wydzielane wówczas czynniki to: BPI (zwiększa przepuszczalność błony, aktywuje niektóre enzymy bakteryjne), katepsyna G (proteaza), defensyny (peptydowe antybiotyki, uszkadzające błonę i ją perforujące), kateliny (peptydy kationowe o podobnym do defensyn działaniu), lizozym/muraminaza (destabilizuje ścianę komórkową bakterii), laktoferyna (wiąże niezbędne bakteriom żelazo) i wiele innych.

Mechanizmy tlenowe.

Fagocyty aktywnie żerujące wykazują nawet kilkudziesięciokrotne zwiększenie zużycia tlenu, czemu towarzyszy maksymalizacja spalania glukozy w cyklu pentozo - fosforanowym. Nie jest to typowy proces zachodzący w mitochondrium, ponieważ jak dowiodły badania, nie hamują go azydki i cyjanki. Dalsze intensywne prace w tym kierunku dały odpowiedź: komórki fagocytujące masowo wytwarzają aktywne formy tlenu, których destruktywne działanie okresla się mianem wybuchu tlenowego.

Znaleziono wiele czynników, które stymuluja komórki żerne do przeprowadznia wybuchu oddechowego:

• N-formylopeptydy pochodzenia bakteryjnego, także syntetyczne

• Estry forbolu (np. 1,2-mirystynian-1,3-octan forbolu

• Jonofory Ca2+ (związki umożliwiające napływ Ca2+ do komórek) np. A23187

• Lektyny, np. konkawalina A

• DAG

• Wielonienasycone kwasy tłuszczowe, np. kwas arachidonowy

• Siarczan cerebrozydu

• Jony fluorkowe

• Leukotrien B4

• TNF

• Czynnik aktywujący płytki krwi

• PDGF

• Składnik dopełniacza C5a

• Kompleksy antygen-przeciwciało

• Opsonizowane cząstki obcego pochodzenia

Obecnie wiemy, że za wybuch tlenowy odpowiada kilka związków, których synteza jest ze sobą powiązana.

• Anionorodnik ponadtlenkowy. Synteza anionorodnika ponadtlenkowego to proces inicjujący całą kaskadę syntezy form aktywnych tlenu. Związek ten powstaje w wyniku przyjęcia przez tlen cząsteczkowy jednego elektronu.

Reakcję ta katalizuje enzym - oksydaza NADPH. Donorem elektronu jest właśnie NADPH, co tłumaczy intensywność procesów szlaku pentozo-fosforanowego, zachodzących w zaktywowanym fagocycie (ich produktem jest własnie NADPH). Rodnik ponadtlenkowy znajduje się w stanie równowagi z uprotonowaną formą - rodnikiem nadhydroksylowym. Anionorodnik ponadtlenkowy jest sam w sobie stosunkowo mało toksyczny, toteż ulega on dalszym przemianom.

• Nadtlenek wodoru to kolejna reaktywna forma tlenu. Jak powstaje? Otóż w sytuacji odpowiednio wysokiego stężenia anionorodnika ponadtlenkowego, co dla zaktywowanej komórki żernej jest łatwe do osiągnięcia, ta reaktywna forma tlenu podlega spontanicznej dysmutacji, której produktem jest właśnie nadtlenek wodoru. Gdy stężenie nie jest odpowiednio duże, uwidacznia się rola dysmutazy ponadtlenkowej - enzymu, który katalizuje reakcję syntezy.

Także nadtlenek wodoru nie stanowi formy wybitnie toksycznej tlenu, acz w obecności neutralnych proteaz serynowych obserwuje się zwiększenie jego działania.

• Rodnik hydroksylowy. Źródłem rodników hydroksylowych jest reakcja Fentona, katalizowana przez jony żelazawe.Dawcą żelaza jest laktoferryna lub transferryna (białka wiążące żelazo). Reakcja ta jest wydajna w kwaśnym pH, które same w sobie sprzyja uwalnianiu jonów żelazawych. Rolę katalizatora mogą także pełnić dwuwartościowe jony kobaltu oraz miedzi.

Rodnik hydroksylowy to wysoce silny utleniacz. Działa niewybiórczo i zasadniczo z pierwszą napotkaną cząsteczką. Z racji swej wysokiej reaktywności jego czas trwania jest bardzo niski, od około 100ps do 1ns.

• Tlen singletowy. Tlen w podstawowym stanie energetycznym występuje w formie trypletowej, przez co rozumiemy zgodność spinu dwóch elektronów nie sparowanych na ostatnim orbitalu antywiążącym. W chwili wzbudzenia może nastąpić sparowanie elektronów (wówczas zgodnie z zakazem Pauliego spiny muszą być przeciwne), lub też alternatywnie może nastąpić odwrócenie spinu jednego elektronu bez ich sparowania. W obu przypadkach tlen przechodzi do stanu singletowego, który ze względu na spory nadmiar energii jest wysoce reaktywny, a przez co i toksyczny.

• Kwas podchlorawy oraz chloramina. Końcowymi etapami szlaku syntezy reaktywnych form tlenu jest proces powstawania kwasu podchlorawego oraz chloramin. Reakcję utlenienia halogenków do kwasu podhalogenkowego z równoczesnym rozłożeniem nadtlenku wodoru, katalizuje mieloperoksydaza. HOCl jest związkiem bakteriobójczym. Jego działanie polega na atakowaniu kompleksów żelazo-siarkowych białek, stanowiących kluczowy element łańcucha oddechowego. Blokuje w ten sposób szlak energetyczny i doprowadza do śmierci bakterii. Chloramina powstaje w reakcji kwasu podchlorawego z amoniakiem.

Chloramina jest związkiem nawet bardziej toksycznym od kwasu podchlorawego, ma silne właściwości bakteriobójcze.

Charakterystyka kluczowych enzymów wybuchu tlenowego.

• Oksydaza NADPH To enzymatyczny kompleks, w swojej budowie skomplikowany, mający liczne podjednostki. W nie zaktywowanym fagocycie, część z nich rozlokowana jest w cytoplazmie, cześć natomiast jest zakotwiczona w błonie komórkowej. Aktywacja komórki żernej powoduje migrację podjednostek cytozolowych oraz ich asocjacje ze składowymi błonowymi. Proces ten daje czynny, zdolny do syntezy enzym. Oksydaza cytochromowa jest de facto częścią łańcucha transportu elektronów:

Element łancucha	wartość potencjału
NADPH / NADP+	-320mV
FADH2 / FAD+	-280mV
Cyt b558 red / Cyt b558 utl	-245mV
O2.- / O2	-160mV

• Tabela 1. Ogniwa łańcucha transportu elektronów

Pewną rolę w przekazie elektronu pełni tutaj również ubichinon.

Charakterystyka podjednostek oksydazy NADPH.

podjednostka	L. aa	Cechy strukturalne	Interakcje i rola.
gp91-phox	570	podj. cyt. b558, wiąże cząsteczkę hemu i FAD	Wiąże białko p47-phox i NADPH, białko błony, podstawowa jedn. Katalityczna oksydazy
p22-phox	195	podj. cyt. b558 , wiąże cząst. Hemu, 2 motywy bogate w prolinę	Wiąże domeny Sh3 białkap47-phox, białko błony, główna jedn. katalityczna oksydazy
p47-phox	390	Białko kationowe, miejsca fosforylacji (Ser), 2 domeny SH3, 2 motywy bogate w Prolinę	Wiąże się z domenami SH3 białek p67 i p40-phox, a także z motywem bogatym w prolinę p22-phox, konieczny do aktywacji
p67-phox	526	2domeny SH3, motyw bogaty w prolinę	Wiąże się z motywami bogatymi w prolinę białka p47-phox, wiąże białko Rac1/2, niezbędny aktywacj
p40-phox p67-phox	337	1 domena SH3, homolog białka p47-phox	Wiąże się z motywami bogatymi w prolinę białka p47-phox oraz p67- phox, nie wymagany do aktywacji
Rac1/2	192	Przynależy do rodziny białek Rho	Wiąże się z RhoGDI i p67-phox, element aktywacji oksydazy
Rap 1A	184	Przynależy do rodziny białek Ras, reszta izoprylenowa	Zakotwiczony w błonie, związany z białkiem p22-phox cyt. b558

Aktywacja oksydazy cytochromowej Aktywację oksydazy NADPH można podzielić na dwa etapy. Pierwszy to klasyczna transdukcja sygnału. Po zadziałaniu stymulatora, który wiąże się z odpowiednim receptorem na powierzchni błony fagocyta (typu R7G, odziaływujący z białkami G), następuje pobudzenie fosfolipazy C, która rozkłada fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan do 1,4,5-trifosforanu inozytolu (IP3) i diacyloglicerolu (DAG). IP3 mobilizuje wewnątrzkomórkowy Ca2+, DAG z kolei aktywuje kinazę białkową C (PKC). Etap drugi to składanie czynnościowego enzymu. Proces inicjuje zaktywowana PKC, która fosforyluje składową p47-phox. Powoduje to asocjację p47-phox z dwiema pozostałymi jednostkami p67-phox i p40-phox, a utworzony trimer migruje do błony komórkowej gdzie wiąże się z flawonocytochromem. Końcowym procesem składania enzymu jest dysocjacja kompleksu RhoGDI-RacGDP, której produkt - białko Rac po przyłączeniu GTP łączy się z czynnikiem p67-phox.

• Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD)

Znane są dwie eukariotyczne dysmutazy ponadtlenkowe: miedziowo-cynkowa (cytoplazmatyczna) oraz manganowa (mitochondrialna). Rola SOD ogranicza się generalnie do katalizy w przypadku niskiego stężenia O2.- , ponieważ reakcja ta zachodzi spontanicznie i z duża szybkością przy odpowiednio dużym stężeniu.

• Mieloperoksydaza (MPO)

Przechowywana jest głownie w azurofilnych ziarnistościach neutrofili, oraz w ziarnistościach monocytów i eozynofili, natomiast praktycznie brak jej u makrofagów. MPO jest homo glikoproteiną złożona z czterech podjednostek o łącznej masie około 153kDa. W jej skład wchodzą także dwie hemowe grupy prostetyczne. Znaleziono trzy odmiany MPO różniące się nieznacznie masą podjednostki, aczkolwiek nie stwierdzono istotnych różnic w reaktywności poszczególnych form.

Metody pomiaru wybuchu tlenowego.

Spopularyzowanych jest kila metod detekcji oraz pomiaru intensywności wybuchu tlenowego. Najszerzej stosowana jest chemiluminescencja (CL), rzadziej pomiary redukcji cytochromu c, czy akumulacji tlenu i jego zużycia. Chemiluminescencja to zjawisko emisji kwantów światła wzbudzonej reakcją chemiczną zachodząca w komórce. Używa się do tego celu związków i niektórych atomów, których stan wzbudzony posiada energię odpowiednio wyższą, aniżeli stan podstawowy. W praktyce stosuje się egzogenne dla komórki związki chemiczne, które w reakcji z wysoce reaktywnymi wolnymi rodnikami tworzą wzbudzone wysokoenergetyczne produkty emitujące światło. W pracy laboratoryjnej najczęściej stosuje się luminol, lucygeninę, kompleks lucyferyna&lucyferaza. Atutem wymienionych odczynników jest wybitne (tysiąckrotne) zwiększenie intensywności chemiluminescencji w porównaniu z przebiegająca naturalnie.

Wybuch tlenowy - wybrana problematyka.

Jak ważny dla reakcji odpornościowej organizmu jest wybuch tlenowy? Czy szereg innych procesów immunologicznych, w tym efektywne procesy pozatlenowej destrukcji patogenu w fagosomie, są w stanie skutecznie przeciwdziałać infekcji? W wyniku zaburzeń funkcjonalnych oksydazy NADPH obserwujemy stan chorobowy zwany ziarnicą złośliwą. Podłoże genetyczne wyklucza skuteczne leczenie, aczkolwiek ostatnio podjęto próby stosowania terapii genowej. Chorzy na ziarnicę są bardzo podatni na wszelkie infekcje, których przebieg jest ostry i powoduje szereg komplikacji. Reaktywne formy tlenu jako czynniki ekstremalnie toksyczne stanowią także potencjalne zagrożenie dla organizmu je wytwarzającego. By związane z tym ryzyko wyeliminować, organizm posiada szereg zabezpieczeń antyoksydacyjnych, które niwelują problem. Przede wszystkim miejsce wydzielania ograniczone jest zasadniczo do fagosomu (degranulacja wewnątrzkomórkowa). W przypadku „ucieczki” aktywnych form tlenu do cytoplazmy, ratunek stanowi aparat enzymatyczny, w skład którego wchodzi katalaza, dysmutaza ponadtlenkowa i reduktaza glutationowa. Właściwości antyutleniaczy posiada także szereg innych związków obecnych w komórce. Zaliczamy do nich aminokwas - cysteinę, alfa-tokoferol, czy kwas askorbinowy. Wadliwe funkcjonowanie układu antyoksydacyjnego jest uważane za jedną z przyczyn takich schorzeń jak reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie przyzębia, odma płuc.

Rola układu dopełniacza w mechanizmach odporności

Białka układu dopełniacza

Układ dopełniacza u człowieka składa się z ponad 20 rozpuszczalnych glikoprotein. Większość z nich jest wytwarzana przez hepatocyty i monocyty. Obecność białek dopełniacza jest konstytutywna we krwi i innych płynach ustrojowych. Do białek układu dopełniacza należą:

• C1 (C1q, C1r, C1s), C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9. Białka te były nazywane w kolejności odkrywania, dlatego cyfry arabskie przy literze "C" nie oddają kolejności udziału w reakcji dopełniacza,

• Czynniki B, D, H, I oraz properdyna P - białka związane z alternatywną drogą aktywacji dopełniacza,

• Lektyna wiążąca mannozę MBL (ang. mannose binding lectin), proteazy serynowe MASP-1, MASP-2 (ang. MBL associated serine proteases) - białka obecne w drodze lektynowej aktywacji dopełniacza,

• inhibitor C1, C4-BP (ang. C4-binding protein), DAF (ang. decay accelerating factor), MCP (ang. membrane cofactor protein), CD59 (protektyna), białko S (witronektyna), receptor C1 (CR1) - białka regulatorowe.

Aktywacja dopełniacza.

Aktywacja dopełniacza polega na serii enzymatycznych i nieenzymatycznych reakcji o charakterze kaskadowym. Możliwe są trzy drogi aktywacji dopełniacza: klasyczna, alternatywna oraz lektynowa. W przypadku każdej z dróg dochodzi do utworzenia dwóch istotnych enzymów: konwertazy C3 i konwertazy C5, które bardzo silnie wzmacniają efekt dopełniacza. Niezależnie od sposobu aktywacji końcowe etapy wszystkich trzech kaskad są identyczne i doprowadzają do utworzenia kompleksu atakującego błonę MAC (ang. membrane attacking complex), odpowiedzialnego za lizę bakterii.

Droga klasyczna

Cechą charakterystyczną klasycznej drogi aktywacji dopełniacza jest zależność od przeciwciał. Przeciwciała zdolne do aktywacji to IgM oraz IgG (oprócz podklasy IgG4). .

Kolejność zdarzeń w aktywacji dopełniacza drogą klasyczną (kolejne punkty odpowiadają numerom na rysunku):

1. Fragmenty Fab przeciwciał rozpoznają epitopy na powierzchni drobnoustrojów. Cząsteczki C1q dopełniacza przyłączają się do fragmentów Fc przeciwciał. Do aktywacji dopełniacza konieczne jest połączenie przynajmniej dwóch (z sześciu) domen C1q z dwoma fragmentami Fc.

2. Interakcje przeciwciała-C1q wywołują zmianę konformacyjną cząsteczki C1q, co z kolei pobudza C1r oraz C1s - proteazy serynowe. C1r ulega autokatalizie, następnie przecina, i tym samym uaktywnia, proteazę C1s. Aktywne białko C1s ma zdolność rozkładu czynników C4 i C2.

3. Aktywna proteaza C3 rozkłada C4 do C4a i C4b. C4a jest uwalniane do środowiska reakcji (osocza lub płynu tkankowego).

4. Fragment C4b łączy się z błoną komórkową bakterii.

5. Białko C2 przyłącza się do C4b, w efekcie proteaza C1s rozkłada C2 do C2a i C2b (uwalniany do środowiska reakcji). Powstaje kompleks C4b2a, nazwany konwertazą C3.

6. Konwertaza C3 rozkłada składnik C3 do C3a (uwalniany do środowiska reakcji) oraz C3b, który może przyłączyć się do błony komórkowej patogenu i funkcjonować jako opsonina lub przyłączyć się do konwertazy C3, tworząc konwertazę C5.

7. Konwertaza C5 rozkłada białko C5 do C5a (uwalniany do środowiska reakcji) oraz C5b. Ten drugi fragment bierze udział w tworzeniu MAC.

Niezwykle istotne dla prawidłowego działania dopełniacza są konwertazy. Ich znaczenie wynika przede wszystkim z wzmacniającego działania: pojedyncza konwertaza C3 może potencjalnie wyprodukować setki tysięcy cząsteczek C3b, z których każda może dać początek kolejnej konwertazie C3 lub C5. Z kolei konwertaza C5 może wyprodukować znaczne ilości C5b, a każda z tych cząsteczek może potencjalnie utworzyć nowy MAC. Podobną rolę odgrywa także proteaza C1s, która może dostarczyć dużych ilości C4b.

Droga alternatywna (properdynowa)

Droga alternatywna rozpoczyna się spontanicznie (bez udziału przeciwciał) i atakuje każdą dostępną błonę biologiczną z wyjątkiem błon komórek własnych organizmu, na których jest unieszkodliwiana.

