bio egzamin notatki(1), ochrona środowiska PB

Zestaw I

1. Elementy genów u prok i eukar

u prokar:

-DNA upakowany w nukleoid

-DNA jest zamkniętą cząsteczką (kolistą)

-DNA jest mniejsze

-jest DNA plazmidowe

u eukar:

-DNA jest w jądrze komórkowym

-jest kilka chromosomów gdzie jest zawarty materiał eukariotyczny

-DNA większe

-nie ma DNA plazmidowego, jest DNA mitochondrialne

2. Operony

I Operon lac - laktazowy - jednostka prokariotycznej jednostki genu, który zawiera promotor i operator laktozowy, gen kodujący lak I, gen kodujący acetylazę - on działa, gen lak I - nieczynny jak jest monomeryczne. Tetrametr jest aktywny, wielkie powinowadztwo do operatora lac. On siedzi na tym białku i gen jest nieczynny. Gdy włożymy E. coli do roztworu laktozy. Mimo to gen jest nieczynny to zawsze jest 1 lub 2 cząsteczki zsyntetyzowane.

II operon tryptofanu - składa się z 5 genów A, B, C, D, E sekwencja AT - ma to miejsce O, promotor, operon tryptofanu - syntezuje białka. W obecności tryptofanu represor staje się aktywny i siada na sekwencję O - odblokowując pracę genu. Gdyby normalnie nastąpiła transkrypcja to powstałby mRNA o strukturze spinki do włosów. Sekwencje u w genie . na genie sekwencja tryptofanu, koduje tryptofan na mRNA. Przy dużym stężeniu tryptofanu powstaje struktura prawdziwej spinki do włosów.

3.Białko i jego struktura

Białka to wielkocząsteczkowe polimery aminokwasów.Białka proste, złożone, globularne i fibralne (ze względu na strukturę III) I- sekwencja aminokwasów, II-sposób zwinięcia łańcucha polipeptydowego w określony kształt, III- sposób przestrzennego ułożenia struktur II, IV- zdolność do tworzenia wielkich agregatów.

Główne składniki bialek : C(50-55%), H(6,6-7,3%), tlen(19-21%), azot(20%), siarka(0,3-2,4%), fosfor i pierwiastki rodziny fluorowców.

Ulegają denaturacji czy hydrolizie do proteaz , polipeptydów aminokwasów.

Białka są wyjątkowo wrażliwe na działanie czynników fizycznych i chemicznych.

Białka dzielimy na :proste (proteiny)i złożone(proteiny).

Mogą być w strukturze globularnej i włóknistej.

Struktura I-rzędowa - aminokwasy są połączone w białku wiązaniami peptydowymi powstającymi między grupami alfa- karboksylowymi i alfa- aminowymi. Powstające polipeptydy maja koniec N i konić C.

Struktura II-rzędowa - polipeptydy mogą zwijać się w regularne struktury . Prawoskrętna alfa-helisa.

Struktura III-rzędowa- różne odcini struktur II-rzędowych oraz rejony łączące te struktury zwijają się w dobrze zdefiniowana strukturę III- rzędową w której większość aminokwasów hydrofilnych znajduje się na powierzchni struktury, a hydrofobowych w jej wnętrzu. Denaturacja prowadzi do utraty struktury II i III- rzędowej

Struktura IV-rzędowa - wiele białek zawiera więcej niż jeden polipeptyd. Hemoglobina ma dwa łańcuch alfa i 2 łańcuchy beta. Duże kompleksy takie jak mikrotubule tworzą się przez IV- rzedową asocjację pojedynczych łańcuchów polipeptydowych.

Kolagen - typowe białko tkanki łącznej,występuje pozakomórkowo w postaci włókien o poprzecznym prążkowaniu.Ze względu na dużą zawartość aminokwasów nietypowych(praliny i hydroksyproliny), struktura kolagenu odbiega od typowego alfa -heliksu. Cząsteczka składa się z trzech łańcuchów polipeptydowych splecionych spilarnie. Kolagen jest nierozpuszczalny w wodzie, natomiast podczas gotowania przekształca się w rozpuszczalną żelatynę.

Inne białka:

1. białka tkanki mięśniowej: -białka sarkoplazmy(mioceny A i B, globulina, mioglobina);

2.białka tkanki okrywającej, podporowej i łącznej: keratyna, kolagen, elastyna

3.białaka krwi: hemoglobina, inne białka czerwonych krwinek, białka plazmy.

Białka osocza krwi(albumina, globulina, fibrynogen

Fibrynogen i fibryna odpowiedzialne za krzepnięcie krwi

4. białka mleka: kazeina, albumina, globulina

4. Klonowanie

Klon-populacja identycznych pod każdym względem cząsteczek organizmów, komórek cząst. DNA, pochodzi zawsze ona od 1 cząsteczki.

Klonowanie polega na rekombinacji DNA

DNA klonowany:

Izolacja z genomu dawcy
Resynteza na matrycy mRNA
Synteza chemiczna

Wektor:-plazmidowy

-fagowy

-kosmid

powstaje DNA zrekombinowany w wyniku transformacji powstaje -komórka biorcy-ekspresje nowej inform. genetycznej białka.

Biorcą najczęściej są komórki E. Coli. Namnażamy ją i uzyskujemy b. dużo transformantów. DNA dawcy jest cięty(trawienie restryktozą), otrzymujemy kawałki DNA. DNA wektora tez tniemy. Restryktazy - nożyce molekularne, tną w pewnych miejscach DNA. Łączymy te 2 fragmenty DNA(proces ligacji) otrzymujemy zrekombinowane DNA,które wprowadza się do komórki biorcy. Transformacja i zmieniony gen komórki biorcy transfomer.

Jak uzyskujemy fragmęty do rekombinacji:

losowe cięcie DNA enzymami restrykcyjnymi
synteza komplementarnego DNA na mRNA, przy pomocy odwrotnej transkryptazy otrzymuje się hybryd, złożony z 2 różnych zwiazków.

Wyłaniania mRNA z komórki posiada go poli A (nie posiada go rybosomalne ani transformacyjne) . Kolumna z wypustkami T, one łącza tylko mRNA, a reszta wyleci. Eliminujemy z kolumny za pomocą buforów mRNA, a na nim syntetyzujemy DNA. Hydroliza alkaliczna lub z erenozą H- olega na tym, że NaOH (hydroliza alkaliczna) lub reenaza potnie RNA, powstanie c-DNA, polimeraza syntetyzuje 2 nić c-DNA. Aby uzyskać do klonowania, te czasteczki muszą zawierać na swoich końcach cząsteczki niesparowane.

Nulkeaza S₁ (wycina niesparowany koniec) i dosyntetyzowuje końcówki TTT lub AAA, miejsca do klonowania.

Wektory- plazmidy, fagi np. FAG α, kosmoidy

Plazmidy- b. Małe do 200 kpz. Należy je przygotować.

Przygotowanie plazmidowego DNA:

Bufory, roztwór SDS i roztwór zasady NaOH, SDS rozrywa błony komórkowe E. Coli denaturuje białko. NaOH rozkłada DNA i hydrolizuje RNA. Ekstrakcja fenolowa, sączenie jonowymienne. Kolumny z żelem, przez nie przepuszczamy na kolumnie zatrzymują się DNA, które następnie wymywamy. Wytrącone DNA może być zanieczyszczone RNA, do pozbywania RNA używa się RNazy. TE-tris EDTA dobrze rozpuszcza się w wodzie.

Klonowanie w wektorach plazmidowych.

Miejsce E- pojedyńcze miejsce do cięcia molekularnego enzymem restrykcyjnym ECORI. Obcy DNA też powinien posiadać na końcach identyczne sekwencje jak DNA plazmidowe, pocięte przez ECORI. Gdy duże takie kawałki znajdą się w roztworze to ze sobą połączą się. Ten kawałek zrekombinowanego wektora poddajemy transkrypcji w komórkach E. Coli. Będziemy wyszukiwali na szalce z agarem fragmetów DNA odpornych na ten antybiotyk. Wyjmujemy komórki z probówki i namnażamy. W plazmidzie możemy wprowadzić DNA o wielkości 10 kpz (klonować można duże fragmęty DNA).Wyszukiwanie ważnych koloni np.. PUC 18 (w 2 genie jest wielokrotne miejsce klonowania). W genie kodujacym jest miejsce wielokrotnego klonowania klonowania. Fragmęty mające takie cięcie mogą być włączone. Niektóre miejsca klonowania są rozpoznawalne przez 2,3 różne enzymy. Degradacja miejsc klonowania- rozcinanie. Jeżeli komórki są niebieskie w agarze to nie wprowadzamy genu, złe komórki plazmidu, komórki zrekombinowane

Fagi

Jeżeli do fagów wprowadzimy DNA, to po kilku godz. Inkubacji tworzą się łańcuchy fagowe, komórki nie zakażone przez faga normalnie rosną. Widzimy ich kolonie. Metoda znajdowania komórek ze zrekombinowanym DNA (wprowadzonym). Inne cząsteczki przyjmujące DNA-wektory fagowe. Fag posiada ogonek i kapsyd białkowy (aby chronić DNA), Fag α składa się z materiału genetycznego. Jego60% jest ważne dla funkcjonowania fagu, a 40% można usunąć i ustawić inne a on będzie dalej się rozwijał. Tym fagiem zarażamy komórki E. Coli. Na komórkach są receptory rozpoznawalne przez ogonek faga. Jak znajdzie receptor pasujący na końcu ogonka ma dokładnie pasujące zakończenie do receptora.Łączą się duże części i DNA wpływa na kom. E. Coli (zainfekowane E. Coli). Wysiewamy ją na agar a na nim są zwykłe komórki bakteryjne niezmienione. Gdy posiejemy zainfekowane to on rozbija tę komórkę i rozpryskuje się na inne zakażając je i dając łysinki. Przy pomocy fagów można wprowadzać 25 kpz

Kosmoidy i sztuczne chromosomy drożdżowe

Z połączenia plazmidów i fagów powstają kosmidy ( III rodzaj wektorów). W DNA plazmidowe są sekwencje DNA nazwane COS umożliwiają pakowanie do fagów. W kosmidach można klonować do 45 kpz

5. Metody do transgenezy:

do linii komórek zarodkowych - bezpośrednia mikroiniekcja roztworu DNA (transgenu) do przedjądrza męskiego zapłodnionego jaja.
Wstrzykiwanie genów tzw. biobalistyka, ale 50 razy mniejsza integracja genów w porównaniu do mikroiniekcji.
Lipofekcje (rodzaj wektora, modyfikatory)
Elektroporacja (parametry pola elektrycznego, pożywka, stężony DNA).
Użycie tzw. wektorów, wlókien retrowirusowych (odonowirusy, retrowirusy, latinowirusy)
Mikrotrekcja fragmentów chromosowych
Użycie komórek plurepotentnych lub pierwotnych komórek zarodkowych (ESC) - wprowadzenie do nich informacji genetycznej, hodowla in vitro i odtwarzanie zarodka.

Inne techniki:

Priching - nakłuwanie blastocyty w środowisku o wysokim stężeniu DNA
Jet - gen - strzykawką np. do gruczołu mlekowego
Fiber shaking - włókna glikonowe, spłaszczone DNA, wytrząsane razem z zarodkami.

Wstrzykujemy kilkaset kopii genu do zarodka ssaków.

6.Trudności badań transgenezy

-zmniejszenie bioróżnorodności

- mała akceptacja produktów biotechnologicznych

-akceptacja przez niektóre kraje

-znakowanie

-klonowanie

-szybszy postęp hodowlany

Zagrożenia GMO:

-alergeny niestrawne odporne na obróbke techniczną

-toksyny bakteryjne (powodujące np. odwodnienie paraliż)

-antyżywieniowe(inhibitory proteaz)

Zestaw II

1. Budowa chromatyny i chromosomu eukariotycznego

STRUKTURA CHROMATYNY

Każdy chromosom Eukarioty ma długą cząsteczkę DNA, która mieścić się w jądrze.

Histony→ główny składnik białkowy chromatyny, małe białka zasadowe, dodatnio naładowane o wielkości 10 - 20 kD. Wiążą się silnie z DNA, wyróżniamy 4 rodzaje tych białek : H1, H2, H3, H4

Nukleosomy → białkowy oktomer + owinietego lewoskrętnie DNA 1,8 razy ( 146 par zasad). DNA jest chroniony przez białko. H1 wiąże dodatkowo 20 par zasad.

2:1 = oktomer histonów H1

może być białko H5, to nukleosom jest bardzo trwale związany → nie da się go zniszczyć → gen nie może ulec transkrypcji.

ocznikowy DNA → między rdzeniami, nukleosomów waha się od 10 do ponad 100 pz. Nukleosomy są złożone we włókno, 8 par nukleosomów to selenid.

Struktura chromosomu eukariotycznego:

Chromosom mitotyczny . Siostrzane chromatyny w mitozie reprezentuje najsilniej skondensowane stadium chromatyny. Chromosom składa się z centromeru i telomeru na końcu chromatyd.

Centromer, nukleotydy, u ssaków są to sekwencje nie kodujące, satelitarne DNA. U ssaków w tej części jest dużo mikrosateliltarnych sekwencji (ok. 88 par zasad).

Telomery- ulegają skracaniu podczas podziału kolejnych komórek. Podczas replikacji pierwsze nukleotydy skracają się . Są nukleotydy jak :

5'-TTAGGG-3' (setki kopii) Przy pierwszym podziale odpada pierwsza kopia ale zostaje jeszcze druga.

Chromosom mitotyczny-klasyczny obraz pary siostrzanych chromatyd w mitozie reprezentuje najsilniej skondensowane stadium chromatyny. Chromosom w mitozie składa się z centromeru telomeru i właściwego chromosomu. 88 par zasad, zawierają pętle włókien 20nm-chromatyny.

Telomery są to końce liniowego chromosomowego DNA przed degradacją i stopniowym skracaniem są zabezpieczone przez enzym telomerazę w procesie niezależnym od zwykłej replikacji DNA. W interfazie chromatyny bardziej rozproszono.

Chromosom interfazowy- w interfazie chromosomy przyjmują strukturę bardziej rozproszoną mimo, że pętle chromosomowe pozostają przyłączone do matriks jądrowej.

Heterochromatyna - część chromatyny w interfazie nie może być przepisana na białko bo jest nieaktywna, składa się z:

Eurochromatyna- najbardziej rozproszony region chromosomu interfazowego. Składa się z rejonów aktywnych aktywnych nieaktywnych

Aktywna część eorochromatyny stanowi 10% materiału genetycznego genetycznego jest transkrybowana;

Nieaktywna część eurochromatyny -jest bardzo dużo wysp GC, wyspy te są metylowane stąd ta eurochromatyna nie jest aktywna w tych częściach.

Cześć aktywna -są tu wyspy CG, liczą one około 2000 pz i nie są metylowane, nie są zabezpieczone, następuje transkrypcja aktywna. Aktywne części są wrażliwe na DNazę

2. I Operon lac - laktazowy - jednostka prokariotycznej jednostki genu, który zawiera promotor i operator laktozowy, gen kodujący lak I, gen kodujący acetylazę - on działa, gen lak I - nieczynny jak jest monomeryczne. Tetrametr jest aktywny, wielkie powinowadztwo do operatora lac. On siedzi na tym białku i gen jest nieczynny. Gdy włożymy E. coli do roztworu laktozy. Mimo to gen jest nieczynny to zawsze jest 1 lub 2 cząsteczki zsyntetyzowane.

3. Genomy wirusów:

jednoniciowe
dwuniciowe - DNA lub RNA

pozytywne - nić jednoniciowa zarazem
negatywne - matryca do białka w komórce gospodarza jest syntetyzowana nić pozytywna, która jest matrycą
mieszane(ambisensowne) - genom kulisty lub otwarty (jednoniciowy), nieprzerwane lub segmentowane

DNA - z genami nakładającymi się od 1kz do

DNA WIRUSY-Genomy wirusów DNA mogą być dwu- lub jednoniciowe. Większość eukariotycznych wirusów DNA ulega replikacji w jądrze komórkowym gospodarza i wykorzystuje aparat replikacji, transkrypcji, a także translacji komórki gospodarza. Duże wirusy dsDNA często charakteryzują się złożonym cyklem życiowym, w tym kontrolą procesów transkrypcji, translacji i replikacji w czasie, zarówno własnych, jak i gospodarza. Wirusy o małych genomach DNA mogą być bardziej zależne od replikacji komórki gospodarza

RNA WIRUSY- Wirusowe genomy RNA mogą być jedno- lub dwuniciowe, pozytywne lub negatywne, a replikacja może być regulowana z wykorzystaniem wielu różnych mechanizmów. Jednakże genomy te wszystkie zależą od kodowanych przez wirusy polimeraz RNA zależnych od matrycy RNA. Polimerazy te popełniają więcej błędów podczas przepisywania sekwenqi RNA na komplementarny RNA niż plimerazy zależne od DNA. Znacząco wpływa to na ewolucję wirusów RNA przez zwiększenie ich zdolności adaptacyjnych, a zarazem ogranicza ich wielkość. Retrowirusy mają diploidalne genomy w postaci nici RNA i replikują przez produkt pośredni, jakim jest dsDNA. Ten produkt pośredni, nazwany prowirusem, zostaje wbudowany do genomu komórki gospodarza. Retrowirusy mają cechy eukariotycznych transpozonów, takich jak drożdżowe elementy Ty.

4. Metody transgenezy

do linii komórek zarodkowych - bezpośrednia mikroiniekcja roztworu DNA (transgenu) do przedjądrza męskiego zapłodnionego jaja.
Wstrzykiwanie genów tzw. biobalistyka, ale 50 razy mniejsza integracja genów w porównaniu do mikroiniekcji.
Lipofekcje (rodzaj wektora, modyfikatory)
Elektroporacja (parametry pola elektrycznego, pożywka, stężony DNA).
Użycie tzw. wektorów, wlókien retrowirusowych (odonowirusy, retrowirusy, latinowirusy)
Mikrotrekcja fragmentów chromosowych
Użycie komórek plurepotentnych lub pierwotnych komórek zarodkowych (ESC) - wprowadzenie do nich informacji genetycznej, hodowla in vitro i odtwarzanie zarodka.

Inne techniki:

Priching - nakłuwanie blastocyty w środowisku o wysokim stężeniu DNA
Jet - gen - strzykawką np. do gruczołu mlekowego
Fiber shaking - włókna glikonowe, spłaszczone DNA, wytrząsane razem z zarodkami.

Wstrzykujemy kilkaset kopii genu do zarodka ssaków.

5.Trudności badań transgenezy

-zmniejszenie bioróżnorodności

- mała akceptacja produktów biotechnologicznych

-akceptacja przez niektóre kraje

-znakowanie

-klonowanie

-szybszy postęp hodowlany

Zagrożenia GMO:

-alergeny niestrawne odporne na obróbke techniczną

-toksyny bakteryjne (powodujące np. odwodnienie paraliż)

-antyżywieniowe(inhibitory proteaz)

Zestaw III

1. Geny reporterowe

Dzielą się na 2 kategorie:

W efekcie dają produkt barwny swojego działania

Najczęściej spotykane geny.

Lac Z

Zbudowany z plazmidu PCH, Zawiera promotor, który go będzie włączał.

Promotory wirusowe - natychmiast można uchwycić czy gen będzie działał czy nie

Wektor pXf3 - promotor cytomegalowirusa.

Te geny dają w efekcie, gdy β - galaktozydazę indukujemy z X - pal dają niebieskie zabarwienie.

Dają luminescencje, chimiluminescencje, fluorescencje. Nie musimy nic dodawać do produktu genu, aby zbadać jego obecność.

Gen białka zieloności

PCX - PFP

β - aktyny

Wzmacniacz pochodzący z wirusów

2. Rodzaje PCR

Rodzaje PCR RAPD - PCR - polega na amplifikacji przypadkowo wybranych fragmentów genomu dzięki zastosowaniu krótkich starterów 10 nukleotydowych. Elektroforetyczny obraz prążków jest charakterystyczny dla tego osobnika.

Ht - PCR - PCR połączona z odwrotną transkrypcją, czyli materiałem wyjściowym do namnażania jest mRNA, a nie DNA. Zazębiona PCR - umożliwia zamplifikowanie odcinka DNA zawartego w większym uprzednio namnażanym fragmencie.

PCR in situ - przeprowadzenie reakcji w tkance bez naruszenia jej struktury

PCR ilościowa - za pomocą pomiaru intensywności reakcji barwnych jesteśmy w stanie zmierzyć po określonej liczbie cykli ilość powstałego produktu.

Zastosowanie PCR

-amplifikacja sekwencji DNA

-diagnostyka chorób dziedzicznych

-ustalenie Ojcostwa w sądownictwie

-ustalenie pochodzenia śladów krwi

-namnażanie DNA z mumii egipskich

-wykrywanie we krwi wirusów np.HIV

-PCR do otrzymywania klonów genomowych.

3. Omów syntezę białka w komórkach prokariotycznych

Mechanizm syntezy białka:

1. Inicjacja

2 Elongacja

3 Terminacja

Ad1.Polimeraza RNA jest enzymem odpowiedzialnym za transkrypcję . Aby zainicjować syntezę RNA, wiąże się ona ze specyficznymi sekwencjami DNA zwanymi promotorami.

Aby mół nastąpić początek syntezy białka musi uczestniczyc podjednostka 30 S

W komórkach prokario. Musi bybć wolna część rybosomu 30S , trzy jednostki inicjujące oraz GTP(energoczynny czynnik). Trzy czynniki łączą się z 30S.

Aktywowane białko 30S , mRNA i tRNA na małym rybosomie to kompleks inicjujący 30 S. Dopiero gdy podłączy się duża jednostka to ujawnia się miejsce peptydowe, a następnie miejsce aminokwasowe. GTP rozdziela się na difosforyi 1 -fosfor, powstaje energia i kompleks inicjujący 70S .

Ad2. powstawanie jednego wiązania peptydowego. Następny aminokwas jest aktywny. GTP z białkiem EF_Tw. Aktywują kompleks aminokwasów tym białkiem.

Tworzenie wiązanie peptydowego przy pomocy peptydylotransferazy , cały……… przenosi się na miejsceaminokwasu. Dzięki energii GTP przemieszcza się peptydylotra. tRNA z miejsca A do miejsca P.

Ad. 3 Terminacja syntezy białka u prokariota przychodzi kodon stop .Aby nastąpiła terminacja musza być 2 czynniki uwalniające (rozpoznaje różne kodony stop)

Prokariota : kilka czynników inicjacji, taka sama elongacja jak u eukar., trzy etapy terminacji

Elongacja u prokariota i eukaroiota jest prawie taka sama różni się tylko czynnikami

Treminacja odbywa się tylko za pomocą bialka erF rozpoczynają 3 kodony wymaga tez GTP.

4. Sondy molekularne

1) Nick translation- używamy tej samej polimerazy co przy PCR starter nacina sondę, odrywa grupy oh od końca 3', usuwa nukleotydy (zasada+cukier+fosforan) i dodaje znaczony nukleotyd fosforem 32 P32. Zaczyna syntetyzować 2)Romdon primer(metoda wydłuzania starterów) syntetyzuje z radioaktywnych nukleotydów nową nić DNA. Dosyntetyzowane nukleotydy znaczone są fosforem P32

5. Budowa DNA i chromosomu eukariotycznego

ZASADY- W DNA występują cztery heterocykliczne zasady: adenina (A) i guanina (C.) oraz cytozyna (C) i tymina (T). Adenina i guanina są purynami, a cytozyna i tymina pirymidynami.

MODYFIKOWANE KWASY NUKLEINOWE-DNA występuje przeważnie w postaci dwuniciowej hielisy. Dwa oddzielne i antyrównolegle łańcuchy DNA są okręcone wokół siebie prawoskięlnie w sposób helikalny lak, że rdzeń cukrowo-fosforanowy znajduje się na zewnątrz, a sparowane wiązaniami wodorowymi i zasocjowane warstwowo zasady znajdują się wewnątrz- Adenina tworzy pary z tyminą, a guanina z cytozyną.

CHROMOSOM EUKAR.

CHROMOSOM MIOTYCZNY- Klasyczny obraz pary siostrzanych chromatyd w mitozie reprezentuje najsilniej skondensowane stadium chromatyny. Liniowy DNA biegnie pojedynczą ścieżką od jednego końca chromosomu do drugiego, w kolejnych pętlach włókien 30 nm, dochodzących do 100 kpz, zakotwiczonych w rdzeniu matriks jądrowej CENTROMETR-Centromer jest to region, w którym łączą się dwie siostrzane chromatydy oraz miejsce, w którym przyłącza się, poprzez kinetochor wrzeciono mitotyczne, rozdzielające chromatydy w anafazie. Centromery cechują specyficzne, krótkie sekwencje DNA, a w komórkach ssaków może tu występować satelitarny DNA. TELOMERY- Końce liniowego, chromosomowego DNA przed degradacją i stopniowym skracaniem są zabezpieczone przez telomery, które są wielokrotnie powtórzonymi, krótkimi sekwencjami, syntetyzowanyrr przez swoisty enzym, telomerazę, w procesie niezależnym od zwykłe replikacji DNA. HETEROCHROMATYNA_-Heterochromatyna jest częścią chromatyny w interfazie, która pozostaje raczej skondensowana i jest transkrypcyjnie nieaktywna. EUCHROMATYNA- Euchromatyna jest najbardziej rozproszonym regionem chromosomu interfazowego. Składa się z obszarów nieaktywnych, występujących w postaci włókien 30 nm oraz regionów aktywnie transkrybowanych, w których włókna 30 nm są zdysocjowane, a pojedyncze nukleosomy mogą być zastępowane przez białka inicjujące transkrypcję.

6. W jakim celu i gdzie stosuje się bioreaktory. Omów budowę gruczołu mlekowego.

Bioreaktory

Te zwierzęta, które produkują białka w organach swojego ciała (najlepsze miejsce - mleko, krew, mocz). We krwi - albuminy, hemoglobiny, wszystkie białka związane z krzepliwością krwi i przeciwciała. Mocz - w nim nie powinno być żadnych białek. Kroplaleina I i II w nerkach. Promotor Uro II jest używany aby kierować ekspresję białka do pęcherza moczowego. 1 transgen zwierzęcy - KERR (1998). Otrzymał hormon wzrostu w moczu. Nie ma znaczenia płeć i wiek. Jeżeli chcemy oczyszczać to białko od innych (metoda chromatografii), z moczu b. łatwo, bo nie powinno być w nim białka.

Zapotrzebowanie na związanie produktów przez bioreaktory:

farmaceutyki (największe zapotrzebowanie)
enzymy, detergenty
enzymy spożywcze
zboża o zmienionych cechach jakościowo
produkty wykorzystujące wiedzę o ludzkim genomie

Skład białek mleka przeżuwaczy, królika i człowieka. Żeby białka uzyskać musimy uzyskać promotory genów białek, które dane zwierzę posiada.

Cele biotechnologii w gruczole mlekowym

Wytwarzanie ludzkich białek leczniczych w mleku transgenicznym zwierząt gospodarskich (farmaceutyki)
Zwiększona stabilność mleka w podwyższonej temp. (wprowadzanie dodatkowych genów białek mleka np. kazeiny)
poprawa jakości produktów spożywczych wytwarzanych z mleka
zwiększenie jędrności strątu kazeinowego
przyspieszenie dojrzewania serów
zwiększenie trwałości zawiesiny koloidowej kazein mleka
poprawa właściwości odżywczych mleka

3) Produkcja zdrowego, mniej tłustego mleka, obniżenie kosztów produkcji mleka

4) Zmniejszenie zapadalności krów na mastitis (choroba wymion), ochrona potomstwa przed zakażeniem przewodu pokarmowego, zwiększenie absorpcji żelaza

5) Eliminacja kryształków lodu i strątów laktozy (poprawa jakości lodów, zmiana właściwości osmotycznych mleka). Możliwość spożywania mleka przez ludzi nietolerujących laktozy

inaktywacja lub zahamowanie ekspresji genu α-laktoalbuminy

6) Humanizacja mleka przeżuwaczy

Przyszłość w produkcji (biofarmaceutyki w generacji)

przeciwciała
pewne składniki produktów spożywczych
hormony
substancje odpornościowe
odżywki
szczepionki

Zestaw IV

1. Klonowanie i geny

Klonowanie genów ma zastosowanie do wytwarzania zrekombinowanego białka, genetycznie zmodyfikowanych organizmów, „odcisku DNA" charakterystycznego jako odcisk palca, przygotowania zestawów
diagnostycznych oraz w terapii genowej

Charakterystyka klonu polega na określeniu różnych właściwości
zrekombinowanej cząsteczki DNA, takich jak: wielkość, mapa
restrykcyjna, obecność jakiegokolwiek genu oraz znajomość sekwencji nukleotydowej.

2. Kod genetyczny uniwersalność mutacje.

Mianem kodu genetycznego definiujemy procesy, w których sekwencja nukleotydowa zawarta w kwasach nukleinowych determinuje sekwencję aminokwasów w białku. Kod jest trójkowy, a kodony (trójki nukleotydów) odczytywane są kolejno (nie nachodzą na siebie) i nie są oddzielone żadnymi przerywnikami (kod jest bezprzecinkowy). Ze względu na to, że wiele spośród 64 kodonów oznacza ten sam aminokwas, kod genetyczny jest zdegenerowany (wieloznaczny). Standardowy kod genetyczny został rozszyfrowany poprzez dodawanie homopolimerów, kopolimerów lub syntetycznych trójek nukleotydowych do ekstraktu komórkowego zawierającego aktywny układ translacyjny. Wykazano, że 61 trójek koduje 20 aminokwasów oraz że obecne są trzy kodony stop. Osiemnaście z 20 aminokwasów jest kodowanych przez więcej niż jeden kodon (kodony synonimiczne), te zaś są zgrupowane razem w tabeli kodu genetycznego. Zazwyczaj różnią się one jedynie w trzeciej pozycji kodonu. Jeśli w tej pozycji znajduje się pirymidyna, to kodony zawsze oznaczają ten sam aminokwas. Jeśli jest w tej pozycji puryna, to zazwyczaj jest tak samo. Obecność kodonów synonim icznych powoduje, że efekty pojawienia się mutacji są zminimalizowane. Tranzycje w trzeciej pozycji kodonu zazwyczaj nie zmieniają sensu kodu. Transwersje w więcej niż połowie przypadków również nie zmieniają sensu kodu. Mutacje w pierwszej i drugiej pozycji kodonu często powodują zamianę na aminokwas podobny chemicznie. Do niedawna uważano, że standardowy kod genetyczny jest
uniwersalny. Pewne odstępstwa obserwuje się jednak w kodzie genetycznym mitochondriów i niektórych organizmów jednokomórkowych. Otwarte ramki odczytu (ORFto rejony, które potencjalnie kodują białko. W sekwencji DNA identyfikuje się ciąg kodonów zaczynający się kodonem start i kończący się kodonem stop. Zazwyczaj sekwencje te identyfikuje się stosując komputerową analizę zsekwencjonowanego DNA.

3. Jak się wykrywa białka.

. oczyszczanie białek: białko oczyszcza się z surowego ekstraktu komórkowego stosując kombinację technik rozdzielających białka według różnych ich właściwości. Techniki: chromatografia jonowymienna (pozwala rozdzielić białka wykorzystując ich różny wypadkowy ładunek elektryczny), powinowactwa (polega na specyficznym oddziaływaniu enzymu, receptora z ligandem, nadekspresja białek(wyraznie zwiększa oczyszczanie białek, gen danego białka wprowadzany do komórki E. coli , który produkuje w nadmiarze te bialko), wprowadzanie dodatkowej „metki” do białka ulegającego nadekspresji ipowoduje redukcje procesu izolacji tego białka)

4. Terapia genowa- jakie są geny które usuwają nowotwory.

Terapia genowa- wprowadzanie nowej metody leczenia chorób genetycznych-terapii genowej.jeżeli jakaś choroba wynika z uszkodzenia jednego z genów, tak że gen ten nie ulega ekspresji tzn. nie działa, to można chory zastąpić zdrowym genem, gen musi być dostarczany w odpowiedni sposób musi podlegać ekspresji w danej tkance, a ekspresja powinna być na odpowiednim poziomie. Z obecnie stosowanych terapii genowych wiąże się dość wysokie ryzyko gwałtownej reakcji układu odpornościowego na wirusy, za których pośrednictwem zdrowy gen jest podawany do organizmu. Somatyczne terapie genowe- poprzedzona: sklonowaniem odpowiedniego genu, identyfikacja sekwencji rybonukleinowej, identyfikacja komórek w których działa, wyboru wygodnych metod transfelacji, sprawdzenia jego prawdziwego działania, sprawdzenie czy nie narusza metabolizmu komórki i całego organizmu.

zmieniają aktywność W leczeniu onkogenów dąży się do swoistego zniszczenia i wyeliminowania komórek nawt z organizmu. Dokonuje się tego przy pomocy: 1. geny samobójcze- enzym hodowany przez terapeutyczny gen umożliwia przekształcania nieaktywnych związków chemicznych w substancje prowadzące do śmierci komórek lub do uczulenia komórek na chemoterapię lub radioterapię - gen tymidowy wirusa opryszczki 2. geny immunomudulacyjne -układu odpornościowego. Białka hodowane przez te geny pośredniczą w eliminacji komórek nowotworowych przez bezpośrednie zasobu komórek lub pobudzanie limfocytów np. wprowadzanie do chorych komórek genów cytolin czy GM-CSF.3. geny antyantogenne - hamują wzrost naczyń krwionośnych w guzie. Hamowanie komórkowych sygnałow pobudzających wzrost nowych naczyń krwionośnych. 4. geny proapoptyczne- pobudzają śmierć komórek na drodze apoptyzy. W komórkach nowotworów dochodzi do zaburzeń procesu apoptezy zjawiska eliminującego uszkodzenia komórek, a produkcja przeciwciał monoklonalnych:-izoluje się komórki śledziony myszy immunizowanej antygenem -miesza się je ze zmutowanym antygenem [niezdolny do wzrostu na specyficznej pożywce}- fuzja komórek, powstają hybrydy komórek - selekcja na podłożu wektorów hybrydowych-hodowla potomstwa z pojedynczych komorek , taki klon hybrydonowy będzie produkował przeciwciała o podobnej specyficzności wobec pewnych antygenów wziętych do immunizacji i będzie nieśmiertelny, monoklonalne przeciwciała są w tej chwili szerok0o używane w diagnostyce infekcji i raki i szeregu i innych celów.

Zestaw V

1. Budowa i funkcje kwasów nukleinowych (mRNA, tRNA, rRNA).

1) rRNA - w rybosomach komórek występują 3 albo 4 rodzaje cząsteczek rRNA różnią się one m.in. długością w zakresie 100-400 nukleotydów. Rybosomy pełnią rolę ośrodków syntezy białka w komórkach. Powstaja one w wyniku transkrypcji odpowiednich genów rRNA, które znajdują się chromosomach.

2) tRNA - transportujący RNA , są to bardzo małe cząsteczki RNA złożone zaledwie z 70-80 nukleotuydów.Kr.ótki łańcuch tRNA jest w kilku miejscach zwinięty wokół siebie tak że pewne jego odcinki tworzą podwójny heliks oddzielony od siebie jednołańcuchowymi pętlami. Cząsteczki tRNA połączone z aminokwasami pełnią rolę transporterów, odprowadzających aminokwasy do rybosomów w których syntetyzowane są łańcuchy polipeptydowi białek 3)mRNA-matycowy RNA. Powstają one wyniku transkrypcji genów które zawierają informacje o syntezie różnych białek w komórkach mRNA jest nazywany genem strukturalnym. Bierz4e on udział w procesie translacji spełnia tu rolę matrycy z zapisem instrukcji o kolejności w wbudowywanych aminokwasów w nowo syntetyzowany łańcuch polipeptydowy

2.Aminokwasy, opisz układy makrocząsteczek w komórce

Makrocząsteczki-Białka i kw. nukleinowe, białka są polimerami aminokwasów, a kw. nukleinowe (DNA,RNA) - polimerami nukleotydów. Obydwa rodzaje tych kwasów są podstawowymi składnikami systemu, który przechowuje informacja genetyczną i powoduje ekspresję. Białka spełniają wiele zadań funkcjonalnych, strukturalnych. *Polisacharydy α-amyloza i celuloza są polimerami glukozy

(celuloza = 2 reszty glukozy połączone wiązaniami 1→4 β, wiązaniem glikozydowym→budulec główny polisacharydow)

Skrobia - składa się z wielu zw., wiązań α (1→4 glikozydowymi)
Glikogen - rozgałęzione cząsteczki α-amylozy, najwięcej go w wątrobie
Hityny - w ściankach najczęściej insektów, hityna zawiera acetylwaną resztę
Mukopolisacharyd - zawierają reszty cukrowe, powiązanie z cukrami
Glikoproteiny =białko + grupy oligocukrowe

Lipidy, triglicerydy zawierająca nasycone kwasy tłuszczowe, nienasycone, fosforany. Fosfolipidy ofingolipidy oprócz kwasów tłuszczowych zawierają grupy polarne i budują błony komórkowe. W błonach komórkowych są białka peryferyjne i integralne.

Proteoglikan = białko + cukier, często są w ścianach komórkowych
Nukleoproteiny = kw. nukleinowe + białka (np. rybonukleazy)
Lipoproteiny = białko + tłuszcz

3. Podział na 4 grupy badań nad zwierzętami trasgenicznymi - co to jest transgeneza autogeniczna i alogeniczna

Doświadczenia na zwierzętach transgenicznych podzielono na 4 kategorie:

1) Badania regulacji genów odnoszą się do badań ekspresji elementów regulatorowych genów (tj. promotory). Rejon promotorowy genu jest połączony z genem reporterowym (łatwo wykrywany). W analizie elementów regulatorowych do tkankowo specyficznej ekspresji identyfikacji czynników cis, kontrolujących transkrypcję genów.

Badanie funkcji produktu genu. Gen badany pod kontrolą albo homologicznego promotora albo heterogenicznego, który kieruje ekspresję genu do specyficznych komórek lub tkanek.
Badanie in vivo konstruktów genowych na komórkach „nieśmiertelnych” (uzyskane przez fuzję rejonu promotora SV 40 do antygenu komórek T lub wprowadzenie EBV do limfocytów B). Nieśmiertelne komórki są wtedy używane do prowadzenia badań in vivo.
Bioreaktory - ekspresja białek w gruczole mlecznym, moczu lub we krwi transkrybowanych zwierząt, w celu otrzymania dużej ilości białek powstałych na osnowie transgenu w płynach ustrojowych ssaków.

Autotransgeniczny - określenie przypadku kiedy komórka dawcy i biorcy należą do tego samego gatunku i gdzie wszystkie używane konstrukty pochodzą od tego samego gatunku.

Allotransgeniczny - transferowany i zintegrowany DNA pochodzą w części lub w całości od różnych gatunków

4. Metody klonowania, jakich komórek się używa i ich użycie w terapii genowej.

KLONOWANIE:

gen z jednego organizmu jest ustawiony do genomu drugiego organizmu, roślina np. nabiera właściwości odporności ma gnicie, ryż z prowitaminą A;
jądro komórkowe zawierające kompletne genomowe DNA, jest przeniesione z tkankowej do małej komórki, z której własne zostało usunięte- geny potomstwa pochodzą od jednego osobnika, czyli jest jego identyczną kopią.

Klonem nazywamy potomstwo jednego osobnika rozradzającego się bezpłciowo, a zatem genetycznie identyczne zarówno wzajemnie jak i z macierzystym osobnikiem.

Klonowanie- metoda otrzymywania klonów, a więc zbioru organizmów identycznych pod względem genetycznym z organizmami rozmnażającymi się wyłącznie płciowo.

Rodzaje komórek używanych w pracach nad klonowaniem. komórka potipotentna- komórka pnia ma zdolność i potencję do rozwoju wszystkich komórek łączną z komórkami zarodkowymi. komórka pluripotentna-może tworzyć tylko pewien rodzaj komórek o określonej linii komórkowej nie mają zdolności do tworzenia komórek potomnych.

5. Wirusy (bakteriofagi) to nie są organizmy, to są zlepki makrocząsteczek. To są pasożyty, zlepki DNA i białka, które w pewnych warunkach, przy wykorzystaniu aparatu gospodarza zaczynają żyć. Wiriony - to samo co wirusy, świeżo zsyntetyzowane w komórce gospodarza. Składają się z kwasu nukleinowego i kapsydu białkowego (otoczka). Wirusy różnego rodzaju kształtu.

Klasa ikozaedralna - 21 ścian tego wirusa, składa się ona z białka, a w środku jest DNA.

Klasa helikalna - struktura prosta, pałeczkowata. W środku kwas nukleinowy, na zewnątrz kapsyd.

Wirus mozaiki tytoniowej -252 kapsydy białkowe.

Może być jeszcze jedna otoczka.

Matrix - białka utrzymujące w pewnej odległości otoczkę od kapsydu. Do otoczki nie ma genów w wirusie.

Jak wirus wydobywa się z lizowanej komórki, to porywa na otoczkę materiał ze ściany komórki, w której się namnażał.

Na otoczce lub kapsydzie glikoproteiny. Rozpoznawcze znaki komórki, do której mogą wejść. Receptory rozpoznające komórkę, którą będą zakażały.

Białka niestrukturalne - np. enzymy lub te białka mogą tworzyć receptory np. glikoproteidy.

Genomy wirusów:

jednoniciowe
dwuniciowe - DNA lub RNA

pozytywne - nić jednoniciowa zarazem
negatywne - matryca do białka w komórce gospodarza jest syntetyzowana nić pozytywna, która jest matrycą
mieszane(ambisensowne) - genom kulisty lub otwarty (jednoniciowy), nieprzerwane lub segmentowane

DNA - z genami nakładającymi się od 1kz do 300kz (wielkości)Strategie replikacji wirusów

Wirusy wykorzystują polimerazy DNA komórki gospodarza. Głównie DNA wirusy. RNA wirusy wymagają do replikacji samodzielnie kodowanych polimeraz RNA. Niektóre wirusy wykorzystują polimerazę DNA zależną od matrycy RNA (odwrotna transkryptaza).

Komórki w których replikacja następuje (danego wirusa) nazywają się permisywne. Inne komórki dla tego wirusa są niepermisywne.

Wirulencje wirusów - wiele z nich nie wywołuje chorób. Wirus jest po to, aby się sam replikował, przy okazji nas zakaża. Nie jest funkcją wirusa nas zakażać. Wywołanie choroby - wirulencja.

Bakteriofag α

Genom liniowy, nie zamknięty, większy 48,5 kpz. Koduje białka z główki ogonek. Posiada gen natychmiastowej transkrypcji, później i opóźniony promotor działający w lewą i prawą stronę. Wczesne geny są po to aby uaktywnić samego siebie do powielania. Część białek powstających z tych genów są cięte i uwalniają geny opóźnionej trakskrypcji (ich aktywatory). Na końcu syntetyzują się geny późne, przyczyniają się do składania trwalszej formy bakteriofaga.

Sekwencja cos (do tworzenia kosmidów) - wektorów przenoszących duże fragmenty DNA. Może przechodzić w komórke gospodarza z fazy litycznej i lizogenicznej, zależy od warunków panujących na zewnątrz i wewnątrz komórki gospodarza.

Infekcja lizogeniczna - może utrzymywać się przez wiele pokoleń.

Bakteriofagi są cząstkami infekującymi bakterie. Chociaż niektóre z fagów mają małe genomy i prosty cykl życiowy, inne charakteryzują się dużymi genomami oraz złożonym cyklem życiowym angażującym regulacje metabolizmu zarówno wirusowego, jak i komórki gospodarza. W wyniku infekcji litycznej wiriony są uwalniane z komórek przez liżę. Jednakże podczas infekcji lizogenicznej genomy wirusów integrują z genomami komórek gospodarzy i mogą być stabilnie dziedziczone przez kilka pokoleń przed powrotem do infekcji litycznej.

Bakteriofag M13 ma mały, jednoniciowy genom DNA, ulegający replikacji przez dwuniciową replikatywną, zdolną do replikacji formę DNA. Bakteriofagi mogą infekować komórki bez wywoływania lizy. Zmodyfikowany fag M13 często jest wykorzystywany jako wektor do klonowania fragmentów DNA. Niektóre fagi, na przykład bakteriofag Mu, normalnie ulegają integracji z DNA komórek gospodarza i replikują przez transpozycję replikacyjną

6. Onkogeny

Rak - powstaje w wyniku mutacji powodujących zniszczenie mechanizmów kontrolnych regulujących prawidłowy wzrost komórek. Wzrost komórki prawidłowej jest kontrolowany przez wiele różnych współdziałających ze sobą organizmów.

Onkogeny - geny, których nadaktywność prowadzi do przekształcania komórek normalnych w komórki nowotworowe. Działanie onkogenów w komórce polega na jego dominacji nad niezmutowaną, prawidłową wersją genu.

Retrowirusy onkogenne - onkogeny wyizolowano po raz pierwszy z onkogennych retrowirusów. Powielają się w komórce gospodarza przez prowirus (dsDNA).

Izolacja onkogenów

Komórki NIH - 3T3 na szalce Petriego rozkładają się płasko. Bierzemy roztwór badanego DNA w buforze fosforanowym. Dodanie Ca²⁺. Dodajemy do komórki. Jeśli to białko wejdzie to te komórki będą inaczej rosły i będą tworzyły guzki.

Zalety:

mamy czystą linię komórkową, nie pracujemy z całym zwinięciem
wyniki otrzymuje się szybciej
komórki NIH - 3T3 bardzo dobrze pobierają i poddają ekspresji obcy DNA
metoda techniczna bardzo prosta

Wady:

niektóre onkogeny mogą być specyficzne dla określonych typów komórek
duże geny mogą ulec zagubieniu
komórki NIH - 3T3 - są komórkami specyficznej linii, nie są w pełni „normalne” , mogą więc zostać pominięte geny zaangażowane we wczesnym stadium karcynogenezy
transfekowane geny działają w sposób dominujący, dlatego nie pozwala na wykrycie genów w supresji nowotworowej

Działanie genów

Mechanizm - w normalnym genomie - gen interleukiny 2 (int-2). Poziom produkcji jest wystarczający. Gdy prowirus retrowirusa przyłączy się do genomu to następuje zwiększenie produkcji int-2. Komórka zaczyna się dzielić.
Prawidłowa forma jest aktywna w przypadku przyłączenia czynnika wzrostu. Działa on okresowo. Gdy przyłączy się do receptora, podciąga go, kinazy powodują działanie genu.

ErBb - nie ma miejsca do przyłączenia czynnika wzrostu. Receptor działa w sposób ciągły. Ciągle daje sygnał - dziel się.

Rodzaje onkogenów

onkogeny czynniki wzrostu

CSF 1 - reszta tyrozynowa - niezbędna do inaktywacji receptora. Mutacja w genie, brak tyrozyny, białko zaczyna działać w nieprawidłowy sposób. Receptor działa cały czas

Gen ras - jeśli jest zmutowany to jest zamknięty szlak inaktywacji przez pretepazę. Cały czas działa cykl.

onkogeny jądrowe

gen fos, junk, evb A - w wyniku zakłócenia prawidłowości. Jeśli mamy gen w komórce. Gen fos zmutowany to daje zmutowane białko FOS, przyłączy się do DNA. Dużo jest takich białek.

Współdziałanie onkogenów

Musi działać kaskada onkogenów. Połączenie genów.

Geny supresorowe transformacji nowotworowej

Mutacje w genach supresji transformacji nowotworowej powodują utratę ich funkcji i przekształcenie komórek normalnych w komórki nowotworowe.

Gen p53 - 50% wszystkich zmian rakowych u człowieka (pierwsza definicja o tym genie)

Zestaw VI

1. Złożoność genomu i sekwencje unikatowe* DNA NIE KODUJĄCY-

W komórkach eukariotycznych duża część DNA nie koduje białek; większość genów zawiera długie sekwencje intronowe, a geny lub zespoły genów są oddzielone długimi odcinkami sekwencji o nieznanej funkcji. Duża część nie kodującego DNA składa się z sekwencji -wielokrotnie powtórzonych, czasami są to tysiące lub setki tysięcy kopii kilku stosunkowo krótkich elementów sekwencji.

KINETYKA REASOCJACJI- Technika ta pozwala na zidentyfikowanie różnych klas powtórzonych sekwencji DNA. UNIKATOWE SEKWENCJE DNA- Sekwencje unikatowe to frakcja DNA, która reasocjuje najwolniej i składa się głównie z genów występujących w pojedynczych kopiach lub powtarzających się niewielką liczbę razy.

TANDEMOWE ZESPOŁY GENÓW- Część umiarkowanie powtarzającego się DNA stanowią regiony genomu, w których pewne geny lub zespoły genów są tandemowo powtórzone, przy czym krotność powtórzeń sięga setek razy. ROZPROSZONE SEKWENCJE DNA-Większość umiarkowanie powtarzających się sekwencji DNA składa się z sekwencji DNA o długości kilkuset par zasad, powtórzonych więcej niż 100000 razy i rozproszonych po całym genomie. Np.elementy Alu i LI, które mogą być sekwencjami pasożytniczymi DNA, powielającymi się przez transpozycję.

SATELITARNY DNA- Satelitarny DNA występuje w pobliżu centromerów chromosomów i jest zaangażowany w przyłączanie wrzeciona mitotycznego; składa się z ogromnej liczby tandemowo powtórzonych, krótkich (do 30 pz) sekwencji. Duża zmienność satelitarnego DNA jest podstawą techniki „odcisku palca" DNA.

2. Właściwości fiz i chem kwas. Nukleinowych

STABILNOŚĆ KWASÓW-. Wiązania wodorowe determinują specyficzność parowania zasad, ale stabilność helisy kwasów nukleinowych jest wynikiem oddziaływań hydrofobowych i typu dipol dipol między zasocjowanymi warstwowo parami zasad.

WPŁYW ŚRODOWISKA KWASOWEGO- Silnie kwasowe warunki mogą powodować hydrolizę kwasów nukleinowych do ich składników: zasad, cukru i fosforanu. Umiarkowanie kwaśne środowisko powoduje hydrolizę wiązań glikozydowych między cukrem i zasadami purynowymi, prowadzącą do powstania kwasu apurynowego. Dla usunięcia określonej zasady DNA opracowano metodę chemiczna, która jest podstawa chemicznego sekwencjonowania

DNA.ZASADOWEGO- w pH wysokim DNA i RNA ulegają denaturacji przez zmianę tautomerycznego stanu zasad i rozerwanie specyficznych wiązań wodorowych. RNA jest również podatne na hydrolizę v wysokim pH, na skutek udziału grupy 2'-OH w hydrolizie wewnątrzcząsteczkowych wiązań fosfodiestrowych.

CHEMICZNA DENATURACJA- Niektóre związki chemiczne takie jak mocznik, czy formamid mogą denaturować DNA i RNA w pH obojętnym, przez zniszczenie sil hydrofobowych między zasocjowanymi warstwowo zasadami,

LEPKOŚĆ- DNA jest cząsteczką bardzo długą i cienką, a jego roztwory mają dużą lepkość. Długie cząsteczki DNA są łamliwe i mogą ulec rozerwaniu w roztworze. Proces ten można wykorzystać do uzyskania fragmentów DNA o określonej średniej długości.

GĘSTOŚĆ PŁAWNA- Gęstość DNA wynosi około 1,7 g-cm3

3. Metody transgenezy

do linii komórek zarodkowych - bezpośrednia mikroiniekcja roztworu DNA (transgenu) do przedjądrza męskiego zapłodnionego jaja.
Wstrzykiwanie genów tzw. biobalistyka, ale 50 razy mniejsza integracja genów w porównaniu do mikroiniekcji.
Lipofekcje (rodzaj wektora, modyfikatory)
Elektroporacja (parametry pola elektrycznego, pożywka, stężony DNA).
Użycie tzw. wektorów, wlókien retrowirusowych (odonowirusy, retrowirusy, latinowirusy)
Mikrotrekcja fragmentów chromosowych
Użycie komórek plurepotentnych lub pierwotnych komórek zarodkowych (ESC) - wprowadzenie do nich informacji genetycznej, hodowla in vitro i odtwarzanie zarodka.

Inne techniki:

Priching - nakłuwanie blastocyty w środowisku o wysokim stężeniu DNA
Jet - gen - strzykawką np. do gruczołu mlekowego
Fiber shaking - włókna glikonowe, spłaszczone DNA, wytrząsane razem z zarodkami.

Wstrzykujemy kilkaset kopii genu do zarodka ssaków.

4. Interakcje w układach makrocząsteczkowych

Większość układów makrocząsteczkowych jest rozpatrywana jako całość poprzez dużą ilość rozmaitych oddziaływań niekonwalencyjnych. Pomiędzy grupami zdolnymi do jonizacji i wykazującymi przeciwne ładunki, zachodzą oddziaływania typu : ładunek - ładunek- określane jako mostki solne. Przykładem takich oddziaływań mogą być interakcje pomiędzy ujemnie naładowanymi fosforanami DNA a dodatnio naładowanymi bocznymi łańcuchami białek wiążących DNA. Oddziaływania typu ładunek-dipol oraz dipol-dipol są słabe, powstają wtedy gdy elementy są dipolami. Niekonwencjonalne oddziaływania pomiędzy elektrycznie obojętnymi cząsteczkami - siły Van der Valsa. Dużą rolę odgrywają wiązania wodorowe, które tworzą się pomiedzy atomem wodoru kowalencyjnie związanego z grupą donorową.

5.Sondy molekularne

Zestaw VII

1. Transkrypcja u prokariota Transkrypcja jest syntezą jednoniciowego RNA na matrycy DNA. Synteza RNA przebiega w kierunku 5'-3' a jego sekwencja odpowiada sekwencji nici DNA nazywamy nicią sensowną. Inicjacja - polimeraza RNA jest enzymem odpowiedziałnym za transkrypcję, wiąże się ona z promotorami, powodując miejscowe rozplecenie DNA. Pozycja pierwszej zasady syntetyzowanego RNAnazywa się miejscem startu i oznacza się jako pozycje +1. Elongacja - polimeraza przesuwa się wzdłuż DNA i syntetyzuje łańcuch RNA (komplementarny do DNA) Odcinek DNA przed przemieszczającą się polimerazą ulega rozpleceniu i splata się ponownie za nią. Terminacja - polimeraza rozpoznaje sekwencje terminacyjną. Sekwencja ta jest zwykle strukturą spinki do włosów.

2.Transformacja- jest procesem przyjmowania przez komórkę obcego DNA — przeważnie plazmidów przez bakterię. Plazmidy klonuje się poprzez wprowadzenie ich do szczepu £'. coli o ustalonych właściwościach genetycznych. Można przygotować komórki £. Coli zdolne do przyjęcia plazmidu przez potraktowanie ich roztworem zawierającym jony Ca²*. Komórki są rozsiewane na agarze i rosną do uzyskania pojedynczych kolonii lub klonów. Komórki, które uległy transformat, określa się jako transformaty

3. Geny reporterowe

Dzielą się na 2 kategorie:

1)W efekcie dają produkt barwny swojego działania

Najczęściej spotykane geny.

Lac Z

Zbudowany z plazmidu PCH, Zawiera promotor, który go będzie włączał.

Promotory wirusowe - natychmiast można uchwycić czy gen będzie działał czy nie

Wektor pXf3 - promotor cytomegalowirusa.

Te geny dają w efekcie, gdy β - galaktozydazę indukujemy z X - pal dają niebieskie zabarwienie.

2)Dają luminescencje, chimiluminescencje, fluorescencje. Nie musimy nic dodawać do produktu genu, aby zbadać jego obecność.

Gen białka zieloności

PCX - PFP

β - aktyny

Wzmacniacz pochodzący z wirusów

Produkty genów reporterowych wykrywane są z:

genu Lac Z w całym zarodku lub w wyciągach z tkanek
genu CAT może być wykryty enzymatycznie w ekstraktach z tkanki
genu lucyferazy - jest wykrywany metodą autoradiografii z błoną fotograficzną lub metodą szyntykacyjną
białko fluoryzujące na zielono (GFP) może być wykryte w żywych organizmach po wzbudzeniu jego fluorescencji

4. Różnica pomiędzy northen i sorthen

metodą Southern.

Polega na hybrydyzacji DNA w celu identyfikacji określonego fragmentu DNA. DNA wyizolowane tniemy enzymami restrykcyjnymi (takimi jakie były na końcach wprowadzanego odcinka DNA). Nasz gen, który chcemy. Te same enzymy restrykcyjne niekoniecznie mają przecinać tylko w miejscu gdzie nasz gen. Po elektroforezie przenosimy DNA na nitrocelulozę albo na filtry nylonowe.

Hybrydyzacja z wyznakowaną sondą DNA lub RNA. Sonda (cały gen, który jest wprowadzany lub jego fragment). Ta sonda shybrydyzuje się tylko z tym fragmentem genu.

Przenoszenie na filmy.

Etapy metody:

Izolacja oczyszczonego DNA z komórek lub tkanek
Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami
Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA wg ich wielkości i ich denaturacja in situ
Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na filtr nirocelulozowy
Hybrydyzacja z sondą

prehybrydyzacja - polega na moczeniu filtru w odpowiednim roztworze (SSC - bufor), którego składniki blokują miejsca mogące wiązać kwasy nukleinowe na filtrze. Filtry (nylon, nitroceluloza) mają wysokie powinowactwo do jednoniciowego DNA czy RNA. Dodaje się nie homologiczne DNA - nośnikowe, wynikające z hybrydyzacji sondy ( w celu wyeliminowania tła). Warunki prehybrydyzacji - stężenie soli i temp. są takie same jak w 1)
właściwa hybrydyzacja - wyskalowano sonda wiąże się z unieruchomionymi na filtrze kwasami nukleinowymi. Dobranie odpowiednich warunków zapewni specyficzność, czyli wiązanie sondy tylko z określonymi fragmentami oraz czułość. W przypadku, gdy mamy 100% lub bardzo wysoką homologię stosujemy ostrzejsze warunki - wyższa temp. i niższe stężenie soli
płukanie filtru - pozwala na usunięcie nieshybrydyzowanej sondy, warunek specyficznego obrazu hybrydyzacji.

Wywołujemy za pomocą filtra. Wykrywanie specyficznych fragmentów DNA przez hybrydyzację genów przeniesionych na nitrocelulozę. *Elektroforeza Robimy coś, aby DNA przeszło na filtr. Wanienka z buforem, na nią płyta szklana, bibuła filtracyjna (Whatmana), żel. Przykrywamy go kawałeczkami bibuły i zanurzamy w buforze. Na to filtr nitrocelulozy, dużo bibuły. Płytka metalowa i obciążnik. To powoduje, że bibuła i ręczniki ciągną z roztwory bufor. To wszystko co jest na żelu przeciąga na żel nitrocelulozowy. Wszystko się zdejmuje. Wszystko jest na żelu. Filtr zamykamy w woreczku, aby nie było złej hybrydyzacji z sondą. W tym woreczku nie może być powietrza. Zaspawana, aby nic się nie ulotniło. Wyjmujemy. Płuczemy, suszymy, przykładamy kliszę. Dowód, że zwierzęta i rośliny są transgeniczne.

Metoda Northern jest to technika stosowana do wykrywania specyficznej cząsteczki RNA wśród wielu innych cząsteczek RNA stanowiących tło. Do określania ekspresji genu.

Hybrydyzacja metodą Northern:

Ekstrahujemy z komórki DNA.

Elektroforeza

Transfer na filtr

Hybrydyzacja sondą RNA lub sondą DNA

Najprostsza metoda

5.Jak się wykrywa białka

Zestaw VIII

1. Uszkodzenie DNA - mutagerneza

Uszkodzenia DNA- chemiczna reaktywność DNA z egzogennymi związkami lub promieniowanie mogą powodować zmiany w jedo strukturze strukturze właściwościach chemicznych. Może to być letalne przez zablokowanie replikacjii albo transkrypcji lub powodować mutacje na drodze metagenezy bezpośredniej lub pośredniej . Chemiczna niestabilność DNA może powodować spontaniczne uszkodzenia, takie jak deaminacjai depurynacja.

Uszkodzenia oksydacyjne- reaktywne formy tlenu takie jak rodniki nadtlenowe i hydroksylowe powodują szereg uszkodzeń wśród nich utworzenie się 8-oksyguaniny i 5-hydroksymetylouracylu. Uszkodzenia takie pojawiają się spontanicznie ale ich częstość wzrasta pod wpływem zewnętrznych czynników egzogennych np. promieni gama.

Alkilacja- elektrofilowe czynniki alkilujące , takie jak metylosulfonian metylu lub etylonitrozomocznik, mogą modyfikować nukleotydy w różnych pozycjach.

Duże związki addycyjne- duże uszkodzenia, takie jak dinery pirymidynowe i addukty arylowe, zniekształcaja dwuniciową helisę DNA i powodują jej miejscową denaturacje .Zaburza to prawidłowe funkcjonowanie DNA.

Metageneza

Mutacja-to dziedziczne stałe zmiany sekwencji DNA. Mutacją punktową możę być tranzycja(G.C-A.T), czyli jedna uryna lub pirymidyna jest zastępowana przez inną, transwersja, kiedy uryna zostaje zastąpiona pirymidyną lub odwrotnie. Mutacja na zasadzie delecji(utraty) i inercji(dodania zasad) mogą powodować przesunięcie ramki kodu genetycznego. Mutacje ciche nie wywołują zmiany genotypowej, podczas gdy mutacje missensowne(zmieniające sens kodonów) i nonsensowne(zmieniają sekwencję aminokawasową kodowanego białka).

Wierność replikacji- wysoka precyzja replikacji DNA(jeden bła na 10¹⁰ wbudowanych zasad) zależy od właściwego tworzenia par zasad nici matrycowej i napływających nukleotydów w miejscu aktywnym polimerazy DNA, sprawdzenia i ewentualnej korekty włączanych zasad przez egzonukleazę 3'-5' oraz od funkcjonowania aparatu naprawy błędnie sparowanych zasad.

Mutageny fizyczne- promieniowanie jonizujące(np. promieni X i Gama) i niejonizujące np. UV. Wywoł ują rozmaite uszkodzenia DNA,

Mutageny chemiczne-analogi zasad mogą ulegać niewłaściwemu sparowaniu podczas replikacji DNA, powodując mutacje. Kwas azotowy powoduje deaminację cytozyny i adeniny.

Mutagenaza bezpośrednia- wynika z obecności stabilnych nie naprawionych zasad o zmienionych właściwościach tworzenia par w DNA. Replikacja DNA jest wszystkim czego potrzeba aby uszkodzenie to (nietrwałe) zostało utrwalone jako mutacja trwała i dziedziczna.

Mutagenaza pośrednia- większość uszkodzeń uszkodzeń DNA jest naprawiana przez mechanizmy naprawy przed przejściem widełek replikacyjnych. Jeśli jednak naprawa ta nie nastąpi a uszkodzeni polega na braku jednej lub kilku zasad to może dojść do błędnej syntezy DNA.

2. Różnice genów prokarioty i eukarioty u prokar:

-DNA upakowany w nukleoid

-DNA jest zamkniętą cząsteczką (kolistą)

-DNA jest mniejsze

-jest DNA plazmidowe

u eukar:

-DNA jest w jądrze komórkowym

-jest kilka chromosomów gdzie jest zawarty materiał eukariotyczny

-DNA większe

-nie ma DNA plazmidowego, jest DNA mitochondrialne

3.Jakimi genami usuwa się onkogeny*

Terapia genowa- wprowadzanie nowej metody leczenia chorób genetycznych-terapii genowej.jeżeli jakaś choroba wynika z uszkodzenia jednego z genów, tak że gen ten nie ulega ekspresji tzn. nie działa, to można chory zastąpić zdrowym genem, gen musi być dostarczany w odpowiedni sposób musi podlegać ekspresji w danej tkance, a ekspresja powinna być na odpowiednim poziomie. Z obecnie stosowanych terapii genowych wiąże się dość wysokie ryzyko gwałtownej reakcji układu odpornościowego na wirusy, za których pośrednistwem zdrowy gen jest podawany do organizmu. 2002 doniesiono o eksperymencie terapii genowej chorych na hemofilię typu B. Chorym wstrzyknięto niewielkie ilości genu.

Somatyczne terapie genowe- poprzedzona: sklonowaniem odpowiedniego genu, identyfikacja sekwencji rybonukleinowej, identyfikacja komórek w których działa, wyboru wygodnych metod transfelacji, sprawdzenia jego prawdziwego działania, sprawdzenie czy nie narusza metabolizmu komórki i całego organizmu.

zmieniają aktywność W leczeniu onkogenów dąży się do swoistego zniszczenia i wyeliminowania komórek nawt z organizmu. Dokonuje się tego przy pomocy: 1. geny samobójcze- enzym hodowany przez terapeutyczny gen umożliwia przekształcania nieaktywnych związków chemicznych w substancje prowadzące do śmierci komórek lub do uczulenia komórek na chemoterapię lub radioterapię - gen tymidowy wirusa opryszczki 2. geny immunomudulacyjne -układu odpornościowego. Białka hodowane przez te geny pośredniczą w eliminacji komórek nowotworowych przez bezpośrednie zasobu komórek lub pobudzanie limfocytów np. wprowadzanie do chorych komórek genów cytolin czy GM-CSF.3. geny antyantogenne - hamują wzrost naczyń krwionośnych w guzie. Hamowanie komórkowych sygnałow pobudzających wzrost nowych naczyń krwionośnych. 4. geny proapoptyczne- pobudzają śmierć komórek na drodze apoptyzy. W komórkach nowotworów dochodzi do zaburzeń procesu apoptezy zjawiska eliminującego uszkodzenia komórek, a produkcja przeciwciał monoklonalnych:-izoluje się komórki śledziony myszy immunizowanej antygenem -miesza się je ze zmutowanym antygenem [niezdolny do wzrostu na specyficznej pożywce}- fuzja komórek, powstają hybrydy komórek - selekcja na podłożu wektorów hybrydowych-hodowla potomstwa z pojedynczych komorek , taki klon hybrydonowy będzie produkował przeciwciała o podobnej specyficzności wobec pewnych antygenów wziętych do immunizacji i będzie nieśmiertelny, monoklonalne przeciwciała są w tej chwili szerok0o używane w diagnostyce infekcji i raki i szeregu i innych celów.

4. Operony: lac - laktazowy - jednostka prokariotycznej jednostki genu, który zawiera promotor i operator laktozowy, gen kodujący lak I, gen kodujący acetylazę - on działa, gen lak I - nieczynny jak jest monomeryczne. Tetrametr jest aktywny, wielkie powinowadztwo do operatora lac. On siedzi na tym białku i gen jest nieczynny. Gdy włożymy E. coli do roztworu laktozy. Mimo to gen jest nieczynny to zawsze jest 1 lub 2 cząsteczki zsyntetyzowane.

5. Klonowanie i wektory

Klonowanie polega na rekombinacji DNA

DNA klonowany:

Izolacja z genomu dawcy
Resynteza na matrycy mRNA
Synteza chemiczna

Wektor:-plazmidowy

-fagowy

-kosmid

powstaje DNA zrekombinowany w wyniku transformacji powstaje -komórka biorcy-ekspresje nowej inform. genetycznej białka.

Jak uzyskujemy fragmęty do rekombinacji:

losowe cięcie DNA enzymami restrykcyjnymi
synteza komplementarnego DNA na mRNA, przy pomocy odwrotnej transkryptazy otrzymuje się hybryd, złożony z 2 różnych zwiazków.

Nulkeaza S₁ (wycina niesparowany koniec) i dosyntetyzowuje końcówki TTT lub AAA, miejsca do klonowania.

Wektory- plazmidy, fagi np. FAG α, kosmoidy

Plazmidy- b. Małe do 200 kpz. Należy je przygotować.

Przygotowanie plazmidowego DNA:

Klonowanie w wektorach plazmidowych.

Miejsce E- pojedyńcze miejsce do cięcia molekularnego enzymem restrykcyjnym ECORI. Obcy DNA też powinien posiadac na końcach identyczne sekwencje jak DNA plazmidowe, pocięte przez ECORI. Gdy duże takie kawałki znajdą się w roztworze to ze sobą połączą się. Ten kawałek zrekombinowanego wektora poddajemy transkrypcji w komórkach E. Coli. Będziemy wyszukiwali na szalce z agarem fragmetów DNA odpornych na ten antybiotyk. Wyjmujemy komórki z probówki i namnażamy. W plazmidzie możemy wprowadzić DNA o wielkości 10 kpz (klonować można duże fragmęty DNA).Wyszukiwanie ważnych koloni np.. PUC 18 (w 2 genie jest wielokrotne miejsce klonowania). W genie kodujacym jest miejsce wielokrotnego klonowania klonowania. Fragmęty mające takie cięcie mogą być włączone. Niektóre miejsca klonowania są rozpoznawalne przez 2,3 różne enzymy. Degradacja miejsc klonowania- rozcinanie. Jeżeli komórki są niebieskie w agarze to nie wprowadzamy genu, złe komórki plazmidu, komórki zrekombinowane

Fagi

Jeżeli do fagów wprowadzimy DNA, to po kilku godz. Inkubacji tworzą się łańcuchy fagowe, komórki nie zakażone przez faga normalnie rosną. Widzimy ich kolonie. Metoda znajdowania komórek ze zrekombinowanym DNA(wprowadzonym). Inne cząsteczki przyjmujące DNA-wektory fagowe. Fag posiada ogonek i kapsyd białkowy (aby chronić DNA), Fag α składa się z materiału genetycznego. Jego60% jest ważne dla funkcjonowania fagu, a 40% można usunąć i ustawić inne a on będzie dalej się rozwijał. Tym fagiem zarażamy komórki E. Coli. Na komórkach są receptory rozpoznawalne przez ogonek faga. Jak znajdzie receptor pasujący na końcu ogonka ma dokładnie pasujące zakończenie do receptora.Łączą się duże części i DNA wpływa na kom. E. Coli (zainfekowane E. Coli). Wysiewamy ją na agar a na nim są zwykłe komórki bakteryjne niezmienione. Gdy posiejemy zainfekowane to on rozbija tę komórkę i rozpryskuje się na inne zakażając je i dając łysinki. Przy pomocy fagów można wprowadzać 25 kpz

Kosmoidy i sztuczne chromosomy drożdżowe

Z połączenia plazmidów i fagów powstają kosmidy ( III rodzaj wektorów). W DNA plazmidowe są sekwencje DNA nazwane COS umożliwiają pakowanie do fagów. W kosmidach można klonować do 45 kpz

Zestaw IX

1. Chromosom prokariot i budowa DNA

Chromosom prokariotyczny-jest zamknięta kolista cząsteczkąDNA długości 4,6ml pz, która występuje w rejonie komórki nazywamy nulkeoidem DNA w trakcie normalnego wzrostu komórek jest replikowany w sposób ciągły. Genom jest zorganizowany w 50-100 domen, o wielkości od50 - 100kpz, których końce są połączone z kompleksem błonowo-białkowym. Genom jest ujemnie superhelikalny

Budowa DNA

DNA - kwas dezoksyrybonukleinowy

W DNA występuja zasady:

-adenina(A); -guanina(G)-są to puryny

-cytozyna(C); -tymina(T) - pirymidyny

Sekwencja DNA - sekwencja zasad A,G,C,T w łańcuchu DNA, zapisuje się od końca 5' do końca3'.

2.Synteza białek u prokar