Biolomolo Ćwiczenia, rok numer trzy, biolomolo


METODY ANALIZY KWASÓW NUKLEINOWYCH

  1. Jeżeli chcemy otrzymać DNA z jakiejkolwiek tkanki, to przed wyizolowaniem musimy tę tkankę najpierw:

  1. zhomogenizować:

  1. LUB zniszczyć całą komórkę przy pomocy detergentów, np.:

  • jeżeli dodatkowo chcemy pozbyć się RNA z naszego preparatu to inkubujemy go w 37°C w obecności rybonukleazy A

    1. Metody izolacji DNA:

        1. ekstrakcja z użyciem mieszaniny fenolu i chloroformu:

          • kilkukrotne wytrząsanie lizatu z fenolem i chloroformem - usunięcie lipidów i białek (za denaturację białek odpowiedzialny jest fenol -zbierają się one na granicy faz)

          • wytrącenie DNA - konieczne są:

    - izopropanol/etanol

    - niska temperatura

    - obecność jonów sodu

    - TRIS - zapewnia lekko zasadowe pH (bufor właściwy)

    - EDTA - chelatuje jony, przez co DNA jest bardziej stabilny

        1. adsorpcja na kolumnach wypełnionych krzemionką

        1. przy pomocy cząstek magnetycznych:

    - polistyrenem/krzemionką zwiększenie adsorpcji DNA

    - LUB silanem (silanizacja)

    1. Jak już wyizolujemy DNA, to sprawdzamy, czy nadaje się do dalszych analiz - określamy jego stężenie i ewentualne zanieczyszczenia (fenol, EDTA, heparyna). Korzystamy ze spektrofotometrycznej analizy widma w zakresie 230-280 nm

    1. STĘŻENIE - pomiar absorbancji przy 260 nm (tam kwasy nukleinowe wykazują maksimum absorpcji) -

  • CZYSTOŚĆ - pomiar absorbancji przy: 280 nm (maksimum absorbancji białek) i 230 nm

    1. PCR - Łańcuchowa reakcja polimerazy - służy do powielenia ściśle określonego, wybranego odcinka DNA

        1. główne cechy:

        1. składniki reakcji PCR:

    - jednoniciowe oligonukleotydy komplementarne do sekwencji, która sąsiaduje z tym fragmentem, który chcemy zamplifikować

    - umożliwiają inicjację procesu - są „punktem przyczepu” dla polimerazy DNA

    - muszą być dwa startery - po każdym dla jednej nici DNA - starter sensowny dla nici sensownej i starter antysensowny dla drugiej nici (i on jest jakby „na drugim końcu” powielanej sekwencji)

        1. przebieg procesu:

    TEMPERATURA

    CO SIĘ DZIEJE?

    95°C

    denaturacja DNA - rozplecenie helisy

    50-65°C (charakt. dla danej pary starterów)

    przyłączenie się starterów

    72°C

    wydłużanie starterów pod wpływem polimerazy

    1. Życie nie jest proste (a już zwłaszcza studenta… no chyba, że na UAMie), więc mamy jeszcze kilka wariacji na powyższy temat tzn. modyfikacji PCR

        1. multipleks PCR - amplifikujemy na raz kilka różnych fragmentów

        1. Hot-start PCR - PCR z użyciem polimerazy typu Hot-start, która jest aktywowana dopiero w 95°C (czyli wtedy, kiedy denaturuje DNA)

    - przeciwciało

    - LUB termolabilną grupę chemiczną, która odłącza się od polimerazy po ogrzaniu

        1. MSP PCR - metylospecyficzna reakcja PCR - umożliwia analizę profilu metylacji danego fragmentu (to jest to co robiliśmy na zajęciach i o niej powiem dokładniej niżej)

    1. MSP PCR - cały myk polega na tym, że zanim zaczniemy powielać nasze DNA poddajemy je konwersji w obecności NaHSO3:

        1. sekwencja zmetylowana nie ulegnie zmianie i nadal będzie zawierała cytozynę

        2. sekwencja niezmetylowana ulegnie modyfikacji - niezmetylowana cytozyna zamieni się na uracyl

        1. skoro mamy dwie różne „wersje” tego samego DNA, to trzeba użyć dwóch różnych par starterów

        1. musimy jeszcze wrzucić coś w stylu „prób odniesienia”, żeby skontrolować, czy wyniki są wiarygodne (czy bufor był dobry, stratery nie za stare etc.)