Kolejność zdarzeń w aktywacji dopełniacza drogą alternatywną (kolejne punkty odpowiadają numerom na rysunku):

1. W osoczu występuje białko C3(H₂O), będące pobudzoną formą C3. Ta cząsteczka może wiązać czynnik B, który w obecności jonów magnezu oraz czynnika D jest rozbijany na fragmenty Ba (uwalniany do środowiska reakcji) oraz Bb

2. Fragment Bb pozostaje związany z C3(H₂O). Powstały kompleks jest aktywny enzymatycznie i tworzy rozpuszczalną konwertazę C3 drogi alternatywnej.

3. Rozpuszczalna konwertaza rozbija białko C3 do C3a oraz C3b, który może się przyłączać do błony komórkowej.

4. Związany z błoną C3b przyłącza czynnik B, który przy udziale czynnika D jest rozbijany na Ba i Bb. Fragment Bb pozostaje związany z C3B, w ten sposób powstaje związana z błoną konwertaza C3 drogi alternatywnej (C3bBb), która jest dodatkowo stabilizowana czynnikiem P, czyli properdyną. Z tego powodu droga alternatywna nazywana bywa także properdynową.

5. Konwertaza C3 rozkłada białko C3, dając w efekcie C3a i C3b. Czynnik C3b może przyłączyć się do błony. Może również przyłączać się do kompleksu C3bBb (konwertazy C3), tworząc konwertazę C5 drogi alternatywnej.

6. Konwertaza C5 rozkłada C5 do anafilatoksyny C5a oraz fragmentu C5b, który zapoczątkuje tworzenie MAC.

Droga lektynowa

Droga lektynowa jest w ogólnych zarysach podobna do drogi klasycznej. Różnią się one tylko pierwszymi etapami. W przypadku drogi lektynowej obecność przeciwciał nie jest potrzebna. Przeciwciała są zastąpione kolektynami, białkami nieswoiście wiążącymi cukry na powierzchni drobnoustrojów. Do kolektyn należą m.in. białka surfaktantu płucnego A i D oraz lektyna wiążąca mannozę (MBL), występująca w osoczu.

Lektyna wiążąca mannozę jest głównym czynnikiem zapoczątkowującym drogę lektynową. Podobnie jak C1q ma ona 6 domen globularnych umieszczonych na długim styliku, który może wiązać proteazy serynowe MASP-1 i MASP-2. Gdy nastąpi związanie MBL do powierzchni antygenu, MASP-1 zostaje aktywowana na skutek zmiany konformacyjnej trzonka MBL. Aktywna MASP-1 może dokonać proteolitycznego cięcia MASP-2 (analogia do aktywacji proteazy C1s przez C1r). Ten enzym z kolei jest odpowiednikiem C1s i może rozkładać C2 i C4. Dalsze etapy są identyczne jak w klasycznej drodze aktywacji dopełniacza.

Droga alternatywna i droga lektynowa mają duże znaczenie w walce z patogenami, mogą bowiem zapoczątkować reakcję odpornościową bezpośrednio po wniknięciu drobnoustroju do organizmu. Podczas gdy droga klasyczna może być rozpoczęta dopiero na skutek wytworzenia przeciwciał, co następuje po upływie pewnego czasu od pojawienia się antygenu w organizmie.

Tworzenie kompleksu atakującego błonę

Tworzenie kompleksu atakującego błonę MAC (membrane attacking complex) składa się wyłącznie z reakcji nie wymagających aktywności enzymatycznych. Po wytworzeniu C5b przez konwertazę dowolnej z dróg aktywacji dopełniacza, dochodzi do połączenia się C5b z C6. W kolejnym kroku do C5b-6 dołączane są C7 i C8. Powstaje kompleks C5b-8, który ma zdolność włączania się w błonę komórkową i przyłączania cząsteczek C9. Przyłączenie 2-14 cząsteczek C9 powoduje utworzenie w błonie komórkowej kanału. Powstanie kanałów powoduje wypływ z komórki jonów, ATP, substancji odżywczych. Równocześnie do komórki napływa woda (ze względu na wyższe ciśnienie osmotyczne w komórce). Mogą się do niej dostawać także czynniki bakteriobójcze i bakteriostatyczne (np. lizozym) oraz antybiotyki.

Funkcje układu dopełniacza

Układ dopełniacza odpowiada za wiele ważnych mechanizmów efektorowych odpowiedzi immunologicznej:

• Zapoczątkowanie (ostrego) zapalenia przez bezpośrednią aktywację komórek tucznych (peptydy zapalne C3a i C5a). Wiązanie anafilatoksyn C3a oraz C5a do receptorów komórek tucznych pobudza degranulację ich ziarnistości i uwalnianie mediatorów farmakologicznych takich jak histamina, która powoduje skurcz mięśni gładkich i wzrost przepuszczalności naczyń krwionośnych.

• Składnik C5a wykazuje aktywność chemotaktyczną, przyciąga neutrofile do miejsca ataku bakterii.

• Wzmocnienie wiązania między bakterią i fagocytem ułatwiające pochłonięcie bakterii (opsonizacja). Monocyty, makrofagi, neutrofile i erytrocyty posiadają na powierzchni receptory dla składników dopełniacza: C3b, C4b. Peptydy C3b oraz C4b pełnią rolę opsonin, opłaszczają bakterię. Związanie receptorów z opsoninami wzmacnia kontakt bakteria-komórka żerna i ułatwia fagocytozę. Erytrocyty poprzez receptory CR1 (CD35) wiążą kompleksy immunologiczne (ich składnikiem jest C3b), by dostarczyć je do wątroby i śledziony w celu usunięcia przez komórki żerne.

• Zabijanie drobnoustrojów przez kompleks atakujący błonę. Składniki C5b do C9, a w szczególności C9, tworzą pory w błonie komórki docelowej. Poprzez te kanały transbłonowe następuje wyciek wewnątrzkomórkowych składników i napływ wody do wnętrza komórki. W rezultacie komórka ulega lizie.

Regulacja aktywności dopełniacza

Dopełniacz ze swoją zdolnością indukowania fagozytozy, degranulacji komórek tucznych z uwolnieniem bardzo aktywnych biologicznie czynników, zdolnością wywoływania lizy komórki poprzez tworzenie MAC jest groźną bronią i bez mechanizmów regulujących jego aktywność, łatwo mógłby prowadzić do uszkodzenia naszych własnych komórek.

Mechanizmy i czynniki regulujące aktywność układu dopełniacza można podzielić na takie, które są związane z błonami komórkowymi oraz takie, które działają w płynach tkankowych, głównie w osoczu.

Czynniki regulujące obecne w błonach komórkowych:

• CR1 (CD35) - kofaktor dla czynnika I rozkładającego C4b i C3b. Inaktywuje także konwertazy C3 i C5 (czynniki C3b i C4b są ich składnikami), chroniąc komórki mające na powierzchni CR1 przed "przypadkową lizą".

• DAF (CD55) - decay accelerating factor - wybitnie przyspiesza spontaniczny rozpad konwertaz C3 i C5 obydwu dróg. Działa przeciwnie do properdyny. Występuje na krwinkach, komórkach śródbłonka naczyń i wielu innych komórkach.

• MCP (CD46) - membrane cofactor protein - wiąże składniki C3b i C4b będące w stanie wolnym lub obecne w konwertazie. Jest kofaktorem dla czynnika I. Podobnie jak DAF zapobiega formowaniu na powierzchni błony konwertaz C3. MCP jest obecny prawie na wszystkich komórkach jądrzastych.

• HRF (C8bp - C8 binding protein) - hamuje polimeryzację C9, formowanie się kompleksu atakującego błonę MAC i tworzenie się kanałów. HRF występuje na limfocytach T i B, neutrofilach i monocytach.

• Protektyna (CD59) - analog HRF, występujący między innymi w błonie komórkowej wszystkich krwinek i plemników.

Czynniki osoczowe regulujące aktywność dopełniacza:

• Inhibitor C1 - wiąże aktywny C1r i C1s blokując dalszą aktywację. Zabezpiecza organizm przed konsekwencjami spontanicznej aktywacji. Silne aktywatory klasycznej drogi aktywacji dopełniacza (np. kompleksy immunologiczne) przełamują tę blokadę.

• Czynnik I - inaktywator C3b/C4b - jest proteazą osocza rozkładającą C3b i C4b zarówno wolne jak i związane w konwertazach. Do aktywności wymaga kofaktorów. Kofaktorem czynnika I w błonach są CR1, CR2 oraz MCP, a w płynach tkankowych czynnik H oraz białko wiążące C4.

• Białko wiążące C4 - wiążąc C4b, przyspiesza rozpad konwertazy C3 drogi klasycznej (zarówno rozpad spontaniczny jak również wywołany przez czynnik I).

• Czynnik H - wiążąc C3b, przyspiesza rozpad konwertazy C3 drogi alternatywnej.

• Witronektyna (białko S) - wiąże się z kompleksem C5b-7 i uniemożliwia polimeryzację C9. Hamuje łączenie się C5b-7 z błoną komórkową.

Receptory naturalnych zabójców

• Komórki NK (natural killers) - limfocyty wykazujące naturalną cytotoksyczność. Zabijają komórki docelowe (niektóre komórki nowotworowe i komórki zakażone wirusem) bez wcześniejszej immunizacji. NK należą do wrodzonego systemu odporności.

Cechy morfologiczne:

• Liczne azurofilne ziarna cytoplazmatyczne (LGL)

• Niska wartość stosunku powierzchni jądra do powierzchni cytoplazmy

• Nerkowate jądro z wyraźną heterochromatyną i jąderkiem

• Liczne mikrokosmki i pofałdowania powierzchni komórki

Pochodzą z prekursorów dojrzewających w szpiku, komórki macierzystej wspólnej dla limfocytów B i T. Różnicowanie się komórek NK w dojrzałe formy o aktywności cytotoksycznej uzależnione jest od wpływu cytokin, które wydzielane są przez komórki zrębu szpiku. Najważniejsze z nich to IL - 15 (czynnik komórek macierzystych - SCF), ligand Flt3 i IL - 4. Komórki NK są limfocytami których receptory nie ulegają rearanżacji, co różni je od limfocytów B i T. Receptory NK mają różnorodne strategie przez co po połączeniu w różnych kompleksach rozpoznają inne komórki docelowe. Po odkryciu tych możliwości zauważono podobny system w innych komórkach, a także fakt ekspresji tych samych receptorów NK na limfocytach T.Dojrzałe komórki NK krążą przez pewien czas we krwi, a następnie osiedlają się w narządach. Migracja komórek tych do tkanek i narządów jest możliwa dzięki oddziaływaniu receptorów z ligandami na komórkach śródbłonka. Receptory biorące udział w oddziaływaniu to głównie: LFA-1, Mac-1, VLA-4 i CD31. Relatywnie dużo komórek NK jest w wątrobie stanowią tam 50% wszystkich limfocytów).Komórki NK na swojej powierzchni mają liczne cząsteczki wspólne dla różnych komórek układu odpornościowego. CD56 (izoforma cząsteczki adhezji komórek nerwowych) jest jednym ze specyficznych markerów dla tych komórek. Inną cząsteczką spotykaną na powierzchni NK jest CD16 - receptor dla fragmentu Fc IgG.

Receptory.

• 1. Receptory lektynowe :

• a) Receptory te są reprezentowane przez kompleks CD94/NKG2. Kompleks ten może pośredniczyć w hamowaniu lub aktywowaniu komórek NK. CD94 jest kodowany przez gen na chromosomie 12 i nie zawiera cytoplazmatycznego motywu ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs), przez co nie jest w stanie blokować aktywacji komórek NK. CD94 nie potrafi sam związać HLA, możliwe to jest dzięki związaniu różnych białek NKG2 (które zawierają motyw ITIM). Powstaje między nimi wiązanie kowalencyjne. Tworzone są różnorodne dimery które zyskują specyficzność wiązania HLA. Po połączeniu CD94 z NKG2A i B, kompleks ten ma zdolność blokowania aktywności komórek NK, zaś po połączeniu z NKG2C, dochodzi do aktywacji tych komórek. NKG2D jest ważną cząsteczką w aktywacji komórek NK. Przekazywanie sygnału przez błonę jest możliwe dzięki cząsteczką adaporowym. Należą do nich CD3, FcRγ i KARAP/DAP12 (aktywują kinazę Syk). Ludzki NKG2D jest związany z transmembranowym adaptorem - DAP10, który zawiera motyw YxxM i aktywuje szlak 3 - kinazy fosfatydyloinozytolu. NKR - P1 (CD161) jest innym receptorem lektynopodobnym występującym na komórkach NK. Aktywują one cytotoksyczną ścieżkę komórek NK. Występuje on w wielu wariantach: A - aktywuje komórki NK; C - jest charakterystyczny dla komórek mysich.

• b) Ly - 49 - jest receptorem najwcześniej poznanym z grupy lektyn, obecnym na komórkach NK. Występuje tylko u myszy. Receptor ten jest dimerem kodowanym przez geny w chromosomie 6 i może istnieć w 20 odmianach. Większość odmian wykazuje właściwości hamujące (np. Ly - 49A i Ly - 49C). Zdolności hamujące tych receptorów jest związana z obecnością motywów ITIM w części cytoplazmatycznej tych cząsteczek. Te receptory, które nie zawierają motywów ITIM cechują się zdolnościami aktywującymi, gdyż mogą wiązać się z cząsteczką DAP12 zawierająca cząsteczkę ITIM.

• 2. Receptory z nadrodziny cząsteczek immunoglobulinopodobnych.

• U człowieka występują receptory hamujące zabijanie określane jako KIR (killer cell inhibitory/ immunoglobulin-like receptors). Receptory KIR są glikoproteinami które występują zarówno na powierzchni komórek NK jaki i limfocytów T, kodowanymi przez geny zlokalizowane na chromosomie 19. Receptor ten oddziałuje z cząsteczką MHC klasy I innych komórek. Receptory KIR podzielono ze względu liczbę zewnętrznych domen immunoglobulinowych, na dwie grupy:

• KIR2D(p58) - mają dwie domeny

• KIR3D(p70) - mają trzy domeny

• W każdym z tych receptorów występuje cytoplazmatyczny ogon. Długość ogona koresponduje z rodzajem pełnionej funkcji przez KIR. Obecność długiego ogona z dwoma motywami ITIM (immune tyrosine-based inhibitory motifs), umożliwia przesyłanie hamującego sygnału, zaś krótki nadaje zdolności aktywujących tym receptorom. Więc receptory KIR2D i KIR3D mogą istnieć w wariantach mających długi fragment cytoplazmatyczny z motywami ITIM określanych KIR2DL i KIR3DL i z krótkim odcinkiem cytoplazmatycznym, w których brak jest motywu ITIM i określane są KIR2DS i KIR3DS. Mogą one wiązać błonowe białka adaptorowe zawierające motywy ITAM, np. łańcuch CD3ζ, FcεRIγ, DAP12, które przewodzą sygnały aktywujące.

• Receptory KIR można także podzielić ze względu na powiązanie pomiędzy różnymi kompleksami HLA. Jest to związane z tym, że geny kodujące KIR cechuje duży polimorfizm. Najbardziej znane haplotypy KIR należą do dwóch grup nazwanych A i B. Do grupy A zaliczamy 7 genów kodujących KIR, zaś do grupy B należy duża liczba różnorodnych genów kodujących KIR. Grupę A odróżnia od grupy B brak fragment 24kb, który odkryto po analizie metodą Southern z wykorzystaniem enzymu HindIII.Geny dla receptorów KIR, CD94-NKG2 oraz dla HLA znajdują się na różnych chromosomach, dlatego ligandy oraz receptory są segregowane niezależnie od siebie i według uznania. Ludzkie komórki NK wykorzystują receptory zarówno lektynopodobne jak i immunoglobulinopodobne jako inhibitory dla kompleksu HLA klasy I. Oba typy receptorów oddziałują z różnymi podtypami HLA. Lektynopodobne (CD94-NKG2- A) wiążą się z HLA A, -B i -C, zaś i immunoglobulinopodobne z HLA -B i -C.Własności aktywujące ma kodowany w pobliżu KIR2D i KIR3D receptor NKp46, a także receptory NKp44 i NKp30. Te receptory określane są jako receptory naturalnej cytotoksyczności - NCR. Receptory NKp46 są kodowane przez kompleks genów, które zawierają także geny dla NKp44 i 30. Wszystkie trzy receptory są białkami transmembranowymi zawierającymi motyw ITIM. Ligandy dla tych receptorów znajdują się na komórkach nowotworowych. Receptory NKp30 po połączeniu z ligandem komórki docelowej nie tylko powodują jej lizę ale również umożliwiają oddziaływanie pomiędzy komórkami NK a komórkami dentrytycznymi. NKp46 - jest glikoproteiną, która ma dwie cytoplazmatyczne Ig - podobne domeny. Cząsteczka ta odgrywa ważną rolę w zabijaniu komórek nowotworowych, a także zainfekowanych patogenami.

• Na komórkach ludzkich NK występują również inne receptory immunoglobulinopodobne, które mogą występować na innych leukocytach. Należą do nich cząsteczki z rodziny ILT: immunoglobulinopodobny transkrypt 2 (ILT2) i 4 (ILT4, również nazywany CD85, leukocyte Ig - like receptor - LIR). Receptory te mają zdolność oddziaływania z MHC klasy I i przesyłają sygnały hamujące cytotoksyczność komórek NK. Należą do tej grupy receptory z rodziny LAIR (leukocyte - associated inhibitory receptors), a także cząsteczki CS1 i 2B4 (CD244). LAIR - 1 należy do rodziny receptorów błonowych immunoglobulinopodobnych. Cząsteczka ta jest w 30% homologiczna do superrodziny hamujących cząsteczek, zaś w 32% do rodziny immunoglobulinopodobnych cząsteczek transkrypcyjnych. LAIR - 1 jest transmembranową glikoproteiną (32kDa), aktywuje fosfatazy tyrozynowe SHP - 1 i SHP - 2, które uczestniczą w hamowaniu cytotoksycznych własności komórek NK. DNAM - 1 jest transmembranową glikoproteiną wytwarzaną przez komórki NK, limfocyty T i monocyty. Receptor ten powoduje lizę komórki docelowej po związaniu się z cząsteczką CD155 - receptor wirusa polio lub CD112 (Nectin-2).

• 3. Inne receptory.

• Oprócz receptorów rozpoznających cząsteczki MHC klasy I, na komórkach NK zaobserwowano obecność wielu innych cząsteczek, aktywujących te komórki lub ułatwiających ich aktywację. Do grupy tej należą: LFA-1 (CD11a/CD18) reagujące z ICAM-1 (CD54), CD2 reagujące z LFA-3(CD58) oraz CD244 (2B4) reagujące z CD48. Cząsteczka, która może uczestniczyć w aktywacji komórek NK jest również CD16, który jest receptorem dla fragmentu Fc IgG.Cząsteczka CD244 (2B4) jest receptorem aktywującym komórki NK. Wiąże się z CD48 na komórce docelowej, indukuje produkcję cytokin i cytotoksyczność.

Aktywacja:

• Receptory aktywujące działanie komórek NK zostały podzielone na trzy grupy: receptory zawierające motyw ITAM (CD12, NKp46, NKp44); receptor NKG2D związany z cząsteczką DAP10; oraz pozostałe receptory, które mają różne ścieżki aktywacji, np.CD2, 2B4, DNAM1. Pierwsza grupa: transmembranowe receptory z ITAM - immunoreceptor tyrosine - based activation motif. Do grupy tej należą CD3γ, CD3 δ, CD3ε, z, Igα , Igβ , FcεRIγ oraz DAP12. Wszystkie wymienione cząsteczki charakteryzują się wspólnym zewnętrznokomórkowym regionem, kwasem asparaginowym w części śródbłonowej (może też być lizyna lub arginina) oraz cytoplazmatycznym fragmentem, który zawiera jeden lub więcej motywów ITAM. Kwas asparaginowy jest potrzebny do związania białka z podjednostką receptora wiążącą ligandy. Kiedy zostanie związany ligand, tyrozyna znajdująca się w ITAM, ulega fosforylacji, głównie przez kinazę z rodziny Src. Ufosforylowanie tyrozyny powoduje aktywację cytoplazmatycznych kinaz z rodziny Syk: Syk lub ZAP-70, które aktywują czynniki transkrypcyjne: Atp(NFATp) i NFATc. Komórki NK wytwarzają głównie trzy typy transmembranowych białek zawierających ITAM motywy: ζ, FcεRIγ oraz DAP12. W komórkach NK: ζ, FcεRIγ, występują jako homodimery lub heterodimer połączone wiązaniem disiarczkowym, zaś DAP12 jest homodimerem. ζ, FcεRIγ wiążą się z cząsteczką CD16, oraz z fragmentem Fc IgG, który jest odpowiedzialny za zależna od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC). Po związaniu się ligandu z receptorem CD16 dochodzi do aktywacji czynników transkrypcyjnych, także powoduje degranulację, produkcję cytokin i może prowadzić do apoptozy komórek NK.

• Rysunek 5 prezentuje niektóre receptory komórek NK, zawierające motyw ITAM. Z receptorem NKR-P1C myszy wiąże się z homodimerem FcεRIγ, ludzki NKp46 wiąże się zarówno z homodimerem FcεRIγ, z homodimerem oraz heterodimerem z, FcεRIγ. Z receptorem KIR2DS wiąże się homodimer DAP12.Do drugiej grupy należy receptor NKG2D, który jest aktywowany przez DAP10. DAP10 jest transbłonowym białkiem, ma niewielki zewnątrzkomórkowy fragment, zaś region śródbłonowy zawiera kwaśny aminokwas, domena cytoplazmatyczna jest odpowiedzialna za przenoszenie sygnału. Cytoplazmatyczny fragment nie posiada motywu ITAM, obecny jest stały fragment YINM. Łączy się z nim podjednostka PI3K (kinaza 3 fosfatydyloinozytolu), p85, która wiąże również Grb2. Połączenie receptora NKG2D z DAP10, powoduje produkcję cytokin i ma właściwości cytotoksyczne na komórkę docelową. DAP10 aktywuje cząsteczkę Akt, zwaną także PKB, która zapobiega ewentualnej apoptozie komórki NK. Do dzisiaj nie wiadomo czy tak naprawdę to tylko cytoplazmatyczna domena kompleksu NKG2D - DAP10 (należąca do DAP10) jest odpowiedzialna za przesyłanie sygnału do wnętrza komórki, czy również pewien udział ma sam receptor NKG2D. Przeciwko temu świadczy fakt, że sekwencja aminokwasowa tego regionu u myszy, szczurów i u człowieka jest tylko w niewielkim stopniu podobna, zaś cząsteczka DAP10 jest wysoce konserwatywna.

• Cząsteczka 2B4 należy do trzeciej grupy receptorów. Cytoplazmatyczny fragment tego receptora zawiera stały motyw TxYxxV/I z którą wiąże się z wewnątrzkomórkowa kinaza Src (SH2), która zawiera białko adaptorowe (SLAM- signaling lymphocyte activation molecule−associated protein) SAP. SAP może wiązać się ze SLAM, który jest ligandem aktywującym proliferację i produkcję IFN w zaktywowanych limfocytach T. SAP wiąże także inne cząsteczki, a szczególnie te które zawierają motyw TxYxxV/I, charakterystyczny dla 2B4 i NTB-A. Dokładnie nie jest znany mechanizm szlaku aktywacji związanego z cząsteczką 2B4 i SAP.

Hamowanie:

• Komórki NK wykazują aktywność cytolityczną przeciwko nowotworom i komórkom zainfekowanym wirusami. Ekspresja cząsteczek MHC klasy I na powierzchni komórki hamuje własności cytotoksyczne NK. Poznano wiele receptorów NK, które oddziałują z kompleksem MHC klasy I i wysyłają do wnętrza komórki sygnał inhibicji. U myszy głównym receptorem hamującym jest wymieniony wcześniej receptor lektynopodobny Ly49. U człowieka najlepiej poznanymi receptorami są KIR i CD94. KIR- receptory hamujące zabijanie, dostarczają sygnału po rozpoznaniu cząsteczki MHC klasy I na komórce docelowej. CD94 jest receptorem należącym do rodziny lektynopodobnych. Fosforylacja tyrozyny w regionie ITIM, który jest fragmentem cytoplazmatycznym jest procesem krytycznym dla aktywacji fosfatazy tyrozyny SHP-1 i dla hamowania. Aby sygnał inhibicji dotarł do wnętrza komórki musi zajść interakcja pomiędzy receptorem a fosfatazą tyrozyny.Badania mechanizmu hamowania wykazały znaczny wpływ cząsteczki PTP-1C w tym zjawisku. PYP-1C jest komórkowym mediatorem funkcji zabijania. Prawdopodobnie po fosforylacji tyrozyny w p58, cząsteczka ta wiąże się z PTP-1C. Wiązanie to następuje w miejscu pomiędzy dwoma motywami ITIM, do których asocjują domeny SH2 PTP-1C. Pod wpływem sygnału hamującego następuje redukcja ufosforylowania kluczowych cząsteczek biorących udział w aktywacji komórek NK. Defosforylacji ulegają głównie: kinaza ZAP-70, PLCγ. W zjawisku hamowania obserwujemy również inhibicję produkcji cząsteczki InsP3.

Ligandy.

• NKG2D oddziałuje z sześcioma ligandami: MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3 i ULBP4. MICA i MICB nie są ekspresjonowane na większości komórkach, znajdują się na komórkach śródbłonka w wyniku szoku cieplnego oraz na komórkach śródbłonka i fibroblastach zainfekowanych CMV. Wszystkie cztery ULBP pojawiają się na komórkach w wyniku różnych stymulacji. Na przykład: na fibroblastach zainfekowanych CMV obecne są ULBP1, ULBP2 i ULBP3 (w różnym czasie po infekcji). ULBP (UL-16 binding proteins) jest cząsteczką MHC - podobną na komórce rakowej. Powoduje ona zwiększenie zdolności litycznych komórek NK, oraz zostaje zwiększona produkcja INFγ i TNFβ.

• Wirusowe hemaglutyniny są ligandami dla NKp46 i NKp44. NKp30 i NKp46 rozpoznają siarczan heparanu, związanego z błoną na komórkach nowotworowych.

• Dla receptorów 2B4 (CD244) cząsteczką aktywującą jest CD48, która znajduje się na hematopoetycznych komórkach.

• CD16 (FcγRIII) jest ligandem dla receptora zawierającego motyw ITAM (FcεRIγ). DNAM-1 tworzy kompleks z LAF-1 na komórkach NK, ulegają fosforylacji przez PCK i wiąże się z CD155 oraz CD112. Ligandy dla DNAM-1 znajdują się przede wszystkim na komórkach śródbłonka.

• Zmiany na powierzchni komórek NK pozwalają na ochronę komórek zdrowych. Związane jest to z cząsteczkami MHC klasy I i cząsteczkami MHC - podobnymi (ULBP, MICA). Pierwszy obrazek (1) pokazuje, że komórki NK są hamowane po związaniu HLA-E z receptorem CD94/NKG2A, drugi (2) hamowanie przez HLA-C receptora KIR. W przypadku receptora KIR może występować z trzema domenami Ig i wtedy wiąże się z ligandami: HLA-A i HLA-B. Na rysunku 7 występuje także receptor aktywujący (AR) cytotoksyczność komórek NK. Receptor ten zawiera cytoplazmatyczny motyw ITAM, dostarczony przez cząsteczkę DAP12.

• “Gubienie się”. Na powierzchni komórek nowotworowych czy zainfekowanych wirusem nie obserwujemy ekspresji cząsteczek HLA-E. Brak tego ligandu dla receptora CD94/NKG2A prowadzi do aktywacji komórek NK (A1). Brak na powierzchni innego allotypu np. HLA-C prowadzi również do aktywacji naturalnych zabójców (receptor KIR nie ma ligadu niezbędnego do inhibicji - A2). Poznanie zjawiska “ gubienie siebie” pozwoliło na zrozumienie sposobu rozpoznawania komórki docelowej przez receptory NK.

• ”Indukcja siebie”. Ekspresja ligandu dla NKG2D jest obecna na komórkach zainfekowanych wirusem, transformowanych, a także poddanych stresowi komórkowemu (B), co powoduje aktywacje komórek NK mimo obecności receptorów hamujących - superaktywacja. NKG2D może związać się również z ULBP i MICA/B.

• ”Zmiana siebie” (C). cząsteczka indukująca stres - hsp60 dostarcza sekwencję sygnałową peptydu, która wiąże się do HLA-E. Jest to przyczyną nie rozpoznania przez receptor hamujący - CD94/NKG2A (C1), ale nie dotyczy to receptorów KIR (C2).

Komórki NK wyposażone są w receptory i mechanizmy pozwalające na samoistne rozróżnianie komórek, które należy zabić, a które należy oszczędzić. Mechanizmy te różnią się istotnie od sposobu rozpoznawania przez limfocyty T, chociaż wewnątrzkomórkowe szlaki aktywacji są analogiczne i wynikają z fosforylacji tyrozyn w obrębie takich cząsteczek jak CD3ζ, FcεRIγ, bądź białek z grupy DAP12. Wydaje się prawdopodobne, że podobnie jak w przypadku limfocytów T w trakcie rozwoju komórek NK dochodzi do eliminacji klonów potencjalnie niebezpiecznych dla organizmu, mających receptory rozpoznające własne komórki i tkanki.

Gdy apoptozy jest za mało... Autoimmunizacyjny zespół limfoproliferacyjny

Apoptoza, czyli programowana śmierć komórki, jest procesem fizjologicznym, niezbędnym do prawidłowego funkcjonowania organizmu. W przeciwieństwie do nekrozy, jest formą aktywną pozbywania się komórek niepotrzebnych i uszkodzonych. Przykładem procesów, w których uczestniczy apoptoza są: embriogeneza, homeostaza tkanek i narządów oraz prawidłowe funkcjonowanie komórek układu immunologicznego.

Wiadomości podstawowe o apoptozie można znaleźć w artykule Skotnicka03 "Apoptoza - krótkie wprowadzenie"

Apoptoza może być inicjowana na dwa sposoby: poprzez mechanizm mitochondrialny, który jest wynikiem uszkodzeń komórki albo poprzez zewnątrzkomórkowy sygnał przekazywany przez receptory śmierci.

Receptory śmierci należą do rodziny receptorów błonowych TNF (TNF - tumor necrosis factor). Charakterystyczną cechą TNF jest to, że zawierają domeny śmierci (DD - death domain) w części cytoplazmatycznej receptora. Do rodziny TNF należą np: Fas, TNFR1, CAR1 i p75. Przekazywanie sygnału do apoptozy rozpoczyna się przyłączeniem liganda do receptora, następnie w ciągu kilku minut następuje rekrutacja białek adaptorowych (przekazujących sygnał), które z kolei generują wewnątrzkomórkową kaskadę enzymów proteolitycznych, kaspaz, co w konsekwencji powoduje śmierć komórki.

SZLAK Fas/FasL

Jednym z receptorów śmierci jest receptor Fas (zwany również CD95, APO-1). Jego ligandem jest ligand Fas (FasL). Fas ulega ekspresji na różnych typach tkanki, zaś FasL przede wszystkim na limfocytach T. Główną rolą szlaku Fas/FasL jest eliminacja zaktywowanych dojrzałych (często autoreaktywnych) limfocytów T, uczestniczy również w ochronie przed zapaleniem takich miejsc jak mózg, oko, jądra oraz bierze udział w mechanizmie zabijania komórek transformowanych i zakażonych wirusami.

Sekwencja zdarzeń proapoptotycznych w szlaku Fas/FasL rozpoczyna się połączeniem receptora Fas z FasL (Fas ligandem), które wymusza trimeryzację receptora Fas. Następnie do Fas przyłącza się białko adaptorowe FADD (Fas-associated death domain) poprzez interakcję domen śmierci obu cząsteczek. Prokaspaza 8 lub 10 asocjuje do FADD przez domenę efektorową śmierci (DED - death effector domain) FADD i dzięki temu może ulec aktywacji - tworzy się kaspaza 8 albo 10. Receptor Fas, FADD oraz prokaspaza 8 lub 10 tworzą tzw. kompleks inicjujący apoptozę (DISC - death-inducing signaling complex). Następnie zaktywowana kaspaza 8 albo 10 jest uwalniana do cytozolu gdzie inicjuje kaskadę kaspaz, która prowadzi do apoptozy komórki.

ROZWÓJ LIMFOCYTÓW A APOPTOZA

Rozwój populacji limfocytów jest regulowany szczególnie poprzez apoptozę. Apoptoza limfocytów odpowiada za ich tolerancję względem antygenów własnego organizmu oraz skuteczność obrony, gdyż tylko poprawnie dojrzewające limfocyty mogą przeżyć. Przykładowo w czasie dojrzewania w grasicy, limfocyty T, których receptory odpowiedzialne za rozpoznawanie antygenu (TCR - T cell receptor) nie uległy odpowiedniej rearanżacji, umierają. Również takie limfocyty, który rozpoznają antygeny organizmu są eliminowane na drodze apoptozy w procesie zwanym negatywną kontrolą. Limfocyty B w szpiku kostnym w czasie swojego dojrzewania również mogą ulec apoptozie w analogicznych sytuacjach jak limfocyty T.

W dojrzałych limfocytach również może dojść do programowanej śmierci komórki. Jest to proces niezbędny, ponieważ w czasie dojrzewania limfocytów uzyskują one tolerancję na te antygeny, które są obecne w szpiku kostnym lub grasicy. Jednak w tych częściach organizmu nie występują antygeny np. tarczycy. Powoduje to, że po tej wstępnej selekcji w krwioobiegu mogą znajdować się autoreaktywne limfocyty.

Przykładem eliminacji autoreaktywnych, dojrzałych limfocytów T jest proces zwany AICD - activation-induced cell death (w przybliżeniu - śmierć komórki aktywowana stymulacją). Jest to spowodowane ciągłą stymulacją TCR, najczęściej dużą ilością antygenów organizmu, w konsekwencji czego dochodzi do śmierci komórki. Przy braku tej eliminacji w węzłach chłonnych limfocyty T mogą zacząć proliferować i uczestniczyć w odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko własnemu organizmowi. W czasie tego procesu dochodzi do interakcji między receptorem Fas i Fas ligandem (FasL), limfocyty T ekspresjonują jednocześnie Fas i FasL, przez co są zabijane przez siebie same lub przez interakcję z innymi zaktywowanymi limfocytami T.

Co ciekawe w eliminacji autoreaktywnych, dojrzałych limfocytów B biorą udział autoreaktywne limfocyty T. Teoretycznie limfocyt T powinien aktywować limfocyt B, jednak zamiast tego prezentuje mu FasL, przez co limfocyt B ulega apoptozie.

Podsumowując, szlak apoptozy, w którym bierze udział Fas i FasL jest niepodważalnie ważny w prawidłowym dojrzewaniu limfocytów, ponieważ uczestniczy w utrzymania tolerancji układu immunologicznego względem antygenów organizmu.

ALPS - TROCHĘ HISTORII

Zespołem chorób, który jest związany z nieprawidłowościami w szlaku Fas/FasL jest autoimmunizacyjny zespół limfoproliferacyjny. Początkowo opisywano go u myszy, na których prowadzono badania mające na celu poznanie mechanizmu przekazywania sygnału do apoptozy. U myszy z ALPS występowały mutacje w różnych cząsteczkach zaangażowanych w szlak Fas/FasL np. w receptorze Fas, FasL, kaspazie 8. Tworzono również knock-outy. Po raz pierwszy zainteresowano się przypadkiem ALPS u człowieka w 1990 w USA, jednak wtedy jeszcze ta choroba nie miała swojej nazwy i na podstawie badań na myszach tylko domyślano się, w jaki sposób powstaje. W 1995 ALPS otrzymało swoją nazwę, a po odkryciu dokładnych molekularnych mechanizmów powstawania ALPS rozpoczęto analizować u ludzi wpływ mutacji cząsteczek zaangażowanych w apoptozę na rozwój limfocytów, ich proliferację oraz, przede wszystkim, autoreaktywność.

DIAGNOZA

Charakterystyczną cechą ALPS są powiększone węzły chłonne i śledziona. Powodem takiego objawu choroby jest akumulacja limfocytów. Spowodowane jest to brakiem apoptozy limfocytów T, które mogą ulegać proliferacji oraz aktywować limfocyty B, które również zaczynają się namnażać.

Innymi objawami ALPS, dzięki którym stawia się diagnozę, jest znaczący wzrost ilości podwójnie negatywnych limfocytów T w krwioobiegu (DNT-double negative T, CD4-CD8-). Wartość prawidłowa wynosi 0,1 - 0,9% DNT ze wszystkich limfocytów T, która w przypadku ALPS wartość ta może wynosić powyżej 70%. Dla potwierdzenia choroby wykonuje się również testy indukcji apoptozy limfocytów in vitro.

Informacjami, które mogą potwierdzić diagnozę są: występowanie w rodzinie osób chorych na ALPS, typowe zmiany w obrazie histopatologicznym tkanki śledziony lub węzła chłonnego oraz wykryte mutacje w genie kodującym Fas lub inne białka związane z przekazywaniem sygnału do apoptozy.

Objawy niezbędne	1. Powiększenie węzłów chłonnych i śledziony
		2. podwyższony poziom DNT
		3. brak apoptozy limfocytów indukowanych nadmiarem antygenu w testach in vitro
	Objawy niekonieczne	1. chorzy na ALPS w rodzinie
		2. charakterystyczne zmiany w obrazie histopatologicznym tkanki węzłów chłonnych i śledziony
		3. mutacje w genach kodujących Fas lub inne cząsteczki biorące udział w przekazywaniu sygnału do apoptozy

Tabela 1. Kryteria diagnozy ALPS

Inną cechą ALPS, która nie jest często brana pod uwagę jako kryterium, jest występowanie u pacjentów chorób autoimmunologicznych (często tylko czasowo), które są głównie spowodowane występowaniem przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom organizmu. Powodem tego jest fakt, że przy braku funkcjonalnego Fas albo cząsteczek przekazujących sygnał nie dochodzi do śmierci autoreaktywnych limfocytów B mimo ekspresji FasL na limfocytach T. Przy mutacji FasL nie dochodzi do stymulacji szlaku Fas/FasL, czego skutkiem jest również brak apoptozy autoreaktywnych limfocytów. Autoreaktywne limfocyty B mogą więc bez problemów proliferować i wytwarzać IgM, a po stymulacji przez limfocyt T i przełączeniu klasy przeciwciał, autoreaktywne IgG o wysokiej specyficzności.

Jednak nie są to jedyne problemy, które mogą napotkać chorzy na ALPS. U wielu pacjentów występuje anemia hemolityczna, neutropenia (niedobór granulocytów obojętnochłonnych) i trombocytopenia (niedobór płytek krwi), która może nawet doprowadzić do poważnych krwotoków.

Podsumowując, ze względu na mnogość bardzo różnych objawów choroba ta została nazwana zespołem, przez powszechne występowanie towarzyszących chorób autoimmunologicznych mówi się o autoimmunizacyjnym zespole, a powiększenie węzłów chłonnych i śledziony spowodowane nadmiarem limfocytów wpłynęło na na ostateczną nazwę autoimmunizacyjny zespół limfoprolifearcyjny.

TYPY ALPS

Ze względu na złożoność szlaku Fas/FasL wyróżnia się kilka typów ALPS związanych z mutacjami różnych cząsteczek biorących udział w przekazywaniu sygnału. Są to: Typ 0, Ia, Ib, II i III. Najczęściej występującą mutacją, bo aż w 75% przypadków chorych, jest mutacja genu kodującego Fas.

ALPS 0

W przypadku ALPS 0 pacjenci wykazują taką homozygotyczną mutację białka Fas, że brak jest funkcjonalnej formy receptora Fas. Konsekwencją tego jest brak apoptozy, w którą zaangażowany jest ten receptor. Cechą wyróżniającą ten typ ALPS jest to, że powiększone węzły chłonne widoczne są już u noworodka. Oznacza to, że wzmożony proces proliferacji limfocytów rozpoczął się już w okresie prenatalnym. Oprócz powiększonych węzłów chłonnych występują choroby autoimmunologiczne o łagodnym przebiegu. Charakterystyczny jest również fenotyp limfocytów T u takich pacjentów - ponad 70% to limfocyty DNT. Co ciekawe po pewnym czasie u pacjentów z ALPS zaczyna się obserwować apoptozę limfocytów. Sugeruje to, że przy wadliwym szlaku Fas/FasL tworzy się alternatywny szlak programowanej śmierci komórek.

ALPS Ia - częściowy niedobór Fas

ALPS Ia spowodowany jest mutacją tylko w jednym genie kodującym Fas. Mutacje te mogą być różne, jednak zdecydowana większość dotyczy części wewnątrzkomórkowej receptora Fas a szczególnie domen śmierci, które biorą udział w przekazywaniu sygnału do cząsteczki FADD. Jednak nawet pacjenci o tej samej mutacji w genie kodującym Fas mogą się różnić symptomami, jest nawet możliwa sytuacja, w której jedna z tych osób będzie asymptotyczna a u drugiej objawy się pojawią. Prawdopodobnie mają na to wpływ czynniki środowiskowe i nieznane do tej pory czynniki genetyczne. Warto zwrócić uwagę na fakt, że zespół limfoproliferacyjny Ia zaczyna się we wczesnych etapach życia, zaś ewentualna choroba autoimmunologiczna może ujawnić się po latach. Dodatkowo ryzyko powstania nowotworu jest zwiększone (szczególnie limfomy). Podobnie jak w przypadku ALPS 0 po pewnym czasie może następować samoistna poprawa stanu chorego, zmniejsza się powiększenia węzłów chłonnych i śledziony. Najprawdopodobniej jest to spowodowane wytworzeniem alternatywnego szlaku apoptozy albo na tę poprawę wpływa fakt, że w dzieciństwie występuje wyższa produkcja limfocytów w porównaniu z organizmem osoby dorosłej.

ALPS Ib

ALPS Ib różni się od poprzednich typów tym, że powodem jego powstania jest mutacja genu kodującego FasL. Wyróżniający jest również fakt, że nie wykazuje cech typowych dla autoimmunizacyjnego zespołu limfoproliferacyjnego, za to cechą charakterystyczną tego zespołu jest to, że występuje najczęściej z chorobą autoimmunologiczną - toczniem rumieniowatym. ALPS Ib występuje bardzo rzadko, co można tłumaczyć wielorako. Możliwe, że FasL jest niezbędny w rozwoju a jego mutacja ma najczęściej skutek śmiertelny. Również prawdopodobne jest to, że choroby towarzyszące (np. toczeń) temu zespołowi powodują brak diagnozowania ALPS. Istnieje również możliwość braku objawów przy takiej mutacji, ale to by sugerowało, że istnieje inny, nieznany ligand dla receptora Fas.

ALPS II

Ten typ ALPS spowodowany jest mutacją w genie kodującym kaspazę 8 lub 10. Mutacje kaspazy 8 powodują klasyczne objawy ALPS. Interesująca jest natomiast mutacja kaspazy 10, gdyż w jej obecności obserwuje się akumulacją komórek dendrytycznych w węzłach chłonnych (mechanizm tego objawu nie jest znany). Ze względu na właściwości komórek dendrytycznych - prezentowanie antygenów - objawy autoimmunologiczne przy mutacji kaspazy 10 są wyjątkowo ciężkie dla pacjenta.

ALPS III

U części pacjentów z ALPS nie znaleziono mutacji w genach kodujących Fas, FasL czy też w kaspazie 8 i 10. Możliwe, że w generowanie tego typu ALPS odpowiedzialne jest inne białko szlaku Fas/FasL albo całkiem inny receptor śmierci i związany z nim szlak przekazywania sygnału. Wszystkich takich pacjentów diagnozuje się jako chorych na ALPS III.

JAK TO SIĘ LECZY?

Najskuteczniejszym sposobem wyleczenia pacjenta z ALPS jest przeszczep szpiku kostnego. Jednak zawsze problematyczne jest znalezienie dawcy oraz ryzyko takiej operacji jest znaczne. Stosuje się ją w przypadkach chorych o bardzo ciężkich objawach.

Najczęściej stosuje się terapię lekową, jednak do tej pory nie odnaleziono skutecznego leku, który by w sposób zadowalający niwelował objawy ALPS. Stosowana do tej pory terapia zaleca podawanie chorym leków immunosupresyjnych, kortykosteroidów, IVIG (Intra Venous Immunoglobulin) w przypadku niedoboru leukocytów: G - CSF (granulocyte-colony stimulating factor), również stosuje się częste transfuzje krwi. Każdy z tych leków i terapii ma dość poważne skutki uboczne albo bardzo utrudnia życie codzienne.

Rodzaj leku	Działanie leku	Skutki uboczne i niedogodności leczenia
Leki immunosupresyjne	Ich celem jest pacyfikacja układu immunologicznego, są niezbędne np. po transplantacji i w chorobach autoimmunologicznych. Są to leki o zróżnicowanym działaniu, większość ma działanie długoterminowe i wpływa na funkcjonowanie limfocytów.	Mało specyficzne w działaniu immunosupresyjnym, przez co pacjenci nie są w stanie obronić się przed infekcjami oportunistycznymi.
Kortykosteroidy	Używane by zmniejszyć uciążliwe zapalenia tkanek, zmniejszają opuchnięcie, zaczerwienienie, swędzenie i reakcje alergiczne.	Im dłużej są przyjmowane przez pacjenta, tym większe prawdopodobieństwo wystąpienia skutków ubocznych. Mogą zmniejszyć odporność organizmu na infekcje, a w czasie infekcji mogą utrudnić leczenie. Rzadko występują: problemy z widzeniem, zwiększone pragnienie, częstsze oddawanie moczu oraz problemy natury psychicznej np. depresja, zmiany nastroju, halucynacje.
G - CSF	Czynnik wzrostu, który powoduje wzrost produkcji leukocytów w szpiku kostnym, jest to białko naturalnie produkowane przez organizm, dodatkowo stosuje się go np. po chemioterapii albo w przypadku chronicznych niedoborów leukocytów.	Mało komfortowy dla pacjenta, gdyż podaje się go w zastrzykach podskórnych. Mogą wystąpić: bóle kości, zaczerwieniona, swędząca skóra, gorączka, opuchlizna, która może skutkować w dusznościach oraz problemy z trawieniem.
IVIG	Mieszanina przeciwciał utworzona przez wymieszanie surowicy od ok. 20000 osób, jest to jedna z terapii w chorobach autoimmunologicznych	Podaje się dożylnie lub podskórnie, a jedna transfuzja trwa 5-6 godzin, również jest to terapia droga - pojedyncza dawka dla osoby dorosłej kosztuje 3000 dolarów, a trzeba ją przyjmować co miesiąc. Czasem pacjenci odczuwają ból głowy i objawy podobne do grypy.

Tabela 2. Konwencjonalne leki podawane chorym na ALPS.

Ze względu na niedogodności w czasie takiej terapii prowadzi się badania nad innymi lekami. Początkowo prowadzono badania nad Fansidarem (połączenie pyrimethaminy z sulfadoksyną), lekiem przeciw malarii, który w czasie podawania go dzieciom z ALPS spowodował zmniejszenie węzłów chłonnych oraz śledziony. Jednak z powodu zbyt małej liczby osób z ALPS nie uczulonych na sulfadoksynę badania nie wyszły poza pierwszą i obiecującą fazę kliniczną. Na szczęście po badaniach in vitro okazało się, że to pyrimethamina jest substancją, która powoduje apoptozę limfocytów, dlatego też rozpoczęto pierwszą fazę kliniczną, której wyników, niestety, jeszcze nie opublikowano. Daje to jednak nadzieję na poprawienie komfortu leczenia i zmniejszenie objawów u wszystkich chorych na ALPS.

Prezentacja antygenów limfocytom T

Środowisko, w którym żyjemy zawiera wiele patogenów, przed którymi chroni Nas nasz układ odpornościowy. Limfocyty i fagocyty są komórkami biorącymi udział w tym procesie. Odpowiedz immunologiczną możemy podzielić na dwie fazy. Najpierw dochodzi do rozpoznania antygenu przez limfocyty i ich aktywacji, następnie rozpoczyna się kierowana przez nie odpowiedz immunologiczna eliminująca źródło antygenów. Limfocyty T nie posiadają zdolności rozpoznawania natywnych antygenów. Rozpoznają one krótkie fragmenty peptydowe połączone z białkami głównego układu zgodności tkankowej (MHC). Główny układ zgodności tkankowej, MHC (ang. major histocompatibility complex) jest dużym kompleksem genetycznym kodującym wiele białek. Rozpoznanie antygenu przez limfocyty T skutkuje zazwyczaj zabiciem komórki zainfekowanej patogenem, aktywacji limfocytów B do produkcji przeciwciał, makrofagów do zabijania bakterii żyjących w przestrzeniach międzykomórkowych.

Budowa MHC klasy pierwszej i drugiej:

Cząsteczka MHC klasy I składa się z glikozylowanego łańcucha ciężkiego (45kDa), niekowalencyjnie powiązanego z β₂-mikroglobuliną. (12kDa). Łańcuch ciężki zawiera trzy domeny pozakomórkowe, oznaczane α₁, α₂, α₃, odcinek przez błonowy oraz cytoplazmatyczny. β₂-mikroglobulina jest niezbędna dla ekspresji cząsteczek MHC klasy I. Domeny α₁, α₂ tworzą rowek wiążący. Cząsteczki MHC klasy II są heterodimerami łańcuchów glikoproteinowych ciężkich (α) i lekkich (β). Część pozakomórkowa składa się z dwóch domen (α₁, α₂ lub β₁, β₂) połączonych krótką sekwencją z odcinkiem przezbłonowym i domeną cytoplazmatyczną.

Białka zaangażowane w przetwarzanie i prezentacje antygenu zlokalizowane są w głównym układzie zgodności tkankowej:

Ludzki układ zgodności tkankowej zawiera ponad 200 genów, znajdujących się na szóstym chromosomie. Nazywamy je HLA (ang.Human Leukocyte Antigen). Region klasy pierwszej zawiera trzy loci (HLA-A, -B i -C), każdy z tych loci koduje łańcuch ciężki. Region ten zawiera również geny (HLA-E, -F, -G). Przypuszcza się, że mogą one kodować białka na pozakosmkowym cytotrofoblaście łożyska, gdzie chronią komórki przed atakiem matczynych komórek NK. Geny klasy II umiejscowione są w rejonie HLA-D, kodującym, co najmniej sześć łańcuchów α i dziesięć łańcuchów β. Region ten zawiera także geny biorące udział w prezentacji antygenu, lecz nieulegające ekspresji na powierzchni komórki.

Jak dochodzi do prezentacji antygenu?

Wiele przeprowadzonych badań wykazało, że limfocyty T zależne od klasy I MHC Tc(cytotoksyczne) rozpoznają antygeny syntetyzowane wewnątrz komórki, natomiast limfocyty T zależne od klasy II Th(pomocnicze) rozpoznają antygeny endogenne.

• Mechanizm prezentacji antygenu w kontekście MHC I:

Peptydy prezentowane na cząsteczkach MHC klasy pierwszej pochodzą z białek cytoplazmatycznych rozłożonych w specjalnych organellach zwanych proteasomami. Organelle te odpowiedzialne są w dużym stopniu za aktywność proteolityczną cytozolu. Rozkładają one zdenaturowane bądź znakowane ubikwityną białka na fragment 5-15 aminokwasowe. W obrębie MHC znajdują się dwa geny LPM2 i LPM7, których ekspresja wzrasta po stymulacji IFNγ . Produkty tych genów są składowymi proteosomu. Za proces przeniesienia produktu trawienia z proteaosomu do szorstkiej siateczki śródplazmatycznej (RER) komórki odpowiedzialne są dwa białka należące do rodziny transporterów ABC. Są to białka TAP1 i TAP2. Działają one jako heterodimeryczny transporter przenoszący peptydy do światła RER. W retikulum dochodzi do łączenia z cząsteczkami MHC, jest to proces złożony, kontrolowany chaperony (kalneksyna). W wyniku tego procesu powstaje stabilny kompleks łańcucha ciężkiego i peptydu. Ugrupowania niezawierające peptydu są niestabilne.

• Mechanizm prezentacji antygenu w kontekście MHC II:

W retikulum (RER) łańcuchy klasy II występują w kompleksach z polipeptydem, tzw. łańcuchem niezmiennym (Ii) kodowanym poza MHC. Kompleks ten transportowany jest do kwaśnego przedziału endosomalno-lizosomalnego, gdzie dochodzi do uwalniania Ii. Przedziałem tym jest pęcherzyk MIIC, w którym dochodzi również do przyłączenia peptydu z endosomu do kompleksu w miejscu Ii. Powstanie kompleksu cząsteczka MHC:peptyd ułatwione jest dzięki temu ze cząsteczka MHC zawiera wiele kieszonek, szczelinek, krawędzi wtrętów, wklęsłości. Ich struktura przestrzenna zależy częściowo od aminokwasów w obrębie wiążącego rowka. Wiązanie peptydu zależy od budowy jego łańcuchów bocznych, a także od komplementarności z rowkiem wiążącym w cząsteczce MHC.