        1. interpretacja wyników:

    Starter dla

    zmetylowanego DNA

    Starter dla

    niezmetylowanego DNA

    Interpretacja

    Produkt

    Brak produktu

    Gen zmetylowany

    Brak produktu

    Produkt

    Gen niezmetylowany

    Produkt

    Produkt

    Tylko jeden z alleli genu jest zmetylowany

        1. zastosowanie:

    1. ELEKTROFOREZA DNA - metoda identyfikacji otrzymanych w PCR fragmentów DNA.

        1. zasada metody:

        1. nośnikami są:

        1. do przeprowadzenia elektroforezy konieczny jest też roztwór przewodzący prąd, na którym w sumie przygotowuje się żel:

        1. przebieg procesu:

    - mają dodany barwnik, żeby było widać, kiedy i gdzie elektroforeza się skończyła

    - zostały obciążone czymś zwiększającym lepkość (np. glicerolem), żeby przypadkiem nie wypłynęły ze studzienek zanim zaczniemy elektroforezę

    1. MIKROMACIERZE DNA - umożliwiają badanie wieeeeelu fragmentów DNA jednocześnie.

        1. zastosowanie:

        1. zasada metody:

        1. rodzaje mikromacierzy:

    mikromacierze cDNA

    mikromacierze oligonukleotydowe

    sposób syntezy

    przy pomocy odwrotnej transkryptazy na matrycy mRNA

    chemiczny, np. fotolitografia

    znajomość sekwencji docelowej

    niekonieczna

    konieczna

    liczba sond na płytce

    kilkaset - kilkadziesiąt tysięcy

    kilkaset tysięcy

    co oceniamy

    wszystkie rodzaje RNA, które służyły do syntezy mikromacierzy

    ? - jedna sonda jest zaprojektowana specyficznie do jednego transkryptu

    przygotowanie RNA

    1) próbkę też podajemy działaniu odwrotnej transkryptazy i znaczymy znacznikiem: czerwonym lub zielonym (osobny dla komórki zdrowej, osobny dla nowotworowej)

    2) miesza się obie frakcje RNA („czerwoną” i „zieloną”)

    1) próbkę poddajemy działaniu odwrotnej transkryptazy

    2) transkrypcja cDNA in vitro wyznakowane biotyną cRNA

    przebieg procesu

    • na gotową mikromacierz nanosi się próbkę oznaczoną fluorescencyjnie

    • wiązanie próbek z mikromacierzą

    • wymycie niezwiązanych fragmentów

    • odczyt fluorescencji (skanujemy dwa razy - raz żeby wzbudzić barwnik czerwony i drugi raz dla zielonego są dwa obrazy)

    • nałożenie obrazów na siebie - jak się pokrywają to jest kolor żółty

    • nansienie próbek

    • wiązanie próbek z mikromacierzą

    • nałożenie roztworu z awidyną z przyłączoną fikoerytryną

    • awidyna wiąże się selektywnie z biotyną, a fikoerytryna fluoryzuje

    Dwa eksperymenty - osobno dla próby badanej, osobno dla kontrolnej

    WYNIK

    WYNIK WZGLĘDNY

    porównuje się różnice w takich obrazach z komórki zdrowej i z komórki nowotworowej - im silniejsza fluorescencja tym silniejsza ekspresja

    WYNIK BEZWZGLĘDNY:

    Obraz miejsc i intensywność fluorescencji niesie informację o tym, które geny z jakim nasileniem uległy ekspresji (nie musimy odnosić się do próby kontrolnej, żeby stwierdzić, co się zmieniło)

    PCR W CZASIE RZECZYWISTYM

      1. Ilościowe metody oznaczania RNA:

    1. elektroforetyczne - porównanie rozdzielonego RNA ze znacznikiem masy

    2. hybrydyzacyjne - Northern blotting

    3. amplifikacyjne - PCR w czasie rzeczywistym (rt PCR)

      1. PCR w czasie rzeczywistym - po każdym cyklu sprawdza się poziom fluorescencji, która jest wprost proporcjonalna do ilości skopiowanego w danym cyklu materiału genetycznego.

    1. oznaczać w ten sposób można:

  • etapy procesu:

    1. interpretacja wyników:

    - jest ekspresja dużo DNA mało koniecznych cykli MAŁY WYNIK

    - nie ma ekspresji mało DNA trzeba dużo cykli, żeby go powielić DUŻY WYNIK

    1. zastosowanie metody:

      1. Izolacja RNA:

    1. całe przedsięwzięcie jest problematyczne, bo RNA jest nietrwały:

    1. podobnie jak w przypadku DNA, izolacja RNA musi być poprzedzona homogenizacją:

    1. metoda Chomczyńskiego (AGPC) - umożliwienie izolacji RNA z wielu próbek jednocześnie

    1. metoda kolumienkowa

      1. I znowu analogicznie do badań DNA - sprawdzamy, czy to nasze wyizolowane DNA w ogóle się do czegoś nadaje:

    1. spektrofotometrycznie:

    - < 1,8 zanieczyszczenie białkami

    - > 2,1 zanieczyszczenie rozpuszczalnikami organicznymi

    1. elektroforeza:

      1. To teraz dla odmiany coś, czego przy analizie DNA nie było - reakcja odwrotnej transkrypcji

    1. ma na celu syntezę cDNA - jednoniciowej kopii RNA

    2. do reakcji konieczne są:

  • powstają hybrydy cDNA-RNA, które są substratami we właściwej reakcji rtPCR

  • rodzaje starterów:

    1. etap ten jest kluczowy dla całego procesu rtPCR

      1. Właściwa reakcja PCR:

    1. warunki procesu:

    TEMPERATURA

    CZAS

    CO SIĘ DZIEJE?

    95°C

    jedna do kilkunastu minut

    rozplecenie helisy cDNA

    aktywacja polimerazy Taq

    50-60°C

    przyłączenie się starterów - tzw. hybrydyzacja odcinków starterowych

    72°C

    wydłużanie starterów pod wpływem polimerazy

    1. uwagi:

    1. etap dodatkowy, którego nie ma w klasycznym PCR - pomiar fluorescencji

    - nieswoistej detekcji

    - swoistej detekcji

      1. Metoda nieswoistej detekcji

    1. używa się fluorochromów, które wykazują zdolność do interkalacji niespecyficznego dsDNA, np.:

    - wzbudzenie przy 497 nm

    - emisja światła o długości 520 nm

    1. taki znacznik związany z cDNA, wykazuje większą fluorescencję niż bez cDNA

    2. zalety: niski koszt

    3. wady: może powodować błędne zawyżenie wyniku ekspresji, np. przez dimery starterów

    - zwiększamy temperaturę mieszaniny tak o 0,5°C i mierzymy w tym czasie fluorescencję

    - dsDNA będzie się „topił”, czyli rozplatał helisę, przez co znacznik będzie miał mniej cząsteczek, z którymi mógłby się związać i fluorescencja będzie spadać

    - pojedynczy pik odpowiadający temperaturze topnienia świadczy o tym, że została powielona tylko jedna sekwencja i nie ma żadnych syfów (każde DNA ma swoją temperaturę topnienia i gdyby próba była czymś zanieczyszczona to wyszłoby więcej pików)