Dojrzewanie komórek T rozpoczynana się w obwodowych tkankach limfatycznych dzięki aktywowanym komórkom prezentującym antygen (APC):

Dojrzewanie komórek T rozpoczynana się w obwodowych tkankach limfatycznych dzięki aktywowanym komórkom prezentującym antygen (APC): Do aktywacji limfocytu T poza związaniem odpowiedniego peptydu prezentowanego w kontekście MHC konieczne jest otrzymanie stymulujących sygnałów od APC. Komórkami prezentującymi antygen są komórki dendrytyczne, makrofagi i limfocyty B. Nabyta odpowiedz immunologiczna rozwija się w obwodowych tkankach limfatycznych, a nie jak mogłoby się wydawać w miejscu wniknięcia patogenu. Drenujące naczynia limfatyczne dostarczają patogeny i ich produkty w limfie do najbliższego węzła chłonnego, w którym znajdują się komórki zdolne do wychwytywania antygenu i prezentowaniu go komórkom T.Bardzo ważną funkcje spełniają komórki dendrytyczne chwytające antygen w miejscu infekcji i migrujące zgodnie z prądem limfy. Procesy te ułatwione są dzięki rozwojowi reakcji zapalnej, będącej jednym z mechanizmów wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Reakcja ta powoduje rozszerzenie naczyń, przez co rośnie ilość osocza dostającego się do zainfekowanej tkanki i później do drenujących naczyń limfatycznych. Dochodzi również do aktywacji komórek dendrytycznych do pobierania zarówno cząsteczkowego jak i rozpuszczalnego antygenu w miejscu infekcji.

Komórki prezentujące antygen:

Komórki dendrytyczne (DC):

Jedyną znaną funkcją komórek dendrytycznych jest prezentacja antygenu limfocytom T, są one głównymi komórkami spełniającymi tę funkcje. Komórki te powstają z mieloidalnych komórek progenitorowych w szpiku kostnym. Następnie opuszczają one szpik i wędrują z krwią do tkanek peryferyjnych. Niski poziom MHC na ich powierzchni świadczy o niedojrzałym fenotypie tych komórek. Nie są one zdolne wtedy do aktywacji naiwnych limfocytów T. Komórki dendrytyczne wraz z makrofagami zdolne są do rozpoznawania specyficznych cząsteczek na powierzchni patogenów i ich fagocytozę. Jednak DC są zdolne także do niespecyficznej pinocytozy, podczas, której pobierają ogromną ilość otaczającej je substancji. Typową niedojrzałą komórką dendrytyczną jest komórka skóry Langerhansa. Przeprowadza ona aktywnie fagocytozę, a infekcja powoduje migracje do najbliższego węzła chłonnego, gdzie tracą zdolność do fagocytozy. Na tym etapie syntetyzują one dużą liczbę cząsteczek MHC zawierających peptydy patogenu. Na powierzchni cząsteczki ekspresji ulega także wiele cząsteczek adhezyjnych umożliwiających oddziaływanie z antygenowo specyficznymi limfocytami. Kolejną bardzo ważną cechą komórek dendrytycznych jest wydzielanie chemokin w węzłach chłonnych. Związki te mają zdolność do stymulacji limfocytów T. Sygnały aktywujące komórki dendrytyczne do migracji i dojrzewania po podaniu antygenu determinują czy rozwinie się odpowiedz nabyta układu odpornościowego. Sygnały te mogą być generowane bezpośrednio przez interakcje z patogenem bądź przez działanie cytokinami. W obu przypadkach aktywacja DC jest wynikiem rozpoznania patogenu przez nie specyficzne receptory wrodzonego układu odporności. Dobrym przykładem tego zjawiska jest rozpoznawanie LPS (lipopolisacharydu), głównego składnika ściany komórkowej bakterii gram ujemnych. Receptory rozpoznające LPS występują na komórkach dendrytycznych i makrofagach. Kontaktują się one z receptorami Toll-like TLR-4, mogącymi aktywować ekspresje czynnika transkrypcyjnego NFκB. Czynnik ten powoduje produkcję cytokin takich jak TNFα, stymulujących migracje tkankowych DC. Inne TLR obecne na powierzchni DC są odpowiedzialne za rozpoznawanie i sygnalizację innych klas patogenów. Patogeny, którym udało się uniknąć rozpoznania przez receptory, pobierane są na drodze pinocytozy i później mogą być prezentowane limfocytom T. Aktywacja komórek dendrytycznych polega w tym przypadku na rozpoznaniu DNA patogenu, który zawiera niemetylowane motywy dwunukleotydowe CpG. Podobnie jak wcześniej dochodzi do aktywacji czynnika NFκB i kinazy MAP (mitogen-activated protein kinase). Prowadzi to do produkcji cytokin takich jak IL-6, IL-12, IL-18, interferonu (IFN)-α i IFN-γ.

Makrofagi:

Makrofagi podobnie jak komórki dendrytyczne mają zdolność do fagocytozy antygenów i prezentowania ich w kontekście MHC, wykorzystując podobne mechanizmy. Dodatkowo ciągle pożerają one umierające komórki będące bogatym źródłem własnych antygenów. Bardzo ważne jest, aby nie aktywowały one limfocytów T przy braku infekcji. Komórki wątroby Kupffera a także makrofagi znajdujące się w czerwonej miazdze śledziony usuwają ogromną liczbę umierających komórek z krwi.

Limfocyty B:

Limfocyty B są wyspecjalizowanymi komórkami zdolnymi do wiązania specyficznych rozpuszczalnych cząsteczek przez ich powierzchniowe receptory immunoglobulinowe BCR (B cell antigen receptor). Komórki te iternalizują antygen z receptorem immunoglobulinowym i prezentują pobrane peptydy w kontekście MHC klasy II. Proces ten jest bardzo wydajny, co powoduje ekspresje wysokiego poziomu cząsteczek MHC II na powierzchni cząsteczki. Ten szlak prezentacji antygenu pozwala limfocytom B aktywować antygenowo specyficzne limfocyty T(CD4). Limfocyty te zwane pomocniczymi limfocytami T, stymulują limfocyty B do proliferacji prowadzącej do tworzenia przeciwciał. Istnieją jednak antygeny zdolne do aktywacji komórek B podczas nieobecności limfocytów T pomocniczych.

APC	LOKALIZACJA
Komórki dendrytyczne (DC)	Głównie w miejscach występowania limfocytów T. W momencie znalezienia się DC w węźle komórki te tracą możliwość wiązania nowego antygenu.
Makrofagi	Znajdowane są w wielu przestrzeniach węzłów chłonnych szczególnie w zatoce brzeżnej, gdzie doprowadzające naczynie limfatyczne wchodzi do tkanki limfatycznej. Dochodzi tam do gromadzenia limfy przed dostaniem się do krwi. Mogą one w tym miejscu „połykać” mikroby, a szczególnie antygeny, zapobiegając tym samym dostaniu się ich do krwi.
Limfocyty B	Krążą one przez tkanki limfatyczne i lokalizują się w grudkach chłonnych, są szczególnie wydane w pobieraniu rozpuszczalnych antygenów takich jak bakteryjne toksyny przez specyficzne receptory immunoglobulinowe zlokalizowanych na powierzchni ich błony komórkowej

Tabela 2. Miejsce występowania APC w węźle chłonnym

Rozpoznanie antygenu przez naiwne limfocyty T:

Naiwne limfocyty wchodzą do tkanki limfoidalnej przez ściany wyspecjalizowanych naczyń zwanych żyłkami z wysokim śródbłonkiem (ang. high endothelial venules -HEV). Krążą one ciągle z krwiobiegu tkanek limfatycznych i z powrotem do krwi, kontaktując się z wieloma tysiącami APC każdego dnia. Powoduje to, że limfocyty te mogą sprawdzać różne cząsteczki prezentowane na wielu APC. Jest to ważne z dwóch powodów: Po pierwsze poprawia to proces pozytywnej selekcji w kontekście MHC. Proces ten występuje podczas rozwoju limfocytów T, dochodzi w nim do sprawdzania receptorów komórek T (TCR) pod kątem zdolności do oddziaływania z tym kompleksem. Ostatnie badania sugerują, że limfocyty T są też sprawdzane pod kątem oddziaływania z kompleksami MHC połączonymi z własnymi peptydami. W ten sposób powstaje repertuar dojrzałych komórek T, które mogą być aktywowane przez obce antygeny związane do MHC. Aby doszło do migracji naiwnych limfocytów T przez naczynia limfatyczne i ich początkowej interakcji z komórkami prezentującymi antygen musi dojść od ich nie specyficznych antygenowo oddziaływań. Jest to bardzo ważny proces konieczny do powstania skutecznej obrony immunologicznej. Oddziaływania te sterowane są przez rozmieszczone na powierzchni limfocytu cząsteczki adhezyjne, które rozpoznają komplementarne cząsteczki rozmieszczenie na powierzchni drugiej komórki. Głównymi klasami cząsteczek adhezyjnych zaangażowanych w interakcje limfocytów z innymi komórkami są selektyny i integryny, należące do narodziny immunoglobulin. Podczas migracji limfocytu T przez węzeł chłonny dochodzi to licznych bardzo krótkich wiązań z komórkami prezentującymi antygen.

Fascynujące zjawisko prezentacji antygenu limfocytom T jest niezbędny w rozwoju właściwej odpowiedzi immunologicznej Dzięki niemu możemy walczyć z szeregiem różnych patogenów obecnych w naszym środowisku. W tym wieloetapowym procesie dochodzi jednak czasami do zaburzeń powodujących niebezpieczne choroby np. wspomnienie wcześniej zaburzenia w funkcji komórek Kupffera. Coraz więcej prowadzonych badań sugeruje, że w rozwój wielu chorób odpowiedzialny może być ten proces. Prawdopodobnie w najbliższych latach jeszcze nieraz będzie głośno o tym procesie.

Cel! Pal! Wykorzystanie przeciwciał monoklonalnych i ich pochodnych w walce z nowotworami

Przeciwciała syntetyzowane in vivo cechują się ogromną heterogennością, są to przeciwciała należące do różnych klas, wykazują odmienne powinowactwo do antygenu, nazywane są więc poliklonalnymi. Ta odmienność jest wynikiem równoczesnego pobudzenia w obecności antygenu pewnego procentu limfocytów B, które zaczynają się dzielić, przy czym każdy z aktywowanych limfocytów tworzy osobny klon, produkujący określone przeciwciało. Jedynie immunoglobuliny wytwarzane przez klony nowotworowe u ludzi i myszy są pod każdym względem homogenne. Ponadto, klon nowotworowy oprócz wytwarzania identycznych immunoglobulin czyli monoklonalnych jest nieśmiertelny i można go w nieskończoność pasażować (czyli przenosić do kolejnych naczyń hodowlanych). Techniki wytwarzania przeciwciał monoklonalnych zrewolucjonizowały wiele dziedzin nauki. Są one wykorzystywane między innymi do wykrywania i określania stężenia leków, hormonów, enzymów (nawet jeśli występują w bardzo niewielkich ilościach), diagnostyce chorób zakaźnych, diagnostyce nowotworów a także w nowoczesnych metodach terapii antynowotworowych.

Sposoby produkcji przeciwciał monoklonalnych

Klasycznym sposobem otrzymywania przeciwciał monoklonalnych jest zastosowanie fuzji komórki nowotworowej szpiczaka (nowotworu wywodzącego się z szeregu rozwojowego limfocytów B ) z limfocytem B pochodzenia śledzionowego myszy, po wcześniejszej jej immunizacji stosownym antygenem. Fuzji dokonuje się w obecności glikolu etylenowego, a następnie poddaje selekcji w pożywce. Zwykle stosuje się komórki szpiczaka niezdolne do wzrostu w nieobecności określonego czynnika w pożywce, który to czynnik może zostać dostarczony komórce nowotworowej przez limfocyt B po zajściu fuzji. Pożywka selekcyjna jest więc tak dobrana, aby nie zawierała potrzebnego komórkom szpiczaka czynnika. Dzięki temu można wyselekcjonować z jej pomocą hybrydy, gdyż komórki szpiczaka nie będą zdolne do wzrostu w takich warunkach, podobnie jak limfocyty B, które utrzymywane są przy życiu przez cytokiny, których również nie zawiera się w pożywce. Ostatecznie dokonuje się selekcji tych hybryd, które produkują interesujące nas przeciwciało, swoiste w stosunku do danego antygenu. Tak uzyskane hybrydy wykazują cechę nieśmiertelności i produkcji ściśle swoistego przeciwciała. Są więc, ujmując to bardziej obrazowo, fabrykami służącymi produkcji przeciwciał o określonej swoistości.

Wykorzystanie przeciwciał uzyskiwanych powyższym sposobem w celach leczniczych wiąże się z dużymi ograniczeniami. Mianowicie, uzyskiwane są w ten sposób przeciwciała mysie mają zdolność indukcji odpowiedzi immunologicznej u człowieka, przez co wykazują małą skuteczność (ulegają zniszczeniu przez układ immunologiczny pacjenta) oraz mogą wywoływać stan szoku anafilaktycznego, który może prowadzić do śmierci. Utworzenie analogicznych hybryd ludzkich napotyka znaczące trudności: hybrydy takie wykazują niewielką stabilność, uzyskiwanie odpowiednich limfocytów B może być trudne, gdyż ze względów etycznych człowieka nie uczula się w celu pozyskiwania limfocytów oraz brak jest odpowiednich ludzkich linii szpiczakowych. Dlatego też obecnie uzyskuje się przeciwciała monoklonalne do celów terapeutycznych na drodze inżynierii genetycznej. Tworzy się konstrukty genowe, w których części zmienne łańcuchów, odpowiadające za wiązanie antygenu, pochodzą od myszy, natomiast części stałe, stanowiące większość cząsteczki, mają pochodzenie ludzkie. Takie geny można wprowadzać do linii komórek ssaków, a nawet komórek bakterii E.coli, które produkują wówczas tak zwane przeciwciała chimeryczne. Możliwa jest jeszcze większa redukcja regionu mysiego. Możliwa jest bowiem synteza przeciwciał humanizowanych, w których tylko niewielkie regiony w obrębie łańcuchów zmiennych tak zwane regiony hiperzmienne mają mysie pochodzenie, natomiast pozostała część cząsteczki jest pochodzenia ludzkiego. Ponadto, możliwe jest również wykorzystanie roślin i zwierząt transgenicznych, produkujących przeciwciała monoklonalne o określonej swoistości.

Przeciwciała monoklonalne w walce z nowotworami

Przeciwciała monoklonalne stanowią doskonały punkt wyjściowy do projektowania leków antynowotworowych. Ze względu na rosnącą ilość prób klinicznych, wykorzystujących przeciwciała monoklonalne w terapii, ustalono międzynarodowe nazewnictwo leków opartych na tych immunoglobulinach. Wszystkie tego typu farmaceutyki mają nazwę z końcówką mab. Leki bazujące na przeciwciałach mysich kończą się na omab (np. edrecolomab), dla przeciwciał chimerycznych obowiązuje końcówka ximab (np. infliximab), dla przeciwciał humanizowanych zarezerwowana jest końcówka zumab (np. bewacyzumab), natomiast w przypadku przeciwciał w całości ludzkich wykorzystywana jest końcówka umab (np. adalimumab).

„Nagie” przeciwciała monoklonalne

Wykorzystanie samych, nie skoniugowanych z innymi cząsteczkami przeciwciał monoklonalnych w terapii antynowotworowej może opierać się na dwóch podejściach. Po pierwsze, mogą one specyficznie rozpoznawać pewne charakterystyczne dla komórek nowotworowych antygeny na ich powierzchni, opłaszczać takie komórki i stanowić swoisty znacznik, nakierowujący na tak oznaczony cel różnorodne mechanizmy odpowiedzi immunologicznej. W efekcie dochodzi do bardziej efektywnego rozpoznania komórki nowotworowej. Komórki po transformacji nowotworowej wykształcają bowiem zwykle specyficzne mechanizmy utrudniające ich rozpoznawanie i niszczenie przez układ odpornościowy. Podanie przeciwciał monoklonalnych zwiększa znacząco prawdopodobieństwo ich namierzenia, co stanowi pierwszy punkt prowadzący do ich zniszczenia. Przykładami leków należących do grupy nagich przeciwciał monoklonalnych, działających zgodnie z tym mechanizmem należą:

• Rituximab (Rituxan): jest to lek wykorzystany do leczenia m.in. chłoniaka złosliwego i oparty na rozpoznaniu cząsteczki CD20 obecnej na limfocytach B, z których wywodzi się ten nowotwór (cząsteczki CD20 są nieobecne na komórkach macierzystych szpiku i komórkach progenitorowych, więc zastosowanie przeciwciał skierowanych na CD20 nie wpływa znacząco na proces hematopoezy)

• Alemtuzumab (Campath): farmaceutyk rozpoznający cząsteczkę CD52 obecną na limfocytach T i B i wykorzystywany w terapii przewlekłej białaczki limfocytowej B.

Drugim podejściem jest wykorzystanie przeciwciał monoklonalnych, łączących się z takimi cząsteczkami na powierzchni komórek nowotworowych, które są istotne dla ich funkcjonowania. Związanie przeciwciała do tychże cząsteczek blokuje ich aktywność i tym samym zaburza funkcje komórki nowotworowej. Przykładami leków z tej kategorii są:

• Trastuzumab (Herceptin): lek ten stanowi przeciwciało skierowane przeciwko białku HER2/neu, które obecnie jest w dużych ilościach między innymi na powierzchni komórek raka piersi. Białko to jest konieczne do wzrostu tych komórek i poprzez jego blokowanie możliwe jest leczenie nowotworu piersi

• Cetuximab (Erbitux): jest to przeciwciało łączące się z białkiem EGFR, występującym obficie na powierzchni różnych komórek nowotworowych i jest konieczne dla ich wzrostu i podziałów. Lek ten wykorzystuje się w terapii nowotworów przewodu pokarmowego, głowy i szyi

• Bevacizumab (Avastin): lek ten skierowany jest przeciwko śródłonkowemu czynnikowi wzrostu VEGF. Czynnik ten konieczny jest w procesie angiogenezy (tworzenia nowych naczyń krwionośnych), dzięki któremu guz może ulec unaczynieniu i efektywnie się rozwijać. Poprzez blokowanie VEGF odcina się guz od dopływu substancji odżywczych z krwi, co hamuje jego rozwój. Do tej pory farmaceutyk ten znalazł zastosowanie w leczeniu nowotworów przewodu pokarmowego, płuc, piersi, ale ciągle trwają próby wykorzystania tego leku w leczeniu innych nowotworów.

Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych we wspomniany wyżej sposób wiąże się z możliwością wystąpienia skutków ubocznych. Jednym z najpoważniejszych powikłań jest ich interakcja z prawidłowymi komórkami i blokowanie fizjologicznych procesów. Przykładowo, mogą one wpływać na komórki szpiku, zmniejszając liczbę komórek krwi, przez co pacjenci stają się bardziej podatni na krwotoki i infekcje.

Immunotoksyny

Immunotoksyny są, jak sama nazwa wskazuje, kompleksami przeciwciał z toksynami, połączonymi chemicznie. Możliwe jest wykorzystanie toksyn roślinnych: rycyna (z rącznika), abryna (z modligroszku właściwego), bakteryjnych: defterotoksyna (toksyna błonicy), egzotoksyna A Pseudomonas oraz grzybowych: α - amanityna (z muchomora sromotnikowego), α - sarcyna (z gatunku kropidlaka Aspergillus giganteus). Spośród wymienionych przykładów rycyna i dyfterotoksyna wykazują największą skuteczność w zabijaniu komórek: już pojedyncza cząsteczka toksyny ma zdolność uśmiercenia komórki. Idea wykorzystania immunotoksyn w walce z nowotworami jest prosta: przeciwciało skierowane przeciw strukturom na powierzchni komórki nowotworowej ma za zadanie doprowadzić do komórki rakowej toksynę, która ma tę komórkę zniszczyć. Spodziewano się osiągnięcia spektakularnych wyników za sprawą takich koniugatów, określano je nawet mianem magicznej kuli. Jednakże, jak okazało się w praktyce, immunotoksyny wykazują dość znaczną niepożądaną toksyczność w stosunku do komórek prawidłowych, np. komórek wątroby przez którą takie kompleksy są wychwytywane. Ponadto, dużą wadą jest silna immunogoenność komponenty toksynowej i wytwarzanie przeciw niej immunoglobulin w ustroju. Obecnie w powszechnym użyciu w terapii antynowotworowej jest tylko jedna immunotoksyna, znana pod nazwą gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg). Lek ten zawiera toksynę promieniowców kalicheamycynę oraz przeciwciało skierowane przeciwko antygenowi CD33, który obecny jest na wielu komórkach białaczkowych i wykorzystywany jest w leczeniu ostrej białaczki szpikowej.

Koniugaty przeciwciał monoklonalnych z radioizotopami

Możliwe jest połączenia przeciwciał monoklonalnych z izotopami emitującymi promieniowanie, za pomocą którego komórki nowotworowe są efektywnie niszczone. Tego typu koniugaty wykazują podwójne działanie. Po pierwsze dochodzi do blokowania ważnych cząsteczek na powierzchni komórki nowotworowej za sprawą przeciwciała, co zaburza wzrost i podziały. Po drugie, emitowane przez radioizotop promieniowanie prowadzi do zniszczenia komórki. Ponadto, ze względu na fakt, iż promieniowanie wykazuje określony zasięg, możliwe jest niszczenie komórek niezwiązanych bezpośrednio z przeciwciałem, na przykład komórek nowotworowych we wnętrzu zwartego guza. Takiego działania same przeciwciała nie wykazują, przez co komórki warstw głębszych zwykle są oporne na terapię nagimi przeciwciałami. Obecnie w terapii wykorzystuje się farmaceutyki oparte na przeciwciałach monoklonalnych skierowanych przeciwko cząsteczce CD20 skoniugowane z Y-90 (ibritumomab tiuxetan) i I-131 (tositumomab). W pierwszym przypadku emitowane jest promieniowanie β, o zasięgu 1 - 5 nm, natomiast w drugim przypadku dochodzi do emisji promieniowania γ, które penetruje tkanki już na znacznej głębokości, wykazuje duży zasięg, co ogranicza jego stosowalność, ze względu na efekty uboczne w postaci niszczenia zdrowych tkanek. Te koniugaty przeciwciał monoklonalnych znalazły zastosowanie w terapii chłoniaka złośliwego, podobnie jak wcześniej wspomniany rituximab.

Przeciwciała monoklonalne o podwójnej swoistości

Są to przeciwciała uzyskiwane często na drodze chemicznego sprzęgania dwóch różnych przeciwciał, przez co uzyskuje się cząsteczkę zawierającą cztery miejsca wiążące antygen (cztery fragmenty Fab), a każda z par fragmentów Fab wiąże inną cząstkę. Tego typu przeciwciała można także uzyskać na drodze fuzji dwóch hybryd, produkujących przeciwciała o różnej swoistości. W efekcie takiej fuzji tworzy się tzw. kwadromy, z których niewielki odsetek syntetyzuje przeciwciała o podwójnej swoistości. Celem zastosowania takich przeciwciał jest bardziej efektywna stymulacja układu odpornościowego gospodarza do niszczenia komórek nowotworowych. Mianowicie, można podawać pacjentom przeciwciała łączące się ze specyficznymi cząsteczkami na powierzchni komórek rakowych i równocześnie z cząsteczkami na powierzchni komórek układu odpornościowego, przez co następuje ściąganie tych komórek w obszar występowania nowotworu oraz ich aktywacja. Przykładowo, można podawać dwa różne przeciwciała o podwójnej swoistości takie, iż oba rozpoznają antygeny nowotworowe, jedno z nich łączy się dodatkowo z cząsteczką CD3 obecną na limfocytach T, a drugie z cząsteczką CD28, również charakterystyczną dla limfocytów T. Obie te cząsteczki, CD3 i CD28 są bardzo istotne w procesie aktywacji limfocytów T. Cząsteczka CD3 umożliwia rozpoznawanie antygenów przez receptory TCR, natomiast cząsteczka CD28 dostarcza tak zwanego drugiego sygnału, niezbędnego do pełnej aktywacji. W wyniku pełnej aktywacji limfocytów T dochodzi do silniejszej mobilizacji układu odpornościowego poprzez aktywację limfocytów B przy udziale pomocniczych limfocytów T, produkcję cytokin i przyciąganie w pobliże guza innych komórek układu immunologicznego. Podobnie można aktywować za sprawą przeciwciał o podwójnej swoistości także inne komórki jak makrofagi, neutrofile, komórki NK. Aby zwiększyć wydajność terapii z wykorzystaniem przeciwciał o podwójnej swoistości często wraz z przeciwciałami podaje się komórki efektorowe aktywowane przez to przeciwciało.

Koniugaty przeciwciał monoklonalnych z lekami

Takie koniugaty mają na celu dostarczenie leku przeciwnowotworowego bezpośrednio w miejsce występowania guza. Wykorzystuje się tu swoistość przeciwciał skierowanych przeciw antygenom komórek rakowych i można je traktować jako wyjątkowo swoiste nośniki dla leku. Zaletą takich koniugatów jest ich ograniczona immunogenność, dzięki czemu bardziej wydajnie docierają do miejsca przeznaczenia. Dużym problemem w tym przypadku jest jednak konieczność związania leku z przeciwciałem w taki sposób, aby ten pierwszy ulegał depozycji po dotarciu do guza, nie natomiast w krążeniu, co powodowałoby destrukcję tkanek prawidłowych. Stosowane leki przeciwnowotworowe, takie jak doksorubicyna, wykazują bowiem toksyczny efekt w stosunku do wszystkich komórek. Przykładem koniugatu przeciwciało - lek, który znalazł zastosowanie w terapii białaczki szpikowej jest farmaceutyk gemtuzumab ozogamycyna, w który to kompleksie wykorzystano przeciwciała rozpoznające cząsteczki CD33. Dodatkowo, możliwe jest też sprzęganie przeciwciał z nieaktywnym prolekiem oraz enzymem, mającym zdolność aktywowania tego proleku. Dzięki temu znacząco obniża się toksyczność takiego leku, gdyż w postaci aktywnej gromadzi się on w zasadzie tylko w obrębie komórek nowotworowych.

Koniugaty przeciwciał monoklonalnych z cytokinami

Takie koniugaty, zwane immunocytokinami, wywierają podwójne działanie antynowotworowe. Po pierwsze, immunoglobulina łączy się cząsteczkami na powierzchni komórek nowotworowych i stymuluje niszczenie takich komórek na drodze aktywacji układu dopełniacza lub cytotoksyczności zależnej od przeciwciał. W niektórych przypadkach związanie przeciwciała inaktywuje dodatkowo istotne dla komórki nowotworowej białka powierzchniowe, przez co uniemożliwia jej wzrost i dalszą proliferację. Przyłączona do przeciwciała cytokina, ma natomiast stymulować komórki układu immunologicznego do rozpoznawania i efektywnego niszczenia stransformowanych komórek. Dotychczas podjęto próby leczenia czerniaka z wykorzystaniem koniugatu przeciwciała skierowanego przeciwko gangliozydowi GD2 z interleukiną 2 oraz w przypadku raka okrężnicy, jajnika, płuc, gruczołu krokowego wykorzystano przeciwciała rozpoznające antygen Ep - CAM (epitelialną cząsteczkę adhezyjną ulegającą zwiększonej ekspresji w niektórych komórkach rakowych) i również interleukinę 2.

Pochodne przeciwciał o zmniejszonej masie cząsteczkowej

„Tradycyjne” przeciwciała monoklonalne cechują się wysoką masą cząsteczkową. Dlatego też, z bardzo niewielką wydajnością mogą penetrować wnętrze tkanek i podobnie bardzo mało efektywnie działają na komórki we wnętrzu nowotworowych guzów. Stąd też, coraz większe nadzieje na skuteczniejszą walkę z chorobami nowotworowymi dają pochodne przeciwciał monoklonalnych o zmniejszonej masie cząsteczkowej. Jednym z przykładów takich cząsteczek są jednołańcuchowe białka wiążące antygen, znane także pod nazwą scFV . Są to uzyskiwane na drodze inżynierii genetycznej cząsteczki, obejmujące część zmienną łańcucha ciężkiego VH i część zmienną łańcucha lekkiego Vl, połączone krótkim łańcuchem peptydowym. Bardziej rozbudowane są miniciała, które składają się niejako z dwóch cząsteczek scFv, z których każda przyłączona jest do domeny CH3 łańcucha ciężkiego. Mogą być one uznane za zminiaturyzowane przeciwciała monoklonalne. Możliwe jest ponadto tworzenie diciał, zbudowanych jedynie z dwóch fragmentów scFv, a nawet trójciał czy czwórciał, zawierających odpowiedni trzy i cztery fragmenty scFv w każdej cząsteczce. W przypadku miniciał, diciał, trójciał czy czwórciał możliwe jest łączenie ze sobą fragmentów scFV o różnych swoistościach, rozpoznających różne antygeny i wykorzystanie ich w terapii nowotworów do jednoczesnego rozpoznawania antygenów komórek rakowych i aktywowania komórek układu odpornościowego. Ponadto, pochodne przeciwciał monoklonalnych o zmniejszonej masie łatwiej penetrują wnętrze guzów, wykazują większa zdolność do akumulacji oraz cechują się krótszym czasem krążenia we krwi. Podobnie jak w przypadku przeciwciał monoklonalnych i te cząsteczki można łączyć z toksynami, radioizotopami, lekami generując efektywnie zwalczające komórki nowotworowe koniugaty.

Wykorzystanie przeciwciał monoklonalnych w terapii nowotworów jest z pewnością doskonałą alternatywą w stosunku do klasycznych metod walki z tą chorobą, które są wyjątkowo obciążające dla organizmu i powodują liczne skutki uboczne. Przeciwciała monoklonalne i ich różnorodne koniugaty mogą w sposób stosunkowo swoisty rozpoznawać komórki nowotworowe i prowadzić, w idealnej wersji, do ich zniszczenia na drodze: depozycji szkodliwych czynników takich jak leki przeciwnowotworowe, toksyny, promieniowanie tylko w miejscu występowania guza, mobilizacji układu odpornościowego i przyciągnięcia wyspecjalizowanych komórek w pobliże nowotworu oraz inaktywacji istotnych dla wzrostu i podziałów komórek rakowych czynników białkowych. Dzięki temu, iż istnieje bardzo wiele różnorodnych i pomysłowych rozwiązań opartych na przeciwciałach monoklonalnych możliwe jest dobieranie terapii stosownie do typu i stadium rozwojowego nowotworu. Konieczne jest jednak dalsze rozwijanie tej idei w celu ulepszania terapii, zmniejszania skutków ubocznych i zwiększania efektywności leczenia. Dlatego też, niezbędne jest prowadzenie dalszych badań i wprowadzanie kolejnych pomysłów aby móc upowszechnić terapie oparte na przeciwciałach monoklonalnych i sprawić, iż będą one powszechnie wykorzystane w walce z nowotworami.

Rola śródbłonka naczyniowego i chemokin w specyficzności procesu tworzenia przerzutów przez komórki nowotworowe

Mechanizmy prowadzące do tworzenia przerzutów zostały dotąd poznane na poziomie komórkowym [Timár et al. 2001]. Obejmują one sekwencyjne zdarzenia, z których każde wymaga złożonych interakcji komórka - gospodarz [Orr et al.2000, Hsu et al. 2002, Cheng i Weiner 2003] (rys.1). Zdolność przemieszczania się komórki nowotworowej od miejsca wzrostu guza pierwotnego do organu stanowiącego miejsce przerzutu zależy od wielu właściwości nabytych przez komórki rakowe. W celu dokonania lokalnej inwazji komórki nowotworu złośliwego muszą aktywnie migrować oraz przeniknąć błonę podstawną, co jest ułatwione przez produkcję enzymów proteolitycznych, m.in. metaloproteinaz. Kolejnym etapem jest przejście komórek nowotworowych do naczyń krwionośnych i limfatycznych, tzw. intrawazacja. W krwioobiegu komórki, które przeżyły stres związany z obecnością ciśnienia hemodynamicznego i atak ze strony układu immunologicznego, przechodzą następujące fazy:

• zatrzymanie w naczyniach krwionośnych (na zasadzie ograniczeń anatomicznych lub specyficznych reakcji ze śródbłonkiem naczyniowym - to dwie teorie panujące obecnie w nauce, o tej drugiej będzie mowa w artykule);

• ekstrawazacja - przyczepienie do śródbłonka naczyń krwionośnych, a następnie migracja na zewnątrz naczynia;

• wędrówka do miejsca wzrostu guza wtórnego;

• inicjacja proliferacji i utworzenie mikrometastaz;

• rozwój sieci naczyń krwionośnych poprzez produkcję czynników angiogennych;

• wytworzenie guzów wtórnych [MacDonald et al. 2002].

Specyficzność powstawania przerzutów

Na podstawie wyników wieloletnich analiz klinicznych oraz eksperymentalnych doświadczeń z wykorzystaniem modeli zwierzęcych stwierdzono, że pewne nowotwory dają przerzuty do określonych organów niezależnie od układu naczyń krwionośnych, szybkości przepływu krwi lub liczby rozprzestrzenionych komórek. Rezultaty badań, w których znakowane izotopowo komórki nowotworowe podawano do układu krwionośnego szczurów wskazują, że komórki nowotworowe dostają się do mikrokrążenia wielu organów, jednakże ich proliferacja ograniczona jest tylko do niektórych tkanek i organów docelowych [Fidler 1990], co wskazuje na znaczną selektywność omawianego procesu. Początki poszukiwań mechanizmów regulujących specyficzność tworzenia metastaz związane są z końcem XIX wieku, kiedy to w roku 1889 Stephen Paget dokonał analizy próbek z autopsji 735 kobiet cierpiących na raka piersi [Paget 1889, Timár et al. 2001, Cheng i Weiner 2003, Arya et al. 2003]. Stwierdził on, że przerzuty nie pojawiają się przypadkowo, ale są zlokalizowane preferencyjnie w określonych miejscach. Na tej podstawie wysunięto wniosek, że rozmieszczenie komórek nowotworowych (ang. seed; „ziarna”) regulowane jest przez predyspozycje środowiskowe (ang. soil; „gleba”). Miejsca przerzutów determinują zatem jednocześnie komórki nowotworowe oraz właściwości organu-gospodarza. Niestety, mimo upływu ponad stu lat nadal nie do końca poznane są molekularne mechanizmy selektywności tworzenia przerzutów [Timár et al.2 001]. Pewne przesłanki wskazują jednakże na znaczącą rolę w procesie tworzenia guzów wtórnych czynników adhezyjnych oraz specyficznego zatrzymania komórek nowotworowych w układzie krwionośnym [Nip et al. 1992, Chambers et al. 1999, Pabst et al. 2001, Castells et al 2002]. Obserwacje te potwierdzają jedną z teorii wyjaśniających specyficzność przerzutowania, według której czynnikami decydującymi o inwazji nowotworowej do danego organu są cząsteczki adhezyjne i molekuły sygnalizacyjne, takie jak chemokiny. Zgodnie z tymi założeniami, krytycznym momentem na drodze powstawania przerzutów może być etap zatrzymania komórek nowotworowych w układzie krwionośnym. Proces ten pod wieloma względami przypomina stosunkowo dobrze poznane mechanizmy związane z krążeniem leukocytów w organizmie [Müller et al. 2001, Yan et al. 2004, Lamerant et al., in process].

Rola specjalizacji endotelium w procesie migracji leukocytów

Charakterystyka i funkcje endotelium

Endotelium (śródbłonek naczyniowy) (rys. 2) stanowi błonę zbudowaną z komórek wyściełających najbardziej wewnętrzną część naczyń krwionośnych. Liczba komórek endotelialnych u dorosłego człowieka waha się w granicach 1-6 x10¹³ i stanowi warstwę o powierzchni 1-7 m² [Ribatti et al. 2002]. Tworzą one ścisłe warstwy w organach takich jak mózg lub płuca, gdzie pełnią rolę bariery funkcjonalnej i anatomicznej [Johnson-Léger et al. 2000]. Z drugiej strony mogą budować nieciągłe struktury z przerwami międzykomórkowymi lub fenestracjami w organach takich jak nerki lub szpik kostny, którędy następuje ciągły przepływ płynów ustrojowych. Wtórne organy limfoidalne: węzły chłonne, śledziona i kępki Peyera, posiadają wysoki nabłonek endotelialny HEV (ang. High Endothelial Venules), przez który następuje migracja leukocytów do ich wnętrza [Anderson i Anderson 1976, Duś et al. 2004].

Funkcja endotelium polega na kontroli procesu migracji leukocytów do tkanek limfoidalnych i nielimfoidalnych [Girard i Springer 1995]. Właściwość ta stała się powodem powstania koncepcji specyficzności organowej śródbłonka [Butcher i Picker 1996]. Komórki endotelium rozpoznają i same są rozpoznawane przez cyrkulujące komórki, co pozwala na ekstrawazację tych ostatnich jedynie w określonych tkankach [Kieda 2003]. Śródbłonek naczyniowy stanowi istotny przedmiot badań służących identyfikacji molekuł odpowiedzialnych za specyficzne kierowanie komórek do określonych organów [Kieda i Duś 2003]. Najbardziej aktualne doniesienia podkreślają jego ważną rolę w definiowaniu specyficzności migracji limfocytów oraz mechanizmie specjalizacji immunologicznej [Girard i Springer 1995, Ribatti et al. 2002, Kunkel i Butcher 2002, Kieda 2003]. Strukturalna i funkcjonalna heterogenność komórek śródbłonka od dawna poddawana jest intensywnym badaniom [Pals et al. 1989, Ribatti et al. 2002]. Komórki endotelium pochodzące z różnych tkanek różnią się budową powierzchni komórkowej i ekspresją białek. Jednakże najlepszym przykładem ich specjalizacji jest ekspresja receptorów biorących udział w adhezji i migracji limfocytów.

Proces migracji leukocytów

Mniej więcej czterdzieści lat temu James and Gowans donieśli, że cyrkulujące leukocyty przechodzą do wtórnych tkanek limfoidalnych i stopniowo powracają do krwioobiegu poprzez węzły chłonne [Gowans i Knight 1964]. Na tej podstawie stworzono koncepcję specjalizacji procesu zasiedlania tkanek przez leukocyty oraz organowo-specyficznej recyrkulacji leukocytów. Nieco ponad dziesięć lat później praca Stampera i Woodruffa [1977] dowiodła, że leukocyty są selekcjonowane na poziomie wysokiego śródbłonka węzłów chłonnych przed osiągnięciem organów limfatycznych [Kieda 1998]. Wędrówka leukocytów do tkanek limfoidalnych i nielimfoidalnych została ostatecznie opisana jako seria interakcji adhezyjnych i sygnałów aktywujących [Butcher 1991, Johnson-Léger 2000, Middleton et al. 2001]. Obejmuje ona szereg etapów, w których ekspozycja toczących się leukocytów na czynniki obecne w miejscu adhezji aktywuje je i umocowuje do powierzchni śródbłonka [Campbell i Butcher 2000, Kunkel i Butcher 2002] (rys.3).

W początkowej fazie niesione z prądem krwi leukocyty ulegają marginacji i związaniu do endotelium, co określa się mianem toczenia. Skutkiem tego dochodzi do spowolnienia przemieszczania się komórek. Na tym etapie pośrednikami są zwykle selektyny (ang. selectins) - rodzina cząsteczek adhezyjnych wiążących grupy cukrowe. Minimalna prędkość toczących się leukocytów sprzyja ich oddziaływaniu z niewielkimi białkami zwanymi chemokinami, prezentowanymi na powierzchni apikalnej śródbłonka przez glikozaminoglikany. Chemokiny wiążą się do odpowiednich receptorów na powierzchni leukocytów, prowadząc do zmiany powinowactwa integryny β2 do jej ligandów - cząsteczek immunoglobulino-podobnych na komórkach śródbłonka. Interakcje między tymi cząsteczkami indukują trwałą adhezję leukocytów i ułatwiają ich migrację śródendotelialną. Zaadherowane leukocyty stopniowo wędrują poprzez endotelium kierowane gradientem wewnątrztkankowych chemokin. Tylko mniej niż 1% leukocytów ulega adhezji z pominięciem etapu toczenia się [Johnson i Butcher 2002]. Konieczność zaistnienia wszystkich etapów do skutecznej ekstrawazacji została udokumentowana in vivo, z zastosowaniem neutrofili oraz aktywowanych komórek endotelium hodowanych in vitro lub oczyszczonych cząsteczek adhezyjnych śródbłonka [Smith et al. 1991]. Regulacja procesu zasiedlania tkanek przez leukocyty odbywa się poprzez kontrolę ekspresji molekuł adhezyjnych i receptorów dla chemokin na tych komórkach, równolegle z przestrzenną i czasową kontrolą ekspresji ligandów dla tych receptorów na komórkach różnorodnych tkanek [Berg et al. 1989, Lawrence i Springer 1991, Kunkel i Butcher 2002, Kieda 2003]. Specyfika „homingu” leukocytów jest zatem determinowana poprzez złożone procesy decyzyjne obejmujące wieloetapowe oddziaływania krążących komórek z komórkami śródbłonka. Konieczność wystąpienia wielofazowych oddziaływań białko-białko pozwala na wielorakie wykorzystanie genetycznie ograniczonych zestawów ligand-receptor do kontroli recyrkulacji różnych populacji leukocytów [Kieda 2003].

Chemokiny - cząsteczki biorące udział w regulacji migracji leukocytów

Czynniki zaangażowane w specyficzną adhezję limfocytów do śródbłonka

W transmigracji leukocytów do wtórnych organów limfoidalnych jak również do tkanek objętych zapaleniem uczestniczy kilka rodzin białek adhezyjnych. Selektyny są transmembranowymi glikoproteinami wiążącymi sialowane grupy cukrowe, zwykle mucyny. Znane są 3 typy selektyn: P-, E- i L-selektyny. Wszystkie posiadają domenę lektynową na końcu aminowym, odpowiedzialną za zdolność wiązania cukrów. Za nią znajduje się domena EGF oraz różna liczba stałych domen CR. Ilość domen CR to podstawowa różnica strukturalna między typami selektyn. E- i P-selektyna są dość powszechne na śródbłonku i mogą uczestniczyć w selektywnych reakcjach poprzez modulację stopnia i czasu ich ekspresji. Jednym z ich ligandów jest PSGL-1. L-selektyna znajduje się na wszystkich naiwnych limfocytach, neutrofilach i monocytach. Ligandami dla L-selektyny są: GlyCAM-1, CD34, podokaliksyna oraz MAdCAM-1. Ekspresja L-selektyny podlega kontroli różnych cytokin [Butcher 1991, Szekanecz i Koch 2000, Duś et al. 2004]. Drugą istotną rodziną białek adhezyjnych biorących udział w adhezji leukocytów do śródbłonka stanowią integryny. Integryny są heterodimerami zbudowanymi z podjednostek α i β. Podstawę ich klasyfikacji stanowi jednostka β. Co najmniej cztery integryny pośredniczą w silnej adhezji leukocytów do śródbłonka [Szekanecz i Koch 2000, Duś et al. 2004]. Integryny wykazują zdolność do dynamicznej regulacji aktywności, odbywającej się niezależnie od stopnia ich ekspresji. Na krążących w organizmie leukocytach znajdują się w stanie niesprzyjającym ich reakcji z ligandem, co zapobiega niespecyficznemu wiązaniu tych komórek do śródbłonka [Johnson i Butcher 2002]. W celu pełnienia swej funkcji w zatrzymaniu krążących komórek integryny muszą ulec aktywacji. Liczne doświadczenia in vitro dowodzą, że krzyżowe wiązanie L-selektyny na leukocytach lub wiązanie do E-selektyny może aktywować integryny. Jednakże sygnał ten nie jest wystarczający do indukcji adhezji w warunkach fizjologicznych, ponieważ stwierdzono, iż leukocyty mogą toczyć się na podłożach pokrytych P- i E-selektyną oraz glikolizowanych ligandach L-selektyny bez adhezji do ICAM-1 [Lawrence et al. 1990, Lawrence i Springer 1991]. Aktywacja integryn wymaga sygnału przenoszonego drogą receptorów dla chemokin. Stwierdzono, że chemokiny, poprzez indukowanie adhezji i kierunkowej migracji, spełniają ważną funkcję w specyficznej rekrutacji leukocytów [Taub 1996, Luster 1998, Zabel et al. 1999, Campbell i Butcher 2000, Johnson-Léger et al. 2000, Middleton et al. 2002, Johnson i Butcher 2002]. Proces ów podlega kontroli przez chemokiny na trzech kolejnych etapach: akumulacji krążących komórek w odpowiedzi na gradient chemotaktyczny na powierzchni endotelium, aktywacji leukocytów prowadzącej do ich zatrzymania i adhezji oraz kierunkowej migracji leukocytów do tkanki docelowej [Johnson-Léger et al. 2000].

Budowa chemokin

Chemokiny są cytokinami o właściwościach chemotaktycznych (ang. chemoattractant cytokines). Jako pierwsza została poznana chemokina IL-8 (nazwana później CXCL8), którą wyizolowano w 1987 roku z monocytów stymulowanych lipopolisacharydem [Yoshimura et al. 1987]. U człowieka znanych jest obecnie około pięćdziesiąt tych cząsteczek [Frederick i Clayman 2001]. Pod względem chemicznym chemokiny to peptydy (8-12kDa) zawierające od 70 do 130 aminokwasów, w tym cztery konserwatywne cysteiny. Ich ułożenie stanowi podstawę klasyfikacji chemokin w ramach czterech klas. Pierwsze trzy posiadają wszystkie cztery cysteiny, podczas gdy ostatnia - tylko dwie (rys. 4). Główne rodziny chemokin: chemokiny CXC i CC (chemokiny α i β) różnią się pozycją dwóch pierwszych cystein, które w przypadku chemokin CXC są przedzielone jednym aminokwasem, a w przypadku chemokin CC leżą obok siebie. Chemokiny CXXXC posiadają trzy aminokwasy pomiędzy pierwszą i drugą cysteiną. Wszystkie cztery cysteiny tworzą mostki disiarczkowe (Cys1→Cys3 oraz Cys2→Cys4), które nadają cząsteczkom charakterystyczną strukturę trójwymiarową [Luster 1998, Zlotnik i Yoshie 2000, Frederick i Clayman 2001, Baggiolini 2001, Johnston i Butcher 2002, Middleton et al. 2002, Houshmand i Zlotnik 2003, Arya et al. 2003].

Klasyfikacja chemokin wprowadzona została w 1996 roku [Zlotnik i Yoshe 2000]. Chemokiny definiuje się jako CXC, CC, C oraz CXXXC, dodając literę L (ligand) oraz numer (w kolejności odkrycia). Receptory dla chemokin określa się podobnie - na podstawie ich strukturalnej budowy, dodając literę R oraz numer (tab. 1). Podczas gdy systematyczna nomenklatura przyjęła się dla receptorów, w odniesieniu do chemokin nadal powszechnie używane są nazwy zwyczajowe.

Receptory dla chemokin

Chemokiny spełniają swoje funkcje poprzez wiązanie się do receptorów powierzchniowych na komórkach docelowych. Należą one do rodziny receptorów siedmiokrotnie przechodzących przez błonę komórkową, związanych z białkami G (zwykle Gi) [Murdoch i Finn 2000, Hwang 2004]. Receptory dla chemokin zbudowane są z około 350 aminokwasów, posiadają koniec aminowy na zewnątrz komórki, po trzy domeny zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe oraz koniec karboksylowy z sekwencją Ser-Thr zlokalizowany w cytoplazmie [Luster 1998, Murdoch i Finn 2000, Horuk 2001, Johnson i Butcher 2002]. Dotychczas udało się sklonować dziewiętnaście receptorów dla chemokin: sześć typu CXC, jedenaście CC, jeden CXXXC oraz jeden z rodziny C [Frederick i Clayman 2001, Horuk 2001]. Mimo iż każdy z nich wiąże tylko pojedynczą klasę chemokin, mogą one oddziaływać z wieloma przedstawicielami tej samej klasy z równie wysokim powinowactwem [Horuk 2001]. Co więcej, jedna chemokina ma możliwość wiązania i aktywacji wielu receptorów.

Adhezja komórek nowotworowych do endotelium. Rola komórek śródbłonka

Wyniki wielu badań wskazują, że adhezja znajdujących się w krwiobiegu komórek nowotworowych do endotelium może zachodzić w sposób zbliżony do opisanej adhezji leukocytów. Początkowy, przejściowy kontakt między komórkami nowotworowymi i endotelium (ang. docking) inicjuje ich aktywację, co prowadzi do ekspresji indukcyjnych cząsteczek adhezyjnych inicjujących trwałe wiązania [Orr et al. 2000]. Sygnał przekazywany przez integryny prowadzi do zatrzymania komórek nowotworowych, a następnie ich ekstrawazacji [Tang i Honn 1994, Kannagi 1997]. Pierwsze eksperymenty demonstrujące zdolność cząsteczek adhezyjnych endotelium do wiązania komórek rakowych prowadzone były w kulturach tkankowych, gdzie komórki nowotworowe wysiewano na warstwę komórek endotelialnych, a następnie inkubowano w celu umożliwienia utworzenia oddziaływań adhezyjnych. Traktowanie komórek śródbłonka egzogennymi cytokinami i czynnikami wzrostowymi prowadziło do zwiększenia adhezji komórek rakowych. Stosowano również peptydy blokujące oraz przeciwciała do identyfikacji molekularnej natury tych interakcji. Rezultaty dowodzą istnienia oddziaływań adhezyjnych między oboma typami komórek, które ulegają wzmocnieniu przez stymulację cytokinami oraz czynnikami wzrostu [Iwai et al. 1993, Orr et al. 2000]. Badania oddziaływań adhezyjnych były ponadto prowadzone w układach dynamicznych, z wykorzystaniem komór przepływowych lub sztucznych naczyń krwionośnych. Ich wyniki potwierdziły zdolność molekuł adhezyjnych do efektywnego zatrzymywania komórek nowotworowych w śródbłonku naczyniowym [Lawrence et al. 1990, Giavazzi et al. 1993]. Podobne rezultaty uzyskano przeprowadzając szereg doświadczeń in vivo [Orr et al. 2000]. Zatrzymanie komórek nowotworowych nie ma zatem, jak głosi jedna z teorii, podłoża mechanicznego - waskularne cząsteczki adhezyjne odgrywają decydującą rolę w specyfice procesu, analogicznie do ich zdolności do efektywnego kierowania migracją leukocytów do ogniska zapalnego [Orosz et al. 1995, Anasagasti et al. 1997]. Wybiórcze zatrzymanie komórek nowotworowych w układzie krwionośnym może być jednym z czynników decydujących o specyficznym charakterze procesu tworzenia przerzutów. Uważa się, że zjawisko to zależne jest od specyficznych interakcji między powierzchnią krążących komórek nowotworowych a endotelium. Śródbłonek naczyniowy aktywnie uczestniczy w determinowaniu miejsca zasiedlania przerzutujących komórek rakowych [Denekamp 1982, Butcher 1991, Fukumara 1997, Szekanecz i Koch 2000, Johnson-Léger et al. 2000, Timár et al. 2001, Bielawska-Pohl 2005]. Komórki endotelialne cechuje zdolność do tworzenia naczyń krwionośnych w sąsiedztwie oraz pod wpływem guza, jak również w jego wnętrzu [Jain i Padera 2002]. Zatem oprócz funkcji w określaniu specyficzności procesu przerzutowania, śródbłonek naczyniowy utrzymuje żywotność guza oraz umożliwia transport jego komórek z miejsca pierwotnego wzrostu do krwioobiegu. Pod tym względem komórki śródbłonka stają się pierwszym celem terapii antyadhezyjnej [Kieda 2003].

Rola chemokin i receptorów dla chemokin w procesie tworzenia przerzutów

Udział białek adhezyjnych w determinacji miejsca tworzenia metastaz sugeruje zaangażowanie w ów proces również czynników regulujących ekspresję tych cząsteczek, takich jak chemokiny [Frederick i Clayman 2001, Műller 2001, Payne i Cornelius 2002, Murakami et al. 2002, Arya i Patel 2003, Arya et al. 2003, Murakami et al. 2003, Kawada et al. 2004]. Trwają intensywne studia nad rolą chemokin w procesie wzrostu guza pierwotnego i tworzenia przerzutów [Singh et al. 1994, Sharma et al. 2000, Műller 2001]. Ostatnie doniesienia wskazują na udział poszczególnych chemokin w różnorodnych aspektach nowotworzenia [Frederick i Clayman 2001, Baggiolini 2001, Houshmand i Zlotnik 2003]. Zaznacza się ich udział w transformacji nowotworowej, indukowaniu angiogenezy, ekspansji klonalnej i wzroście guza wtórnego [Arya et al. 2003, Lamerant et al., in process]. Podkreśla się również ich udział w specyficznym tworzeniu przerzutów w określonych organach [Wiley et al. 2001, Takeuchi et al. 2004]. Chemokiny i receptory dla chemokin grają ważną rolę w generowaniu specyficznie ulokowanych przerzutów. Receptory dla chemokin obecne na komórkach nowotworowych zwiększają prawdopodobieństwo przerzutów do tkanek o zwiększonej produkcji danej chemokiny. Doświadczenia na modelach zwierzęcych sugerują, że zahamowanie funkcji tych receptorów może obniżyć zdolność komórek nowotworowych do przeżycia oraz ich rozprzestrzeniania się w organizmie [Arya et al. 2003]. Jednak najważniejsza rola tych chemotaktycznych cytokin może polegać na bezpośrednim wpływie na migrację komórek nowotworowych i ich inwazję [Müller et al. 2001]. Pierwsze dowody na bezpośrednie zaangażowanie chemokin w specyficzne tworzenie przerzutów zostały przedstawione przez Müller [Müller et al. 2001]. Wykazano, że komórki raka piersi wykazują ekspresję receptorów CXCR4 i CCR7 dla chemokin - odpowiednio CXCL12 i 6Ckine. Komórki raka piersi wykazujące ekspresję CCR7 przejawiają chemotaktyczną odpowiedź na 6Ckine. Interakcja 6Ckine-CCR7 może stanowić potencjalny mechanizm indukowania metastaz do węzłów chłonnych i inwazji tkankowej. Hipotezę tą potwierdziły doniesienia, że ekspresja CCR7 była obserwowana w 60% przypadków nowotworów układu pokarmowego i znacząco skorelowana z inwazją limfatyczną oraz z obecnością przerzutów w węzłach chłonnych. Willey [2001] wykazał, że ekspresja CCR7 zwiększa ilość przerzutów czerniaka do węzłów chłonnych w modelach mysich, a zahamowanie liganda (CCL21/6Ckine) znosi ten efekt. Ostatnie badania wskazały także na ekspresję CCR7 w niedrobnokomórkowym raku płuc oraz zaangażowanie receptora i chemokiny w procesie tworzenia metastaz w tym układzie [Takeuchi et al. 2004].

Adhezja, ekstrawazacja oraz migracja śródendotelialna mogą stanowić najbardziej specyficzne fazy wędrówek komórek nowotworowych. Zależą one od unikalnych interakcji komórka nowotworowa - endotelium. Na każdym etapie swoista selekcja odbywa się na podstawie odpowiedniego fenotypu obu rodzajów komórek, m.in. ekspresji chemokin i ich receptorów. Komórki endotelialne wykazują właściwości charakterystyczne dla danego organu, zatem komórki nowotworowe muszą przejawiać zdolność do rozpoznawania różnic pomiędzy komórkami śródbłonka tworzącymi naczynia krwionośne w różnych organach. Jednym z elementów odpowiedzialnych za specyficzne interakcje komórek nowotworowych z endotelium są chemokiny. Poznanie mechanizmów tego typu oddziaływań może więc mieć istotne znaczenie dla zrozumienia mechanizmów tworzenia przerzutów oraz opracowania skutecznych strategii terapeutycznych

Regulatorowe limfocyty T, czyli służby dyplomatyczne układu odpornościowego

Odkrycie Treg, czyli po nitce do kłębka...

Po raz pierwszy istnienie regulatorowych limfocytów T stwierdzono w 1969r. w Archi Center Research Institute w Nagoi, w Japonii. Doświadczeniem, które przyczyniło się do wysnucia hipotezy o ich istnieniu było usunięcie z mysiego, żeńskiego noworodka grasicy. Operacja taka niespodziewanie spowodowała zanik grasicy. Po wnikliwym zbadaniu okazało się, że zanik grasicy był spowodowany atakiem własnych komórek odpornościowych myszy. Co więcej, okazało się, że po wstrzyknięciu zwierzętom limfocytów T choroba ulegała regresji. Naukowcy stwierdzili, że w puli limfocytów T znajdują się tajemnicze komórki pomagające w hamowaniu odpowiedzi immunologicznej. Komórki te nazwano supresorowymi limfocytami T. Przez wiele kolejnych lat limfocyty Treg popadły w niełaskę wśród naukowców, gdyż nie dało się ich jednoznacznie zidentyfikować (np. znaleźć marker specyficzny marker powierzchniowy) i odseparować od całej reszty limfocytów. Wtedy rozpoczął się wyścig o znalezienie powierzchniowego markera, który w jednoznaczny sposób charakteryzowałby Treg. Dopiero w 1995r. Sakaguchi z Uniwersytetu w Kioto wykazał, że poszukiwanym markerem jest białko CD25 (receptor dla interleukiny 2) i że Treg należą do subpopulacji TCD4+

Jak wykazano obecność markera CD25 na powierzchni limfocytów Treg?

W celu ostatecznego potwierdzenia, że marker CD25 jednoznacznie charakteryzuje Treg, przeprowadzono następujące doświadczenie:

1. Od zdrowych myszy wyizolowano pulę limfocytów

2. Usunięto komórki CD4+ CD25+

3. Pozostałe limfocyty przeszczepiono myszom z genetycznym knockoutem (nie wytwarzały własnych limfocytów T)

W wyniku tych manipulacji, myszy po przeszczepach szybko zapadały na choroby autoimmunizacyjne, a co więcej ich przebieg był tym drastyczniejszy im więcej przeszczepiono limfocytów T pozbawionych puli CD4+CD25+. Nowe światło na funkcję regulatorowych limfocytów T rzuciło niedawne odkrycie, że komórki te (u myszy) zawierają ponadprzeciętną ilość wewnątrzkomórkowego białka - czynnika transkrypcyjnego - Foxp3. Po sztucznym wprowadzeniu Foxp3 za pomocą wektora retrowirusowego do zwykłych limfocytów okazywało się, że przekształcały się one w limfocyty regulatorowe. Naukowcy z University of Washington na podstawie tych badań wywnioskowali, że Foxp3 jest czynnikiem przeprogramowującym limfocyty T w limfocyty regulatorowe.

Nowo odkryte subpopulacje regulatorowych limfocytów T

Badania nad scharakteryzowaniem molekularnego wzorca powierzchniowego limfocytów T regulatorowych ciągle trwają i w ciągu ostatnich kilku lat odkryto również inne subpopulacje tych komórek:

Nazwa	Markery powierzchniowe	Pochodzenie
Treg	CD4+, CD25+, Foxp3+	Śledziona
Tr1	CD4+, IL-10+, Foxp3-	Obwodowe narządy limfoidalne
Th3	CD4+, TGF-β+	Obwodowe narządy limfoidalne

• Tabela 1. Charakterystyka nowoodkrytych subpopulacji limfocytów regulatorowych

Proces powstawania i dojrzewania limfocytów regulatorowych w grasicy

Proces dojrzewania Treg w grasicy jest mało poznany. Podejrzewa się, że największe znaczenie ma w nim interakcja pomiędzy cytotoksycznym receptorem charakterystycznym dla komórek T na komórkach CD4+CD25+ i antygenów własnych prezentowanych w kontekście MHC klasy II na komórkach rdzenia grasicy. Naukowcy uważają, że mechanizm dojrzewania nie różni się od dojrzewania innych limfocytów T, jednak że powinowactwo receptorów TCR na komórkach CD4+CD25+ do antygenów jest znacznie większe, niż na innych limfocytach. W procesie dojrzewania populacji limfocytów Treg CD4+CD25+ największą rolę odgrywają takie receptory i cytokiny jak: CCR8, CD28, CD40, B7.1, B7.2, IL-2 i TGF-β, które są niezbędne do prawidłowego ukształtowania i funkcjonowania tych komórek

Proces powstawania i dojrzewania limfocytów regulatorowych poza grasicą

Badania holenderskiej grupy badaczy pod przewodnictwem Taamsa wykazały, iż komórki regulatorowe mogą również powstawać poza grasicą [6]. Grupa ta izolowała komórki Treg z krwi obwodowej i sprawdzała ekspresję markerów. Okazało się, że wyizolowane limfocyty regulatorowe wykazują niską ekspresję markerów CD45RB, CD95 oraz małe stężenie Bcl-2 charakterystycznych dla limfocytów T wysoce zróżnicowanych w wyniku stymulacji kilkukrotnej tym samym antygenem. W doświadczeniu przeprowadzonym przez tą grupę, użyto wysoce zróżnicowane limfocyty T swoiste dla antygenu hemaglutyniny S1, które wykazywały ekspresję MHC klasy II i mogły prezentować sobie nawzajem antygen, w wyniku czego stawały się komórkami spełniającymi kryteria komórek CD4+CD25+ Treg. Wyniki tych badań wskazują na możliwość powstawania komórek CD4+CD25+ Treg na obwodzie w specyficznych warunkach, przy braku kostymulacji przez dojrzałe komórki APC (Antigen presenting cells). Co więcej doświadczenia przeprowadzone przez inną grupę naukowców [7] w warunkach in vitro na limfocytach mysich i ludzkich potwierdzają możliwość powstawania limfocytów Treg CD4+CD25+ z limfocytów T CD4+CD25-. Zauważyli oni, że w hodowli komórek T CD4+CD25- po zastymulowaniu ich TGF-β i IL-2 ulegają transformacji do komórek Treg CD4+CD25+ .

Mechanizmy regulacji odpowiedzi immunologicznej, czyli dyplomatyczne działania Treg....

Do tej pory poznano kilka mechanizmów regulacji odpowiedzi immunologicznej przez limfocyty regulatorowe:

1. Po pierwsze jest to aktywna inhibicja efektorowych limfocytów T poprzez oddziaływanie komórka - komórka. W badaniach in vitro stwierdzono, że za hamowanie efektorowych limfocytów T odpowiedzialne jest wydzielanie IL10 i TGF-β. Największe znaczenie odgrywa TGF -β , związany z błoną komórkową limfocytów Treg

2. Niepobudzone komórki Treg na swej powierzchni wykazują wysoką ekspresję receptora łańcucha a cytokiny IL-2 (CD25), dla łańcucha g IL-2 (CD122) oraz innych cząsteczek takich jak HLA-DR, CD45RO, wewnątrzkomórkowy receptor CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4) oraz CD134 (OX40). Jedną z niewielu uchwytnych morfologicznych zmian zachodzących podczas aktywacji limfocytów CD4+CD25+ poprzez receptor TCR jest wzrost ekspresji receptora CTLA-4, który ulega przemieszczeniu z cytoplazmy na powierzchnię komórki. Ligandem białka CTLA-4 znajdującego się na powierzchni aktywowanego limfocyta Treg jest receptor B7 na komórkach docelowych. Wynikiem połączenia się białka CTLA-4 z receptorem B7 jest spadek wytwarzania IL-2 przez limfocyty bezpośrednio poddane działaniu Treg. W następstwie obniżenia uwalniania IL-2 następuje spadek proliferacji pozostałych limfocytów.

3. Kolejnym czynnikiem któremu przypisuje się znaczenie supresyjne regulatorowych limfocytów CD4+CD25+ jest receptor GITR (glucocortocoid-induced tumor necrosis factor receptor). W badaniach in vitro [6] po zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych blokujących receptor GITR nastąpiło osłabienie właściwości inhibicyjnych komórek Treg.

4.Innymi kandydatami receptorów odpowiedzialnych za supresję limfocytów efektorowych mogą być cząsteczki PD-1 oraz Notch. W dotychczasowych badaniach nie udało się jednoznacznie określić struktury i znaczenia tych receptorów w bezpośrednich interakcjach komórkowych. Stwierdzono jedynie, że u myszy transgenicznych z brakiem receptora PD-1 rozwija się autoimmunizacyjne zapalenie kłębuszków nerkowych, zapalenie stawów i autoimmunizacyjna kardiomiopatia rozstrzeniowa.

Dwustopniowa teoria działania Treg

Nie do końca poznanym mechanizmem jest to, w jaki sposób tak mało liczna populacja komórek jest w stanie nadzorować pozostałe komórki układu immunologicznego. Pewnym wyjaśnieniem może być teoria dwustopniowego działania Treg, zwana tolerancją zaraźliwą (infectious tolerance). Teoria ta dzieli mechanizm na dwa, sekwencyjnie występujące po sobie zdarzenia:

1. W pierwszym etapie komórki Treg CD4+CD25+ w kontakcie bezpośrednim z limfocytami T CD4+CD25- indukują ich anergię i uwalnianie przez nie IL-10 i TGF-β. W ten sposób powstają anergiczne limfocyty Tsup, zdolne do wydzielania IL-10 i TGF-β.

2. W drugim etapie powstałe uprzednio Tsup działają hamująco na kolejne limfocyty CD4+CD25-.

Powstała hipoteza była wynikiem obserwacji hodowli mieszanej limfocytów Treg CD4+CD25+ z limfocytami CD4+CD25-. Zaobserwowano mianowicie, iż po pewnym czasie z takiej hodowli można wyizolować limfocyty Treg CD4+CD25+, jak również Tsup, zdolne do hamowania świeżo wyizolowanych limfocytów CD4+CD25-. Co więcej w supernatantach pohodowlanych stwierdzono znaczne ilości IL-10 i TGF-β.

W przypadku badań in vivo mechanizm supresji jest dużo bardziej złożony, ponieważ zależy od immunogenności antygenu. W zakażeniach bakteryjnych następuje silna aktywacja wielu komponent układu immunologicznego, co niesie ze sobą zagrożenie powstania wstrząsu septycznego. W takiej sytuacji działanie limfocytów Treg musi objąć cały organizm, co może nastąpić jedynie poprzez sieć cytokin hamujących proces zapalny, IL-10 i TGF-β. W przypadku autoantygenów rola limfocytów Treg powinna się ograniczyć do neutralizacji komórek autoreaktywnych. Do takiej eliminacji limfocytów wystarczający może być kontakt bezpośredni z Treg, bez konieczności uruchamiania sieci cytokin.

Regulacja mechanizmu regulacji....czyli wpływ innych czynników na regulatorowe limfocyty T

Limfocyty regulatorowe Treg muszą być przygotowane na kilka możliwych scenariuszy. Musi więc istnieć mechanizm, który pozwoli m.in. rozróżnić własną florę bakteryjną w organizmie, od obcego patogenu, który wniknął do organizmu drogą skórną. Na typ reakcji który nastąpi największy wpływ ma środowisko, w którym komórki te po raz pierwszy będą miały do czynienia z antygenem. Naukowcy wyróżnili 3 główne klasy molekuł, które mają wpływ na sterowanie zachowaniem limfocytów Treg. Są to:

1. Cytokiny

Wiele cytokin jest w stanie bezpośrednio wpływać na zachowanie Treg. Jedną z nich, najlepiej poznanych jest IL2, która, jak udowodniono w testach in vitro, powoduje zmniejszenie supresorowych właściwości Treg. Co więcej, udowodniono w badaniach na myszach bez receptora na IL2 lub bez IL2, które nie syntezowały własnych regulatorowych Treg i w większości cierpiały na śmiertelne choroby autoimmunologiczne. Innymi ważnymi w regulacji aktywności Treg są IL15, IL7 i IL4. Wykazano również, że IL1, IL6 i IL12, które są produkowane przez dojrzałe komórki APC mogą oddziaływać bezpośrednio na Treg i powodować zwiększoną odpowiedź na IL2 i wzmożoną proliferację Treg.

2. Cząsteczki współstymulujące

Innym opisywanym mechanizmem zachodzącym po bezpośredniej interakcji między komórką APC, a Treg. Dojrzałe APC charakteryzują się wysokim poziomem ekspresji molekuł CD40, CD80/86, które mogą pobudzać do działania limfocyty Treg. W badaniach in vivo stwierdzono, że myszki z deficytem CD86 i CD40 syntetyzują znacznie mniejszą ilość Treg, niż myszy o dzikim genotypie. Fakt ten sugeruje, że CD80 i CD40 dodatnio wpływają na proces proliferacji Treg. Podsumowując, zarówno cytokiny, jak i cząsteczki współstymulujące, które są obecne na powierzchni dojrzałych APC mogą wpływać na funkcjonowanie Treg, poprzez stymulację dojrzewania, proliferacji i stymulując ich hamujące działanie.

3. Sygnalizacja za pomocą TLRs (Toll like receptors)

Sygnalizacja wewnątrzkomórkowa zachodząca z udziałem TLR, czyli receptorów rozpoznających molekularne wzory patogenności, odgrywa znaczącą rolę w zapoczątkowaniu odpowiedzi immunologicznej. Receptory TLR 1, 2 i 6 są znajdowane zarówno na Treg, jak i na efektorowych limfocytach T. Jednak, po wnikliwej analizie okazało się, że Treg wykazują dużo wyższą ekspresję TLR4, 5, 7 i 8 niż efektorowe limfocyty T. Największy wpływ na proliferację innych, nieaktywnych limfocytów Treg miał TLR2, pochodzący od innych Treg. Co więcej udowodniono, że współoddziaływanie przez TLR2 i TCR powoduje wzmocnienie odpowiedzi Treg

Terapeutyczne zastosowania limfocytów regulatorowych

Najbardziej oczywistym zastosowaniem limfocytów Treg jest zwiększenie ich aktywności w celu zwalczania chorób autoimmunizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów, czy cukrzyca typu I. Co więcej, komórki te dają olbrzymią nadzieję na rozwiązanie problemu odrzucania przeszczepów. Na przeciwległym biegunie znajdują się choroby, które są spowodowane zbyt dużą ilością komórek regulatorowych, jak np. nowotwory. Wykazano bowiem, że komórki nowotworowe stymulują migrację Treg w pobliże guza, co powoduje obniżenie aktywności odpowiedzi immunologicznej i rozpoznanie komórek guza jako własnych. Era opracowania leków, które zwiększałyby lub zmniejszały subpopulacje komórek Treg właśnie się rozpoczyna.... Co może napawać optymizmem jest fakt odkrycia możliwości generacji i ekspansji limfocytów Treg CD4+CD25+ z limfocytów T CD4+CD25- po zasymulowaniu TGF-β i IL2, który został opisany wcześniej.

51

---