      1. Metoda swoistej detekcji

    1. zamiast znaczników fluorescencyjnych używa się:

    1. mechanizm działania sond hydrolizujących typu TaqMan

    Porównanie obu metod:

    Cecha

    Metoda niespecyficzna

    Metoda specyficzna

    koszt

    niższy

    wyższy

    specyficzność

    niska

    wysoka

    wygoda

    tak - uniwersalność dla każdej sekwencji

    nie - do każdej sekwencji trzeba projektować sondę

    wpływ mutacji w DNA na czułość

    nie

    tak

    wpływ niespecyficznych produktów na czułość

    zawyżenie wyników

    nie

    wpływ długości amplikonu na fluorescencję

    tak

    nie

    reakcja multiplet

    nie

    tak

    ocena specyficzności

    konieczna (elektroforeza lub krzywa topnienia)

    niekonieczna

      1. KRZYWA AMPLIFIKACJI REAKCJI rtPCR - wykres zależności intensywności sygnału fluorescencji od liczby cykli oznaczającej upływ czasu reakcji

          1. na wykresie zaznaczamy względny wzrost fluorescencji po każdym cyklu (ΔRn) - różnice między względnym poziomem fluorescencji a poziomem tła

          2. nachylenie tej krzywej jest zawsze takie samo i oznacza wydajność reakcji amplifikacji

          3. wyznaczamy CT - liczbę kopii cDNA, występującą w momencie, gdy krzywa amplifikacji przecina linię progową wyznaczoną arbitralnie

            • im większa początkowo liczba kopii tym MNIEJSZA wartość CT, ponieważ potrzeba jest mniej cykli, żeby osiągnąć taką ilość kopii cDNA, która przekroczy linię progową

        1. w krzywej amplifikacji wyróżniamy kilka faz:

      1. Określenie wydajności reakcji rtPCR:

          1. optymalna wydajność = 90-105%

          2. 0x08 graphic
            w celu jej określenia wykonujemy krzywą standardową - zależność CT od logarytmu dziesiętnego wyjściowego stężenia szeregu rozcieńczeń jeden próbki DNA;

          1. wydajność zależy od:

      1. Standardy kontroli - pozwalają na weryfikację przebiegu procesu:

          1. WEWNĘTRZNE:

          1. ZEWNĘTRZNE - dodanie znanej ilości cząsteczek DNA/RNA do każdej próby (w jednej probówce i dla jednej pary starterów)

      1. Określanie ilości wyjściowego DNA - czyli to o co nam tak właściwie chodzi:

          1. metoda BEZWZGLĘDNA:

    - procentowej zawartości DMO w produkcie

    - liczby ustrojstw w papu

    - stopnia zainfekowania materiału biologicznego ustrojstwem

          1. metoda WZGLĘDNA:

    ANALIZA BIAŁEK a'la BIOLOGIA MOLEKULARNA

    1. PROTEOM - wszystkie białka ulegające ekspresji + informacje ich dotyczące

    1. Techniki stosowane w analizie białek:

    1. rozdzielenie białek na podstawie różnic w ich masach - filtracja żelowa

    2. rozdzielenie białek z wykorzystaniem ładunku elektrycznego:

  • rozdzielenie białek z wykorzystaniem ich powinowactwa do określonych grup chemicznych - chromatografia powinowactwa

  • metody immunochemiczne (tym już badamy białka, które są oczyszczone powyższymi metodami:

    1. spektroskopia mas - określenie tożsamości białka na podstawie jego masy, np. MALDI

    1. Chromatografia powinowactwa:

    1. białko specyficznie adsorbuje na ligandzie

    1. rodzaje oddziaływań między białkiem a ligandem:

    1. nośniki - muszą być zaktywowane przed przeprowadzeniem procesu (np. przez reakcję z halogenocyjanami); są to pochodne:

    1. przebieg procesu

    1. ELEKTROFOREZA:

    1. odpowiednie podłoża zapewniają połączenie dwóch technik: