Biologia molekularna

dla studentów II roku biologii

Aleksandra Boguszewska

Zakład biologii molekularnej p 7A

godz. konsultacji piątek 12.00-14.00

[e-mail]

Tematy wykładów z biologii molekularnej

- wprowadzenie do biologii molekularnej: definicja, historia: budowa i funkcja DNA, RNA: od genu do białka: dogmat biologii molekularnej, kod genetyczny, budowa białek

- wybrane metody oczyszczania i analizy białek

- organizacaj genomu: genom bakteryjny, genom eukariotyczny - jądrowy, chloroplastowy i mitochondrialny, eukarityczne wirusny DNA i wirusy RNA:

- Ekspresja genów: transkrypcja, dojrzewanie RNA, transport przez błonę jądrową, translacja, fałdowanie i degradacja białek, regulacja ekspresji genów:

- cykl komórkowy i jego regulacja

- apoptoza

- biologia molekularna w medycynie: choroby mitochondrialne i nowotworowe, przeciwciała jako narzędzie w biologii molekularnej i wspólczesnej medycynie.

Tematy ćwiczeń z Biologii Molekularnej

dla II roku Biologii

- zapoznanie z pracownią biologii molekularnej, przepisy BHP, obliczenia biochemiczne

- charakteystyka chemiczna kwasów nukleinowych

- izolacja genomowego DNA z drożdży Saccharomyces cervisiae

- amplifikacja genów kodująych rybosomowe białka P1A i P1B drożdży Saccharomyces cervisiae

- 5-6 transfer genów do komórek ssaczych - transfekcja, obserwacje w mikroskopie konfokalnym (wykł 10 marca obecność obowiązkowa, 17-18 marca cł ½ gr, 24-25 marca - ćw. druga ½ gr.)

- izolacja RNA z komórek drożdży

- elektroforetyczna analiza RNA

- transkrypcja w warunkach in vivo w komórkach bakteryjnych i drożdżowych

- cykl życiowy drożdży Saccharomyces cervisiae - koniugacja

- cykl życiowy drożdży Saccharomyces cervisiae - sporulacja

- 11 a. badanie wplywu inhibitorów translaci na wzrost komórek drożdżowych

- cykl życiowy drożdży S. cervisiae - otrzymanie pokolenia haploidalnego drożdży po sporulacji

- wykrywanie inhibitorów proteaz serynowych

- identyfikacja inhibitora

Podręczniki:

- Biologia molekularna, krótkie wykłady, wyd 3 - P. Turner i in., PWN, 2011

- Podstawy biologii molekularnej - L.A. Wilson, WUW, 2009;

- Genomy, wyd 2 - T.A. Brown, PWN, 2009

- Nature; Cell; Trends in Biochemical Sciences (TiBDS); Postępy Biochemii.

Historia biologii molekularnej

384 - 322 p.n.e. - Arystoteles ogłasza teorię pangenezy (cechy dziedziczne są zawarte i przenoszone w gemulach z poszczególnych komórek ciała)

1866 r. - G. Mendel (ojciec wspólczesnej genetyki) publikuje swoją pracę na temat dziedziczenia cech u grochu

1869 r - F. Miescher izoluje bogatą w fosfor substancję zwaną „nukleiną” z jąder kwrinek białych

1875 r. - E.Strasburger opisuje twory, zwane później chromosomami

1929 r. - P.A. Levene charakteryzuje i nazywa kwas rybonukleinowy i kwas deoksyrubonukleinowy

1938 r - pojawia się wiele badań nad bialkami i DNAz wykorzystyaniem krystalografii rentgenowskiej, W. Weaver proponuje temrin biologia molekularna;

1950 r. - E. Chargaff pokazuje że ilości zasad T i A oraz C i G w DNA są równe;

1952 r - A. Hershey i M. Chase wykorzystują badania nad bakteriofagiem T2, by potwierdzić że DNA jest nośnikiem informacji genetycznejj

1952 r - Maurice Wilkins i Rosalind Franklin, wykorzystując krystalografię rentgenowską, wyjaśniają, że w DNA znajdują się struktury powstarzające się

1953 r - Francis Crick i James Watson prezentują DNA jako helisę złożoną z dówch nici powiązanych wiązaniami wodorowymi

DNA jest materiałem genetycznym; każdy chromosom jest pojednynczą cząsteczką DNA; geny są fragmentami sekwencji DNA.

Biologia molekularna

Nauka podstawowa zajmująca się badaniem struktury i funkcji makromolekul, przede wszystkim białek i kwasów nukleinowych. Zazębia się ona z takimi dziedzinami wiedzy jak genetyka, biochemi, biofizyka czy cytologia.

Wiliam Astbury w „Nature” (1961) opisał, że biologia molekularna: „(…) jest szczególnie zainteresowana formami biologicznych cząsteczek, ich trójwymiarową strukturą, genezą i ich funkcjonowaniem”.

DNA jest polimerem zbudowanym z powstarzających się jednostek zwanych nukleotydami (dNTP:) dATP, dGTP, dCTP, dTTP

Długość komórkowych cząst. DNA może sięgać kilkaset milionów nukleotydów, długość dwuniciowej cząst. DNA wyraża się liczbą par zasad (pz) - kilo par zasad (kpz) lub milion pz (mpz). W laboratoriach często wykorzystuje się krótkie łańcuchy jednoniciowego DNA, zazwyczaj krótsze niż 50 nt, określane mianem oligonukleotydów

dNTP

deoxyribonucleotide triphosphate - deoksyrybonukleotydotrifosforan

do deoksyrobozy dołączona zasada azotowa (base) - A, T, G, C - w pierwszym węglu, w piątym trifosforan, w trzecim OH.

Formy przedstawienia podwójnej helisy DNA

A - w środku os, na zewnatrz szkielet fosfocukrowy, do środka zasady połączone wiązaniami wodorowymi

B - widoczne jest ulożenie warstwowe zasad w podwójnej helisie DNA, na zewnątrz szkielet fosfocukrowy

C - forma wstęgowa - szkielet fosfocurkowy w postaci podwojnej wstęgi, pomiędzy nimi łączą się wiązaniami wodorowymi komplementarne zasady A i T, C i G, tworzą się duży rowek i mały rowek.

Formy dwuniciowej helisy DNA

Rodzaj DNA	A-DNA	B-DNA	Z-DNA
Kierunek skrętu	Prawoskrętna	Prawoskrętna	Lewoskrętna
Duży rowek	Głęboki i wąski	Średnio głęboki, szeroki	Płytki, w zasadzie nieobecny
Mały rowek	Płytki i szeroki	Średnio głęboki, wąski	Bardzo głęboki, wąski
Liczba par zasad na pełny obrót helisy	11	10,5	14 (?)

Dwuniciowa cząsteczka DNA może podlegać odwracalnemu rozpleceniu do pojedycznych nici

Natywny DNA (podwójna helisa) - podgrzanie, OH-, formamid → Zdenaturowany DNA (Statystyczny kłębek)

Temperatura topnienia (Tm) DNA - to taka temp., przy której 50% podwójnej helisy DNA jest rozpleciona do pojedynczych nici

DNA w sztuce - bio art.

Malowanie chromosomu, podwójnej helisy, srebry łańcuszek na cześć zmarłj na białaczkę Rosalind Franklin.

Budowa RNA

Cząsteczka RNA jest liniowym polimerem zbudowanym z nukleotydów połączonych ze sobą wiązaniami fosfodiestrowymi

DNA - cząsteczka dwuniciowa, występujące zasady

C - cytozyna

G - guanina

A - adenina

T - tymina

Deoksyryboza - węgiel w pozycji 2'

RNA - cząsteczka jednoniciowa, występujące zasady

C - cytozyna

G- guanina

A- adenina

U - uracyl

Ryboza - wodór w pozycji 2'

Struktury drugorzędowe RNA

Drugorzędowa struktura RNA charakteryzuje się obecnością podwójnej helisy typu A oraz jednoniciowych pętli, które można podzielić na:

struktury spinki do włosów (ang. hairpins)

wybrzuszenia (ang. bulges)

pętle wewnętrzna (ang. internal loop)

połączenia (ang. junctions)

Rodzaje par zasad zidentyfikowane w dwuniciowych helisach RNA

Kanoniczne pary zasad typu Watson-Crick: AU; GC

Niekanoniczne pary zasad (ponad 20 różnych typów), najczęściej spotykane to:

GU (ang. wobble GU); GA (ang. sheared, po polsku tzw. nożycowa)

AU

Oddziałujące trójki zasad w RNA

Trójki zasad mają zwykle parę oddziałującą w sposób klasyczny, zgodnie z zasadami par typu Watson-Crick, a trzecia zasada oddziałuje wieloma różnymi, niekonwencjonalnymi sposobami.

Niekanoniczne pary oraz trójki zasad są ważnymi elementami procesow zwijania się RNA i oddzialywań RNA-białko i RNA-ligand.

Motywy struktury trzeciorzędowej RNA

„cząsteczka tRNA wygląda tak, jakby Natura chciala zmusić cząsteczki RNA do wykonywania zadań przeznaczonych dla bialek” - F. Crick (1966)

Zidentyfikowano liczne, bardzo zachowawcze i złożone motywy strukturalne RNA,

m.in. pseudowęzły, zwroty K

Rodzaje i funkcje RNA w komórce

Cały RNA:

-kodujący (4%)

RNA kodujący - pre-mRNA (hnRNA, heterogenny nuklearny RNA) - kom eukariotyczne ->mRNA

- niekodujący (96%)

pre-rRNA → rRNA

pre-tRNA → tRNA

w komórkach eukariotycznych występują także

snRNA, - small nuclear RNA, potrzeby do dojrzewania mRNA

snoRNA - mały jąderkowy RNA, potrzebny do dojrzewania rRNA (?)

scRNA - mały cytoplazmatyczny RNA, np. siRNA, mikroRNA

w komórkach bakteryjnych występuje także:

tmRNA - RNA trochę jak tRNA, a trochę jak mRNA

Większość RNA występuje w kompleksach RNA-białko zwanych cząstkami rybonukleoproteinowymi (RNP)

Komórka bakteryjna zawiera 0,05 - 0,1 pg RNA co stanowi ok. 6% jej masy

Komórka ssaków jako większa zawiera 20-30 pg DNA.

Funkcje RNA w komórce

- RNA może służyć jako „rusztowanie” na którym osadzają się białka, np. cząstka sygnałowa SRP;

- oddziaływania RNA-białko mogą wpływać na aktywność katalityvzną białek, np. telomeraza.

- krótkie cząsteczki RNA mogą bezpośrednio kontrolować ekspresję genów, np. ryboprzełączniki, RNA związane z interferencją RNA (RNAi);

- RNA może być meteriałem dziedzicznym, np. wirusy RNA

- RNA może być katalizatorem reakcji chemicznych, tzw, rybozymy.

Katalityczne RNA - rybozymy

Samowycinające się introny - introny grupy I i II

Rybonukleaza P - enzym który wytwarza końce 5' bakteryjnych tRNA składa się z podjednostek RNA i podjednostek białkowych, przy czym aktywnośc katalityczną ma RNA

RNA rybosomowy - aktywność transferazy peptydylowej potrzebna do wytworzenia wiązania pepdtydowaego w czasie syntezy białka jest związana z dużym rRNA

Spliceosom - kompleks rybonukleoproteinowy biorący udział w splicingu pre-mRNA

Genomy wirusowe - podczas replikacji genomów RNA niektórych wirusów następuje autokatalityczne przecięcie łańcuchow nowo zsyntetyzowanych genomów. Przykładem są wiroidy roślinne (rybozymy typu: hammerhead, hairpin), wirusoidy i zwierzęcy wirus zapalenia wątroby delta (HDV)

1958 - Sformułowanie centralnego dogmatu biologii molekularnej przez Francisa Cricka

Central Dogma of Molecular Biology by Francis Crick

The central dogma of molecular biology deals with the detailed residue-by-residue transfer of sequential information.

Informacja genetyczna, która zawarta jest w DNA w większości przypadków przenoszona jest z DNA na DNA w procesie replikacji, następnie z DNA na RNA w procesie transkrypcji i z RNA na białko w procesie translacjii (biosyntezy białka)

General	Special	Unknown
DNA-DNA	RNA-DNA	Protein-DNA
DNA-RNA	RNA-RNA	Protein-RNA
RNA-Protein	DNA-Protein	Protein-Protein

Podstawowy przepływ informacji w komórce

DNA → (transkrypcja) → RNA → (translacja) → Białko

DNA i RNA stanowią genotyp - „język nukleotydów”

Białko stanowi o fenotypie - „język aminokwasów”

Rybosom pełni funkcję „tłumacza” genotypu na fenotyp

Informacja genetyczna zawarta jest w DNA w poszczególnych genach.

Gen - fragment funkcjonalny cząsteczki DNA kodujący białko bądź funkcjonalną cząsteczkę RNA.

Geny nawinięte na chromosom.

Kod genetyczny

Mamy podwójną helisę DNA która ma ulec transkprycji, musi ona ulec rozpleceniu, na jednej z nici syntetyzuje się RNA, jeżeli ma potem powstać z tego bialko to mRNA, trzy kolejne nukleotydy w mRNA stanowią kodon - są one tłumaczone na jeden aminokwas, synteza łańcucha aminokwasowego - powstaje białko, fałduje się.

Kod genetyczny jest trójkowy

61 kodonów koduje 20 podstawowych aminokwasów (ogólnie w komórce występuje 100 aminokwasów powstających na drodze modyfikacji podstawowych - kod jest zdegenerowany - kilka kodonów - kilka kodonow może kodowac ten sam aminokwas

Tylko metionina jest kodowana przez jeden kodon - AUG - kodon start.

Inne aminokwasy 2-6 kodonów.

Sekwencja stop - 3 kodony.

Kodon jest także jednoznaczny - dany kodon koduje tylko jeden aminokwas.

Długo mówiono, że jest uniwersalny, ale teraz nie do końca - prawie te same trójki kodują te same aminokwasy, ale występują drobne różnicy - trochę inaczej u niższych zwierząt.

21 i 22 aminokwas w białkach

UGA Stop - selenocysteina (prokariota i eukariota, z wyjątkim drożdży i roślin)

UAG Stop - pirolizyna (archeony i bakterie)

Białka

Polimery składające się z 'cegiełek' aminokwasów, połączonych wiązaniami peptydowymi.

Początek białka ma (N-koniec) wolną grupę aminową, koniec białka (C-koniec) wolną grupę karboksylową, z boku łańcuchy boczne.

Opis cząteczki Wygląd cząteczki Liczba aminokwasów

Peptydy krótkie łańcuchy aminokwasowe

Poziomy organizacji cząteczki białka

Struktura pierwszorzędowa - sekwencja, czyli kolejność ułożenia aminokwasów

Struktura drugorzędowa - alfa helisa, beta kartka

Struktura trzeciorzędowa - wzajemne przestrzenne ułożenie fragmentów struktury drugorzędowej

Struktura czwartorzędowa - wzajemne przestrzenne ułożenie łańcuchów polipeptydowych.

Tylko białka zawierające więcej niż jedną podjednostkę mają strukturę czwartorzędową!!!

(a) Collagen

włókienko splecione z kilku łańcuchów polipeptydowych

Denaturacja - renaturacja białka

W wyniku denaturacji zniszczeniu ulega struktura 2, 3, 4-rzędowa, zostaje pierwszo.

Native form → (denaturation) → białko zdenaturowane → (refolding) → native form

Sposoby prezentacji struktury atomowej białka

- str. szkieletowa - sam szkielet białka, bez wiązań bocznych

- str. wstążkowa - za pomocą wstążek i strzałek ukazane są alfa helisy i beta kartki - strzałki pokazują nam kierunek białka

- str. chemiczna - pokazane wiązania

- str. powierchniowa - kuleczkowa struktura

n-koniec niebieski, c- czerwony

Wybrane metody oczyszczania i analizy białek

„Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order” - Sydney Brenner

Analiza białek pozwala odpowiedzieć na wiele ważnych biologicznie pytań dotyczących badanego białka:

- jaka jest całkowita ilość badanego białka w komórce, a jaki jest poziom syntezy w poszczególnych typach komórek;

- jaka jest subkomórkowa lokalizacja badanego białka (np. jądrowa, błonowa, mitochondrialna itd.);

- czy białko ulega translokacji w odpowiedzi na pewne warunki;

- czy białko ulega modyfikacjom postranslacyjnym i jak wplywają one na funkcje białka;

- czy poziom danego białka w komórce jest regulowany przez szok cieplny, hormony, czynniki wzrostowe;

- jaka jest funkcja badanego białka w komórce;

- z jakimi innymi bialkami oddziałuje badane białko;

- czy poziom białka w komórce zmienia się u chorych osobników.

Wybór analizowanego białka

Wybór źródła badanego białka:

- naturalne

- nadekspresja

Ułatwia oczyszczanie

Umożliwia otrzymanie dużych ilości białka

- Analizy biochemiczne (badanie aktywności enzymatycznej, stabilności, interakcji białko-białko, białko-DNA)

- Analizy strukturalne (krystalizacja, NMR)

- Otrzymanie przeciwciał

Hodowle komórkowe:

- komórki drożdżowe

hodowle drożdżowe są tańsze, łatwiejsze do przeprowadzenia. Można otrzymywać kolonie drożdżowe na płytkach agarowych lub w pożywkach płynnych na odpowiednich wytrząsarkach w odpowiedniej temperaturze

- komórki ssacze tzw. linie komórkowe

Szalki w podłożu płynnym w odpowiednich inkubatorach zapewniających temperaturę i dwutlenek węgla, bądź duże naczynia hodowlane

Wyższe wymogi sterylności, aby nam się nie zakaziło.

Metody dezintegracji komórek/lizy komórek:

- mechaniczne

* homogenizacja

* młyn kulkowy

- nie-mechaniczne

* fizyczne (sonifikacja, mrożenie/odmrażanie)

* chemiczne (detergenty, rozpuszczalniki)

* enzymatyczne (lizozym, litykaza)

Dezintegracja komórek:

- moździerz ceramiczny

- homogenizator szklano-teflonowy (rurka, do niej roztwor komórkowy, tłok chodzi w górę i w dół, rozbija komorki, pomagają w tym czynniki chemiczne zawarte w roztworze)

- homogenizator ultradźwiękowy - zawiesina komórek, wkładamy pręt ultradźwiękowy, niszczy się integrację komórek

Frakcjonowanie komórek poprzez wirowanie różnicowe:

Homogenat wirujemy (1 500 g - 10 min.)

- osad I (całe komórki, pozostałości komórek, jądra)

- supernatant I wirujemy (30 000 g - 20 min.)

* osad II (mitochondria, lizosomy, peroksysomy)

* supernatant II wirujemy (100 000 g - 2 godz.)

# osad III (mikrosomy)

# supernatant III (białka cytoplazmatyczne)

Przed wirowaniem - cząsteczki zawieszone w roztworze → wirowanie za pomocą szybko obracającego się rotora kątowego - po wirowaniu na górze supernatant, osad osiada na dole.

Wirowanie w gradiencie gęstości

Do probówki wirówkowej nalewany roztwór sacharozy - bliżej dna gęstszą sacharozę - 20%, bliżej wierzchu 5% sacharozy, rzadzsza, gradient gęstości - na górze nanosimy próbkę - wirujemy w rotorze w którym probówki są ustawione poziomo, w wyniku działania siły odśrodkowej rozdziela się mieszanina w gradiencie sacharozy - z inicjalnego nanosu powstają oddzielone frakcje

małe cząsteczki na wirzechu, średnie cząsteczki w środku, duże cząsteczki na dnie

Wysalanie białek:

Mamy płaszcz wodny przykrywający białko;

Wraz ze zwiększeniem koncentracji soli do pewnego momentu rozpuszczalność białek rośnie (nasycanie roztworu solą) - tworzy się płaszcz hydratacyjny i rozpuszcza się lepiej;

Tak się dzieje tylko do pewnego momentu, po dodaniu kolejnej porcji soli rozpuszczalność gwałtownie spada i białko wytrąca (wysala się) z roztworu.

Dializa białek - przechodzenie przez błony półprzepuszczalne cząsteczek rozpuszczalnika i innych małych cząsteczek, którymi zanieczyszczany jest roztwór białka.

Początek dializy

Stężony roztwór (białka + zanieczyszczenia) umieszczamy w półprzepuszczalnym woreczku dializacyjnym i umieszczamy w zlewce z rozpuszczalnikiem, zostawiamy na kilka godzin.

Po ustaleniu równowagi

Z woreczka dializacyjnego przeszła połowa zanieczyszczeń, po wymianie rozpuszczalnika proces powtarza się.

Oczyszczanie białek metodą chromatografii cieczowej:

Mieszanina białek (np. frakcja cytoplazmatyczna) - nanosimy ja na odpowiedni złoże chromatograficzne, które znajduje się w odpowiedniej kolumnie, na dole kolumy otwór, na górze próbka → u góry podłączamy rozpuszczalnik, na dole probówkę, nasz roztwór wędruje przez złoże, rozdziela się, po kolei do próbówek zbieramy różne frakcje zawierające rozdzielone białka.

Wykres chromatograficzny

na osi x poszczególne probówki do których zbieramy białka, na y absorbancja

nic - potem ścieka białko jeden - nic - potem ścieka białko dwa - pik wskazuje na białko - wysokość piku wskazuje nam na rodzaj białka.

To z automatycznych, zmaszynowanych chromatografów.

Różne rodzaje chromatografii cieczowej.

Rozdział białek ze względu na:

- rozmiar - filtracja żelowa (sito molekularne)

- ładunek - chromatografia jonowymienna

- hydrofobowość - chromatografia oddziaływań hydrofobowych

- powinowactwo - chromatografia powinowactwa

Filtracja żelowa

W kolumnie; mamy kolumnę wypełnioną złożem chromatograficznym - kuleczkami agarozowymi, które mają określoną wielkość porów

Na takie złoże chromatograficzne nakładamy mieszaninę dużych i małych białek

Podłączamy rozpuszczalnik, u dole kranik, białka przechodza przez kolumnę i się rozdzielają

Najpierw białka duże, średniej wielkości potem, najmniejsze najpóźniej.

Białka duże nie są zatrzymywane przez pory bo się w nich nie mieszczą, przenikają więc między kuleczkami złoża i idzie im szybciej;

Białka małe przenikają przez pory w złożu (wchodza do kuleczki i muszą potem znaleźć z niej wyjście) - więc schodzi im dłużej.

Chromatografia powinowactwa

W chromatografii powinowactwa wykorzystujemy powinowactwo białka do złoża chromatograficznego

Mamy złoże chromatograficzne, oraz mieszanine białek o różnej strukturze.

Tylko jedno białko ma powinowactwo do złoża (łączy się ze złożem)

Nanosimy mieszaninę białek - jedne białka łączą się ze złożem, reszta nie - przepłukujemy rozpuszczalnikiem (płukanie) - z kolumny wypadają wszystkie białka, które nie łączyły się ze złożem, jeden rodzaj białek został.

Wykres chromatograficzny

- najpierw absorbancja zero po tym jak nałożyliśmy tylko mieszaninę,

płuczemy - absorbancja rośnie - płuczemy aż znowu nie spadnie (aż nie wypłuczemy całego białka i będzie leciał sam rozpuszczalnik)

- stosujemy wtedy drugi rozpuszczalnik który sprawia że wydzielone białko odczepia się od złoże i wyletuje też - pik numer dwa ostrzejszy znowu płuczemy aż nie spadnie (krócej)

Następnie możemy do drugiej kolumny która sprawia że wysalamy (?) owe białko

Ilościowe oznaczenie białka wbadanych frakcjach komórkowych

Metody spektrofotometryczne - Metoda Whitakera i Granuma

C białka (mg/ml) = (A235 - A280)/2,51

Metody kolorymetryczne - Metoda Bradford

Zabarwienie kompleksu proporcjonalne do stężenia białka

Białko + Coomasie (czyt. błękit kumasi) → kompleks barwy niebieskiej mierzy się spekrofotometrycznie przy 595 nm.

Trzeba zrobić krzywą wzorcową → tworzymy kompleksy białko-barwnik o znanym stężeniu → wiemy wtedy, że dane stężenie białka odpowiada danej absorbancji, następnie odczytujemy z niej stężenia w próbie badanej

(równanie prostej można też obliczyć)

Elektroforeza żelowa białek

- Metoda ta umożliwia monitorowanie składu mieszaniny białek, sprawdzanie czystości białek, oznaczanie masy cząsteczkowej, analizy struktury podjednostkowej, określenie punktu izoelektrycznego białka

- W analizie białek stosowane są żele poliakrylamidowe (dobra rozdzielczość, duża wytrzymałość mechaniczna)

- Elektroforeza w żelu poliakryamidowym umośliwia rozdział cząsteczek białkowych różniących się wielkością i ładunkiem elektrycznym;

- Rozdział może być jednokierunkowy (1D) - lub dwukierunkowy (2D)

Analiza białka elektroforezy jednokierunkowej w warunkach denaturujących (SDS/PAGE)

Elektroforeza pionowa

próbki dodajemy za pomocą pipety automatycznej do studzienek

- wierzch - (katoda), dno + (anoda), białka idą z - do +

Do roztworu białka dodawany jest:

DTT

SDS

barwnik

SDS - składnik detergentów i środków myjących; ma on ujemny ładunek, przykrywa białka i maskuje ich ładunek, dzięki czemu wszystkie są ujemne i wędruja do anody.

DTT - substancja o zapachu zgniłych jaj, zawiera grupy -SH, niszczy mostki siarczkowe pomiędzy podjednostkami białka dzięki czemu każda podjednostka wędruje w żelu oddzialnie.

Barwnik - najczęściej niebieski (Coomasie).

Żel ma różne wielkości porów, z zależności od tego jakie bialka chce się zatrzymać.

- mniejsze białka zatrzymują się niżej

- większe wyżej

- największe najwyżej

Rozdzielamy białka pod względem ich masy.

Ile jednostek ma białko, tyle prążków widzimy po wybarwieniu.

Barwienie białek w żelu poliakrylamidowym.

Barwienie barwnikiem Coomassie Blue

zwykle powyżej 25 ng/prążek

barwienie fioletowe - prążki to poszczególne polipeptydy

Porównujemy z prążkami wzorcowymi, o znanej masie, porównujemy i określamy jaką masę ma nasze białko.

Barwienie srebrem (metoda teoretycznie bardziej czuła, ale to zależy od białka)

ok. 0,5ng/prążek

Prążki są wtedy żółtobrązowe.

Barwienie cynkiem

Nie wybarwiamy prążków białkowych, tylko wybarwia nam się tło - żel robi się mleczny i tylko te miejsca gdzie są prążki są przezroczyste.

czulość od 4000 - 0,25 ng/prążek

Barwienie barwnikiem fluorescencyjnym

dwa protokoły - szybki i podstawowy

metoda bardzo czuła i uniwersalna, ale drogie barwniki, konieczna aparatura dodatkowa.

Barwienie glikoprotein

Blue Stain (Coomassie) - barwimy wszystko

Glycoprotein stain - barwimy tylko glikoproteiny

Barwienie fosfobiałek

Blue Stain (coomassie)- barwimy wszystko

Phosphoprotein stain - barwimy tylko białko posiadające grupę fosforanową (fosfobiałka); metoda czulsza niż coomassie i specyficzniejsza

Coomassie nie barwi wszystkiego.

Analiza białek metodą ogniskowania izoelektrycznego (IEF)

Punkt izoelektryczny (pI) - pH w którym cząsteczka ma zerowy ładunek sumaryczny, oznaczany przy pomocy programu komputerowego dla białek o znanej sekwencji, lub empirycznie.

Jeżeli żel podłączymy z jednej strony do katody (-) i anody (+) to wytworzy nam się gradient pH odpowiednio od pH 10,0 do pH 3,0 - białka w mieszaninie wędruja tak dlugo, aż osiągną pH które odpowiada ich punktowi izoelektrycznemu - mają wtedy zerowy ładunek sumaryczny i przestają się poruszać w polu elektrycznym

Rozdzielają i ustawiają się więc zgodnie z rosnącym pI od anody do katody, a nie względem masy.

Ogniskowanie izoelektryczne

Zestawienie rozdzielczości SDS/PAGE - mamy jeden prążek, wyknujemy dla niego elektroforezę IEF - otrzymujemy osiem prążków w rozpiętości pH od 5,0 do 3,5 (?) - są to białka rybosomalne o prawie takiej samej masie cząsteczkowym lecz innym pI.

Analiza białek metodą elektroforezy dwukierunkowej (2D)

Pierwszy kierunek - IEF

długie cienkie paseczki ustawiające się w gradiencie pH

Drugi kierunek - SDS/PAGE - rozdzielone już białka pod względem punktu izoelektrycznego kieruje się do elektroforezy SDS/PAGE gdzie ustawiaja się dodatkowo względem masy.

Następnie barwimy barwnikiem Coomassie Blue lub srebrem

- zamiast prążków widzimy kropeczki

jeden wymiar żelu to gradient pH a drugi wymiar żelu to gradient masy.

Sekwencjonowanie białek - ustalenie kolejności aminokwasów w łańcuchu peptydowym

W 1953r F. Sanger jako pierwszy zsekwencjonował białko (łańcuchy insuliny)

Sekwencję białka możemy poznać

- poprzez sekwencjonowanie łańcucha peptydowego;

- poprzez sekwencjonowanie DNA odpowiedniego genu (lub cDNA), a następnie ustalenie sekwencji białka na podstawie kodu genetycznego.

Metody sekwencjonowanie/identyfikacji białek:

- chemiczne (degradacja Edmana)

- spektrometria mas

Etapy analizy sekwencji białka

Roztwór białka/mieszaniny białek

- 2D; SDS/PAGE; IEF → trawienie proteolityczne w żelu → rozdział chromatograficzny peptydów lub spektrometria mas (MALDI TOF MS) lub spektrometria mas (LC-MS/MS) → degradacja Edmana lub spektrometria mas (MALDI TOF MS)

- trawienie proteolityczne - spektrometria mas (LC-MS/MS)

W celu ustalenia sekwencji dlugiego polipeptydu należy go rozciąć na krótsze peptydy składające się z 20-50 reszt, które po rozdzieleniu poddaje się sekwencjonowaniu. Specyficzne pocięcie polipeptydu można osiągnąć metodami chemicznymi lub enzymatycznymi

np. bromocyjanu (BrCN), który rozrywa wiązanie peptydowe utworzone przez grupę karboksylową metioniny

Cyanogen bromide cleavage

np. przy udziale trypsyny która rozcina łańcuch polipeptydowy po karboksylowej stronie reszt aminokwasów zasadowych (Lys, Arg), lub chymotrypsyny, rozcinającej łańcuch polipeptydowy po karboksylowej stronie reszt aminikwasów aromatycznych (Phe, Tyr, Trp).

Peptydy otrzymane w wyniku secyficznej hydrolizy rozdziela się chromatograficznie i oznacza sekwencję każdego z oczyszczonych peptydow techniką degradacji Edmana.

Degradacja Edmana

Znakowanie peptydu którego sekwencję chcemy ustalić związkiem fenyloizoitocyjanianem

W środowisku zasadowym przyłącza się do pierwszego aminokwasu z N-końca polipeptydu - mamy fenylotiokarbamylową pochodną peptydu - w środowisku kwaśnym fenylotiocyjanian + aminokwas z N-końca odłączają się - powstaje fenylotiohydantaionowa (PTH) pochodna N-końcowego aminokwasu, i polipeptyd (N-1) - cykl powtarzamy

Kolejność ułożenia peptydów w polipeptydzie możemy wyjaśnić na podstawie tak zwanych nakładających się peptydów:

peptydy trypsynowe peptyd chymotrypsynowy

Ala-Gly-Trp-Gly-Lys-/ Asn-Val-Lys-Ala-Gly-Trp-/

Asn-Val-Lys-/

peptydy trypsynowe nakładają się na peptyd chymotrypsynowy:

peptydy trypsynowe

Asn-Val-Lys-/-Ala-Gly-Trp-Gly-Lys-/

peptyd chymotrypsynowy

Asn-Val-Lys-Ala-Gly-Trp-/-Gly-Lys

Spektrometria mas - techniki polegające na jonizacji badanej substancji, a następnie analizie utworzonych produktów ze względu na ich masę i ładunek.

Analizowana substancja → jonizacja (badanie substancji w jonizatorze) → rozdział jonów o różnym stosunku masy do ładunku (m/z) w analizatorze m/z → rejestracja danych w systemie rejestracji danych (detektorze)

Wynik: widmo masowe.

Metoda „odcisku palca” mapy peptydowej

(PMF, ang. peptide mass fingertprinting)

Eksperyment: mamy białko → trawienie do mapy peptydowej → spektrometria mas daje nam listę mas - porównujemy z teoretyczną lista mas poszczególnych mas dla różnych białek w programie komputerowym

Program komputerowy: baza danych sekwencji danych → trawienie teoretyczne do wirutalnej mapy peptydowej → symulacja spektrometrii mas → otrzymujemy hipotetyczne listy mas dla poszczeŋólnych białek.

Różnice w metodach sekwencjonowania

Degradacja Edmana

chemiczne usuwanie aminokwasów z N-końca peptydu (1 aa/ na cykl) i określenie sekwencji białka od N-końca (analiza chromtograficzna PTH pochodnych aminokwasów)

>~50 pmol polipeptydu

Spektrometria mas

umożliwia niewykle dokładne pomiary mas polipeptydów co z kolei pozwala na identyfikację peptydów poprzez wyszukiwanie w bazie danych, białek zawierających peptydy o takiej samej masie

>~50 fmol polipeptydu (lC MS/MS)

To, czego nie można dowieść metodami biochemicznymi, można teraz po prostu zobaczyć, czyli...

przyżyciowa analiza procesów biologicznych metodą mikroskopii konfokalnej

Obraz w mikroskopie konfokalny uzyskiwany jest poprzez skanowanie preparatu wiązką lasera, która wzbudza fluorescencję barwnika.

Zalety:

- otrzymywanie obrazów o większej rozdzielczości i lepszym kontraście

- uzyskanie trójwymiarowego obrazu

- jednoczesna rejestracja kilku barwników

Białko GFP (Green Fluorescent Protein) z meduzy Aequorea victoria (nagroda Nobla 2008), białko z meduzy.

po wzbudzeniu go światłem o długości 395 nm emituje światło zielone o długości 509 nm

jest to bialko beczułkowe, beczułki tworzą beta-harmonijki, w środku mamy fluorofor czyli to, co fluoryzuje

następnie z tego białka Roger Tsien otrzymal pochodne świecące różnymi barwami

- możemy otrzymać świecąc bakterie, „króliki”.

Musimy otrzymać konstrukt genetyczny zawierający sekwencję badanego białka (np. Beta-aktyny) i sekwencję fluorescencyjnego białka;

mieszamy to z liposomowym czynnikiem transfekcji (przenoszenia obych genów do komórki); inkubujemy przez trzydzieści minut;

plazmidy tworzą kompleks z kationowymi liposomami - tworzą się lipopleksy;

dodajemy to do komórek ssaczych, inkubujemy.

Dodajemy utworzonego DNA do komórki ssaczej - ono przenika do jądra, ulega transkrypcji do mRNA, mRNA wędruje do ctyoplazmy - ulega translacji - powstaje nam białko badane związane z białkiem fluorescencyjnym - powstaje świecący szkielet aktynowy

FRET (ang. Fluorescence Resonance Energy Transfer lub Foerster Resonance Energy Transfer) - metoda badania interakcji między białkami

- Zasada tej metody opiera się na istnieniu transferu energii między dwiema fluorescencyjnymi cząsteczkami.

- Jeśli dwa białka są fluoroforami to wzbudzenie fluorescencji pierwszego z nich (donor) prowadzi pobudzenie drugiego (akceptor)

Warunku aby doszło do transferu

- nakładające się widmo emisji donora i wzbudzenia akceptora

- odległości między nimi rzędu 1-10 nm

Przypadek 1

Białka A i B są badane. Do A doczepiono białko fluorescencyjne emitujące barwę zieloną, a do białka B emitujące barwę żółtą

- widma nakłądają się, ale odległości między nimi nie są rzędu 1-10 nm

po wzbudzeniu donora światłem 405/440 nm widzimy emisje tylko donora światłem 475 nm.

Jeżeli odległość jest rzędu 1-10 nm

po wbudzeniu donora światłem jego emisja wzbudza akceptor i akceptor świeci na zółto

Struktura komórek bakteryjnych i eukariotycznych

Komórka bakteryjna

Materiał genetyczny - nukleoid - rozmieszczony w cytoplazmie, brak jądra, w cytoplazmie rybosomy, na zewnątrz błona komórkowa i ściana komórkowa.

Komóka eukariotyczna - ma jądro

Nukleod (DNA chromosomowy z superzwiązanymi domenami) - E.coli ~4700 kpz

superzwinięte domeny DNA nawinięte na histonopodobne białka

Oprócz chromosomu bakteryjnego mamy plazmidy - geny dodatkowe np. odporności na antybiotyki (plazmid F).

Główna, powtarzająca się jednostka strukturalna chromatyny to nukleosom.

Rdzeń tworzy osiem cząsteczek histonów (4 pary: H2A, H2B, H3, H4), nań nawinięty DNA, pomiędzy rdzeniami linkerowy (łącznikowy) DNA do niego jeszcze doczepiony histon H9.

U człowieka nić DNA ma ok. 2 m długości i zwinięta jest w 23 parach chromosomów

Całkowita długość 46 chromosomów metafazowych wynosi tylko 200 mikrometrów (um).

Organizacja genomu eukariotycznego

Nić DNA kondensuje - powstaje włókno nukleosomowe (10 nm) kondensuje - powstaje włókno 30nm, które kondensuje - powstaje chromatyna interfazowa, przy podziale kondensuje - skondensowany fragment chromosomu tworzący chromosom metafazowy.

Ile genów znajduje się w ludzkim genomie?

Pierwsze szacunki mówiły o 6 000 000 - 1964 r

potem mówiono o 100 000 - lata dziewięćdziesiąte

teraz mówi się że ilość genów między 20 000 - 30 000

Mamy ilość genów między kurą (ok 16 000 gen) a winogronami (30 000 gen)

Genom człowieka w liczbach

- cały genom człowieka ma ok 3,2 mld par zasad (bp)

- tylko około 1,5% DNA człowieka to geny kodujące białka, reszta to introny (fragmenty genów niekodujące białęk), geny kodujące RNA, sekwencje regulatorowe i DNA, którego funkcji nie znamy

- Chromosom nr 1 ma 345 milionów par zasad, chromosom nr 21 ma a<z 47 milionów par zasad

DNA mitochondrialne (mtDNA)

- mtDNA koduje białka biorące udział w wytwarzaniu ATP;

- występuje zwykle w postaci kolistej dwuniciowej cząsteczki;

- długość mtDNA

mtDNA człowieka 15kb

mtDNA drożdży 78 kb

mtDNA niekt.roślin > 3000 kb

- liczba kopii mtDNA na mitochondrium wynosi od kilku u większości organizmów do 30 u pierwotniaków z rodzaju Euglena

Genom mitochondrialny człowieka

mtDNA człowieka koduje informację o syntezie 13 białek związanych z fosforylacją oksydacyjną, 22 rodzajach tRNA, 2 rodzajach rRNA

Genom mitochondrialny jest kulisty, zwarty, jedyną sekwencją niekodującą jest tzw. lupa D, wykazuje on dużą zmienność, więc służy do porównywania pokrewieństwa i datowania filogenetycznego.

DNA chloroplastów (cpDNA)

- cpDNA koduje białka biorące udział w fotosyntezie oraz ekspresji informacji genetycznej (replikacja, transkrypcja, translacja)

- występuje w postaci kolistej

Przeciętna ilość genów na cpDNA wynosi ok. 124 w tym

4 geny kodujące rRNA

30 genów kodujących tRNA

90 genów kodujących białka

Wirusy DNA ssaków

Wirus brodawczaka ludzkiego (HPV) - dwuniciowa, kolista cząsteczka DNA

Wirus SV40 - dwuniciowa, kolista cząsteczka DNA - struktura jego genomu przypomina minichromosom pod mikroskopem elektronowym.

Adenowirus - dwuniciowa, liniowa cząsteczka DNA

Eukariotyczne wirusy RNA

Typ wirusa	Genom	Sposób replikacji	Rodzina wirusów	Przedstawiciele
Eukariotyczne ssRNA	ssRNA (nić +)	RNA → RNA	Picornaviridae	Rynowirus Wirus polio Wirus pryszczycy
		ssRNA (nić -)	RNA → RNA	Coronaviridae Rhabdoviridae Paramyxoviridae Filoviridae	Wirus SARS Wirus wścieklizny Wirus odry Wirus świnki Ebola Marburg

Retrowirusy

Genom stanowi RNA, otoczke stanowi białkowy kapsyd okryty bloną, na tym jeszcze kolce

Retrowirus zawiera enzym zwany odwrotną transkryptazą

Po wniknięciu wirusowe RNA w wyniku odwrótnej transkryptazy zostaje przepisane na wirusowe DNA i wtedy przenika do jądra i ulega integracji z genomem gospodarza.

Wiroidy - koliste cząsteczki RNA długości ok. 240-400 nt, niezawierające genów, nie zamknięte w kapsydach, rozprzestrzeniają się z komórki do komórki jako nagi RNA, np. wiroid łuszczycy kory drzew cytrusowych, hamujący ich wzrost;

Wirusoidy - koliste cząsteczki RNA długości ok. 320-400 nt, niezawierające genów, przemiszczające się z komórki do komórki w kapsydach wirusów pomocniczych → genomy wiroidów i wirusoidów, mają autokatalityczną aktywność rozcinania się.

Autokatalityczne cięcie RNA wiroidów i wirusoidów

Genomy są połączone w sposób głowa-ogon, tworzą one pofałdowaną strukturę która może się sama wyciąć bez dodatkowego enzymu → cięcie autokatalityczne → poszczególne genomy liniowe → cyrkularyzacja

Jak badać subkomórkową lokalizację i funkcje białek ssaczych?

Kamil Deryło

Zakład Biologii Molekularnej

Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej

Lublin

Plan prezentacji

1. Ogólny schemat eksperymentu

2. Izolacja DNA, projektowanie starterów, PCR, klonowanie, ssacze wektory ekspresyjne

3. Transformacja bakterii

4. Izolacja i oczyszczanie plazmidu

5. Podstawy hodowli komórek zwierzęcych.

6. Transfekcja

7. Mikroskopia konfokalna.

Dlaczego badanie lokalizacji białek może być interesujące?

1. Subkomórkowa lokalizacja → funkcja (błona komórkowa, jądro komórkowe)

2. Zmiana lokalizacji w czasie → fizjologia komórki (transport białek, podział komórki, apoptoza)

3. Zmiana lokalizacji zmieniona czynnikiem zewnątrznym → wpływ antybiotyków

Interakcje między białkami są kluczowe dla każdego procesu zachodzącego w komórce.

Jak możemy badać te interakcje in vivo?

Jak zobaczyć białka w mikroskopie?

- białko hybrydowe/białko fuzyjne

do DNA kodującego białko dołączamy plazmid kodujący białko fluorescencyjne (restryktaza, potem ligaza) - powstaje cząsteczka hybdrydowa - DNA kodujące badane + DNA kodujące fluorescencyjne → wprowadzamy do bakterii, namnażamy, rozbijamy bakterie, ekstrahujamy gen, wprowadzamy do komórki zwierzęcej, gen ulega ekspresji, widzimy pod mikroskopem świecące białko.

Projekt pracy magisterskiej:

„Charakterystyka ludzkiego białka X (subkomórkowa lokalizacja, funkcja, dynamika, interakcje z innymi białkami)”

Zaplanowanie eksperymentu

1. Jaki jest cel eksprymentu?

2. Z jakimi biomolekułami będziemy pracować?

3. Charakterystyka źródła materiału biologicznego

4. Jakie techniki będą używane?

5. Charakterystyka komórek z kŧórymi będziemy pracować.

Przygotowanie DNA kodującego białko X

1. Garbage in - garbage out - przygotowanie próbki DNA

2. Izolacja DNA genowego/ plazmidowego (wydajność + czystość = jakość)

3. Liza alkaliczna/kolumienki (zestaw Plasmid Mini)

Genomowe DNA

a) Liza komórki - zniszczenie ściany komórkowe, błony komórkowej → ekstrakt komórek

b) Centryfugacja w celu usunięcia resztek komórki → wirowanie ekstraktu kom → na górze mamy DNA, RNA, białka - resztki w osadzie

Możemy też mieszać z fenolem i stanie się to samo.

Wybór odpowiedniego wektora

- Wektor bakteryjny - plazmid

Plazmidy to pozachromosomowe cząsteczki DNA w komórce bakteryjnej nadające jej dodatkowe funkcję.

sekwencja ORI

sekwencja kodująca jakiś gen (np. odporności)

sekwencja polilinkera (sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne - tnące DNA w ściśle określonym miejscu)

Wybór odpowiedniego wektora

- Bakteryjny wektor ekspresyjny

Wektor zawiera sekwencję promotorową rozpoznawaną przez polimerazę DNA

Izolacja plazmidów

Mamy w ekstrakcie liniowe DNA i superskręcone plazmidy → alkalizacja pH do 12.5 z 12.0 → wiązania wodorowe się niszczą → pH 7.0 → z DNA robi się skręcona masa bo wiązania wodorowe nie odtworzyły się idealnie, plazmidom nic nie jest → wirowanie → na górze superskręcone plazmidy, na dole DNA

Elektroforeza plazdmidu.

Amplifikacja DNA kodującego białko X → reakcja PCR

- woda

- genomowe/plazmidowe DNA

- dNTP

- MgCl2

- polimeraza Taq

- bufor dla polimerazy Taq

Denaturacja

„A PCR recation starts with a denaturing step. Samples are heated to 94-96 C for one to several minutes.”

Przyłączenie primerów „forward and reverse”

polimeraza

Cięcie produktu reakcji PCR i wektora enzymami restrykcyjnymi

- DNA

- bufor dla enzymów

- BamHI

Hodowle komórkowe

Hodowle komórek - umożliwia utrzymywanie poza organizmem, czyli in vitro, żywych komórek fragmentów tkanek lub narządów. W powszechnym rozumieniu jest do hodowla zdyspergowanych komórek, rosnących w systemie jednowarstwowym (monolayer) lub w zawiesinie. Termin ten obejmuje hodowle wycinków tkankowych, hodowle narządowe, hodowle komórkowe pierwotne i hodowle linii kom.

Warunki hodowli

- Hodowle komórkowe prowadzi się w odpowiednich naczyniach hodowlanych

Transfekcja

Trans + infection = transfection

Lipofekcja

Zapewnienie komórkom optymalnych warunków do wzrostu i rozwoju.

Współczesne mikroskopy konfokalne do przyżyciowego obrazowania komórek.

Statyw ma odpowiednią temperaturę, dostarczanie CO2.

Laboratorium obrazowania żywych komórek

- mikroskop konfokalny

Podstawy fluorescencji

Promienie świetlne padają na substancję zdolną do fluorescencji → substancja przechodzi do stanu wzbudzonego → przechodząc do podstawowego emituje światło o mniejszej energii (dłuższa długość fali)

Główne drogi światła w mikroskopii konfokalnej

Źródło światła (laser) → szczelina (do detektora dociera światło tylko z jednej płaszczyzny - zapewnia ostrość obrazu) → światło pada na lustro dichromiczne (przepuszcza światło o jednej długości fali - emitowane przez próbkę - inne, jak światło lasera, odbija) → przez obiektyw na preparat → preparat emituje światło, przechodzi ono oprzez lustro dichromiczne i do obiektywu

Odkrycie GFP z meduzy Aequora Victoria - wyizolowano ekforynę emitującą swiatło niebieskie pod wpływem jonów wapnia oraz zielone białko fluorescencyjne - emitujące światło zielone po pochłonięciu niebieskiego.

Ekspresja GFP w E.coli i C. elegans - połączenie DNA gospodarza z DNA kodującym GFP - powstaje białko hybrydowe (fuzyjne)

Problemy z wild type GFP

Widmo absorpcji podobne do widma emisji

Widmo absorpcji cytotoksyczne (światło o wysokiej energii)

Skłonność do dimeryzacji

Rozwój i modyfikacje GFP

- poprzez mutacje punktowe - zamiany poszczególnych aminokwasów dały nam białka fluorescencyjne o całej palecie barw

Modyfikacje GFP

Optymalizacja ekspresji w różnych typach komórek

Optymalizacja właściwości spektralnych - absorpcja bardziej długofalowa, pojedynczy pik

Obserwacje mikroskopowe

Do badanego białka dołączony GFP

- możemy je zobaczyć w jądrze, w cytoplazmie mało

- albo tylko w cytoplazmie, w jądrze nie

- albo tylko w jąderkach

- albo tylko w cytoplazmie i jąderkach etc.

Możemy zaobserwować jak zmienia się lokalizacja białek po dodaniu antybiotyku - gdzieś zanika fluoresecencja, gdzieś się zwiększa, etc.

Składanie obrazu w 3D z wielu płaszczyzn (mikroskop konfokalny zbiera światło tylko z jednej płaszczyzny naraz)

Badanie ruchu organelli przez wybarwianie białek specyficznych dla danych organelli

- mitochondriów, aktyny, chromosomów

Obserwujemy w czasie - robimy zdjęcia w odstępach czasowych.

Jak zbadać dynamikę i zachowanie się badanego białka w komórce?

FRAP - Fluorescence Recovery After Fotobleaching - po potraktowaniu silnym światłem po jakimś czasie białko traci zdolność do fluorescencji (fotowybielanie = fotobleaching).

Tam, gdzie kierujemy silny laser, tam chromofor przestaje emitować światło, robi się ciemno - jeżeli cząsteczki białka są ruchliwe to fotowybielone dyfunduja do innych obszarów, a niefotowybielone dyfundują w miejsce gdzie były fotowybielone, świecenie wraca, do tego jest komputerowo wyznaczana krzywa.

Jeżeli są niemobilne (związane przez coś), nie ma dyfuzji, ruchu.

Czego możemy się dowiedzieć?

- Jak szybko poruszają się białka

- przez jakiś czas białka pozostają związane?

- jaki jest % białek związanych

- jak wpływają dodane do komórki substancje

Fotoaktywacja/fotokonwersja.

Konwersja molekuły w jednym rejonie, obserwować dyfuzję do innych rejonów - obserwowanie, jak szybko przemieszczają się białka

Badanie interakcji między białkami - dlaczego kolokalizacja nie wystarcza

rozdzielczość jest za mała = 200 nm

białka mają 1- 2 nm.

Foerster Resonsnce Energy Transfer

Zrobimy dwa białka fluoresecncyjne, donor i akceptor,

wzbudzamy donor → przekazuje on energię akceptorowi i wraca do stanu podstawowego → akceptor świeci, po czym wraca do stanu podstawowego

Donor nie świeci przy oldegłości < 10nm.

Widmo emisji donora musi się pokrywać z widmem akceptora .

Standard do FRETa zestaw add gena Cerulean Venus

FRET - Zasada fotowybielania akceptora

Mamy donor (D) i akceptor (A), energia D idzie do A, wybielamy (bleaching) A i D odżywa, zaczyna świecić.

Ekspresja informacji genetycznej

U Prokariota

Fragment DNA (gen - ciągły) zawieszony w cytoplazmie ulega transkrypcji i powstaje mRNA, mRNA ulega translacji i powstaje białko. Procesy transkrypcji i translacji nie są oddzielone od siebie ani przestrzennie, ani czasowo.

U Eukariota

W cytoplazmie mamy wydzielone błonami jądro, w jądrze siedzi DNA → jednostka transkrypcyjna składa się z intronów (elementy niekodujące - usuwane w trakcie dojrzewania RNA) i egzonów (elementy kodujące - gen nieciągły) → ulega transkrypcji i powstaje pierwotny transkrypt RNA → następuje modyfikacja potranskrypcyjna → dodawanie czapeczki na końcu 5', splicing (wycinanie intronów) RNA, poliadenylacja na końcu 3' → powstaje mRNA z czapeczką na końcu 5' i z poliadenylowanym końcem 3' → następuje eksport tej cząsteczki z jądra do cytoplazmy, a następnie translacja, w wyniku której powstaje białko.

Rodzaje chromatyny:

- euchromatyna - luźna, aktywna transkrypcyjnie - jasna na elektrogramie, bardziej w środku jądra

- heterochromatyna - skondensowana, brak transkrypcji - ciemna na elektrogramie, skupiona bliżej błony jądrowej

Mechanizmy regulujące dostęp do genów:

- metylacja DNA

- modyfikacja post-translacyjna histonów

- kompleksy remodelujące

- warianty histonów (zmiana histonów)

- niekodujące RNA, ncRNA

chromosom → chromatyna → składa się z nukleosomów → cytozyny w DNA pod wpływem enzymów metylotransferaz mogą ulec metylacji

Histony mogą zaś zostać metylowane, fosforylowane, acetylowane.

Transkrypcja możliwa:

- chromatyna aktywna (eu-)

- brak metylacji cytozyn

- acetylacja histonów

Transkrypcja zahamowana:

- chromatyna skondensowana (hetero-)

- metylacja cytozyn

- deacetylacja histonów

Obie formy mogą w siebie przechodzić w zależności od potrzeb organizmu (ścisła regulacja)

Remodelowanie chromatyny - modyfikacja lub zmiana położenia nukleosomów w procesie zależnym do energii z ATP.

Mamy 3 ściśnięte nukleosomy (histony: H2A, H2B, H3, H4) nawinięte na nie ściśle DNA + remodeler chromatyny (kompleks białkowy) + ATP → zapętlanie, ślizganie, uwalnianie → pozycja otwarta przesunięta, pozycja otwarta stara, stara zamknięta pozycja

Może też nastąpić wymiana histonów.

Transkrypcja

- synteza RNA na matrycy DNA, katalizowana jest przez polimerazę RNA zależną od DNA.

- synteza RNA zachodzi zawsze w kierunku od końca 5' cząsteczki RNA do jej końca 3'

- tylko jedna nić DNA jest transkrybowana (nić wiodąca),

- DNA wyznacza kolejność w jakiej reszty nukleotydowe zajmują swoje miejsce w powstającym polirybonukleotydzie, dzięki komplementarności zasad.

Nić kodująca, sensowna 5' → 3', non-template strand.

Nić antysensowna, niekodująca 3' → 5'

Te dwie nici są ze zobą połączone wiązanami wodorowymi - potrójnymi między cytozyna a guaniną, podwójnymi między adeniną a tyminą. → transkrypcja, rozplątujemy nici DNA, polimeraza doczepia się do nici antysensownej i na tej matrycy syntetyzuje z komplementarnymi do niej nukleotydami; nić RNA → powstaje RNA o kolejności nukeotydów takiej samej jak w nici sensownej, tyle że tymina zastąpiona jest uracylem.

Tworzenie wiązania fosfodiestrowego w trakcie transkrypcji - znaleźć mechanizm reakcji.

Od 3' do 5' matrycy „non-template strand” DNA tworzy się nić od 5' do 3' RNA

Jednostka transkrypcyjna - sekwencja DNA rozciągająca się od promotora do terminatora, może zawierać jeden lub kilka genów.

DNA: 5' → 3' - nić sensowna

3' → 5' - nić antysensowna

upstream - sekwencja powyżej promotora; dowsntream - region poniżej promotora

promotor → pierwszy nukleotyd po promotorze (+1); region transkrybowany (ulega transkrypcji i powstaje RNA) → terminator

RNA powstałe po transkrypcji taka sama sekwencja jak nić sensowna.

Etapy transkrypcji

- rozpoznanie promotora - związanie polimerazy RNA do obu nici DNA w rejonie promotora (kompleks zamknięty) i rozplecenie DNA w rejonie promotora (kompleks otwarty)

- inicjacja - synteza pierwszych 2-9 nukleotydów

- elongacja - opuszczenie przez polimerazę RNA promotora i wydłużanie łańcucha RNA

- terminacja - zakończenie syntezy RNA

Polimeraza przemieszcza się w tzw. bąblu transkrypcyjnym.

Tam gdzie polimeraza RNA przeszła, DNA się zwija na powrót, a tam gdzie siedzi polimeraza RNA, nić matrycowa i kodująca rozplatają się, syntetyzuje się RNA na nici matrycowej, powstaje hybrydowa helisa RNA-DNA, powstającego RNA z nicią matrycową.

Budowa bakteryjnej polimerazy RNA zależnej od DNA

Podjednostki polimerazy bakteryjnej:

alfa - składanie enzymu (40kDa)

beta - centrum katalityczne (155 kDa)

beta prim - wiązanie DNA (160 kDa)

omega - utrzymywanie aktywności enzymu (10 kDa)

sigma - rozpoznawanie promotora (32-90 kDa)

Holoenzym: dwie podjednostki alfa, jedna beta, jedna beta prim, jedna omega, jedna sigma.

Czynniki sigma

sigma70 - podstawowy czynnik E.coli zaangażowany w rozpoznawanie promotorów genów ulegających konstytutywnej transkrypcji

sigma32 - rozpoznaje promotory genów kodujących białka szoku termicznego

sigma54 - syntetyzowany przez Klebsiella pneumoniae w czasie głodu azotowego, stymuluje ekspresję genów asymilacji azotu

sigmaF i sigmaE - syntetyzowane przez Bacillus subtilis, stymulując ekspresję genów niezbędnych do utworzenia spor

Promotor rozpoznawany przez czynnik sigma70 E.col

TTCACA …..........16-18 pz...........TATAAT...........5-8pz.......CG/AT

sekwencja -35 sekwencja -10 + 1

sekwencje zgodne promotorów E.coli (najbardziej zachowawcze sekwencje zaznaczono tłustym drukiem)

Terminacja transkrypcji u E.coli

Terminacja z udziałęm terminatora samodzielnego

DNA 3' → 5' - nić matrycowa

5' → 3'

→ mamy sekwencję odwróconego palindromu (czytaną tak samo od 5 do 3, jak i od 3 do 5), umożliwiającą oddysocjowanie polimerazy od kompleksu transkrypcyjnego a potem AAAA

→ transkrypcja odwróconego palindromu daje RNA o strukturze spinki do włosów - jednoniciowe, potem dwuniciowe, między tym wiązania wodorowe - dalej, przy końcu 3' same uracyle

Dalej nie pójdzie, spinka do włosów się tworzy i nie zrobi się hybrydowa helisa (?), wiązania też są słabe, bo dalej idą same pary A-U; kompleks się rozpada, polimeraza się odłącza.

Terminacja zależna od Rho

(kiedy mamy słabszy palindrom), ale nie mamy samej sekwencji A-U potem

do RNA dołącza się białko Rho

→ kompleks elongacyjny zatrzymuje się na pętli spinki do włosów → Rho rozbija wiązania wodorowe między zasadami RNA i DNA.

Dojrzewanie pre-rRNA u E.coli

Pre-rRNA: (działa endonukleaza III)-sekwencja 16SrRNA-(III)-tRNA-(III)-sekwencja 23SrRNA(III)(P)sekwencja 5SrRNA (F)

Dojrzewanie pre-tRNA u E.coli

5'- mamy sekwencję dodatkową odcinaną przez RNazę P → sekwencja dojrzała tRNA → sekwencja CCA odcinana przez RNazę Z → sekwencja odcinana przez RNazę D

Inhibitory transkrypcji u bakterii:

- ryfampicyna - działa na podjednostkę beta polimerazy RNA i blokuje tworzenie pierwszego wiązania fosfodiestrowego

- aktynomycyna D - interkalator, wiąże się do DNA w regionach bogatych w pary G-C, uniemożliwiając wykorzystanie takiego DNA jako matrycy w syntezie RNA.

Polimerazy eukariotyczne w odróżnieniu od bakteryjnej polimerazy RNA nie wiążą się same z DNA.

Każda polimeraza eukariotyczna współdziała z określoną grupą czynników transkrypcyjnych

TF I (ang. transcription factor I) - wspołdziala z polimerazą I

TF II - współdziała z polimerazą II

Promotor polimerazy I

Inicjacja transkrypcji przez polimerazę RNA I

UBF → TBP - TATA binding protein + trzy cząsteczki TAFs - TBP associated factors → polimeraza RNA I

Polimerazy RNA zależne od DNA (Eukariota)

Polimeraza	Transkrybowane geny
Polimeraza RNA I (RNAP I)	geny kodujące 25S/28S, 5,8S i 18S rRNA
Polimeraza RNA II (RNAP II)	geny kodujące białka: geny kodujące większość małych jądrowych RNA (snRNA), miRNA
Polimeraza RNA III (RNAP III)	geny kodujące tRNA, 5S rRNA, U6-snRNA, małe jąderkowe RNA (snoRNA), miRNA
Polimeraza RNA mitochondrialna i chloroplastowa	?

Polimeraza RNA I - niewrażliwa na alfa-amanitynę

polimeraza RNA II - bardzo wrażliwa na alfa-amanitynę, kilka-kilanaście nM

polimeraza RNA III - wrażliwa na duże stężenia - 1µM.

Dojrzewanie pre-rRNA

- cięcia endo i egzonukleolityczne

- dodawanie grup metylowych

- przeksztalcanie urydyny w pseudourydynę

- splicing

Metylacja pre-rRNA

C/D snoRNA (ang. small nucleolar RNA)

snoRNA składa się z boxu C, sekwencji komplementarnej do rRNA, boxu D

przyłączają się komplementarne zasady rRNA

powstaje kompleks snoRNA-rRNA

następuje metylacja

kompleks snoRNA-zmetylowane w miejscu komplementarnym rRNA

zmetylowane rRNA odłącza się

Pseudourydylacja pre-rRNA

ACA snoRNA

snoRNA tworzy tu pętle

Introny

gen bakteryjny na dwuniciowym DNA składa się z promotora i rejonu kodującgo - są ciągłe

5' → 3'

3' → 5'

gen eukariotyczny na dwuniciowym DNA jest nieciągły - zawiera promotor i rejony kodujące (eksony) naprzemiennie z rejonami niekodującymi (intronami)

5' → 3'

3' → 5'

Typ intronu Miejsce występowania

Introny GU-AG Jądrowy eukariotyczny pre-rRNA

Introny AU-AC Jądrowy eukariotyczny pre-mRNA

Grupa I Jądrowy eukariotyczny pre-rRNA, RNA organellarny

Grupa II Jądrowy eukariotyczny pre-rRNA, RNA organellarny

Splicing pre-rRNA

Zachodzi autokatalitycznie - nie uczestniczy żaden inny enzym białkowy

Bierze udział guanozyna z GTP, GDP, GMP

pre-rRNA 5'-ekson-intron-ekson-3'

Guanozyna przyłacza się do kńca 5' intronu i atakuje wiązanie fosfodiestrowe pomiędzy eksonem poprzedzającem a intronem, w wyniku tego ataku wiązanie zostaje przecięte → wolny ekson z grupą OH, intron z dołączoną guanozyną i drugi dołączony ekson

grupa OH eksonu 1 atakuje wiązanie fosfodiestrowe między intronem a eksonem 2 → przecięcie tego wiązania → eksony łączą się, intron z guanozyną zostaje usunięty

Intron ostatecznie ulega degradacji.

Ważna jest natywna struktura drugorzędowa i trzeciorzędowa intronu - jest ona bardzo ważna, jeżeli się ją rozplecie za pomocą czynników denaturujących, splicing nie zajdzie.

Splicing pre-rRNA zachodzi w trzech transferach.

Nagroda Nobla z chemii w 1989

„za odkrycie katalitycznych wlaściwości RNA”

Thomas R. Cech, Sidney Altman.

Promotor podstawowy dla polimerazy RNA II

Do promotora podstawowego przyłączają się podstawowe (ogólne) czynniki transkrypcyjne (GTFs - ang. general transcription factors) i polimeraza RNA II tworząc kompleks preinicjacyjny.

BRE - Miejsce rozpoznania TFIIB (-37 do -32) - Sekwencja TATA (-31 do-26) - Sekwencja Inr - inicjatora (-25 do +2) - MTE - Miejce Motywu 10 - Rdzenne Miejsce Promotora w dół od sekwencji inicjatora DPE

Elementy regulatorowe

Moduły promotora podstawowego, elementy regulacyjne i enchancery u Eukariota

enhancer elementy regulacyjne BRE-Sekwencja TATA-INR

-1000...-500 -500... -70 +1

Elementry regulacyjne:

Moduły konstytucyjne → Aktywatory konstytutywne

(jeżeli znajdują się przed genem ulegającym przed genem ekspresji konstytutywnie [zawsze])

Moduły odpowiedzi →

Moduły komórkowo specyficzne → Aktywatory regulacyjne

Moduły wiążące regulatory rozwoju →

Jeden enhancer - wzmocnienie wielu genów naraz, elementy regulacyjne tylko w odniesieniu do jednego genu

Sekwencja wzmacniająca może aktywować gen działając:

- z dużej odległości

enhancer działa na promotor mimo ze jest od niego oddalony i powoduje wzmocnienie ekspresji jednostki transkrypcyjnej

- niezależnie od orientacji

- poniżej lub powyżej genu, który aktywuje.

Sekwencje wzmacniające Sekwencje wyciszające

(enhancery) (silencery)

aktywatory represory

koaktywatory korepresory

Subst. wzmacniająca lub element regulacyjny → aktywator → koaktywator

Subst. wyciszająca lub element regulacyjny → represor → korepresor

Do enchancera przyłącza się białko aktywatora - wygięcie nici DNA, dołącza się cząsteczka mediatora (koaktywatora) - nić się ugina, kompeks ten oddziaływuje z polimerazą II lub komplekesem promotora TATA-GTFy- pol II

Białka aktywatorowe:

- wspomagają składanie kompleksu głównych czynników transkrypcyjnych i polimerazy RNA

- zmieniają strukturę chromatyny

Mediator - most molekularny

- Powszechny u eukariontów - występuje zarówno w drożdżach, jak i u ssaków

- Kompleks 25-30 białek (u ssaków co najmniej siedem różnych kompleksów Mediatora);

- wymagany do transkrypcji większości genów transkrybowanych przez polimerazę II

- bierze udział zarówno w regulacji pozytywnej jak i negatywnej, chociaż powszechnie nazywany koaktywatorem, to jest również korepresorem jak i podstawowym czynnikiem transkrypcyjnym.

Mediator, oddziaływuje z RNAPII, TFIIF

Modułowa struktura promotora genu ludzkiej insuliny:

GC-A5-OCT-E2-A3-CRE-A2

Niektóre czynniki transkrypcyjne mogą uczestniczyć zarówno w aktywacji jaki i represji tranksrypcji

T - hormon tarczycy (ang. thyroid hormone)

TR - receptor hormonu tarczycy (ang. thyroid hormone receptor)

TRE - element odpowiedzi na hormon tarczycy (ang. thyroid hormone response element)

jeżeli TR bez dołączonego T wiąże się z TRE → hamuje transkrypcję

jeżeli TR z dołączonym T wiąże się z TRE (zmiana konfiguracji, mogą się dołączyć cząsteczki koaktywatorów) → aktywuje transkrypcję

Czynniki transkrypcyjne zbudowane są z kilku domen

Główne domeny czynników transkrypcyjnych to:

- domena wiążąca DNA

- domena transkatywacyjna

Dodatkowe domeny

- dimeryzacyjna

- regulatorowa (wiązania hormony, fosforylacji)

- sygnał importu/eksportu jądrowego

Klasyfikacja białek wiążących (specyficznie) DNA

- ze względu na domeny wiążące DNA

HTH (ang. helix-turn-helix, helisa-skręt-helisa)

palec cynkowy (ZF, ang. Zn finger)

domena zasadowa

domena TBP

- ze względu na domeny dimeryzacji

HLH (ang. helix-loop-helix, helisa-pętla-helisa)

zamek leucynowy (LZ, ang. leucine zipper)

- wielu nie daje się sklasyfikować

Domena typu helisa-skręt-helisa (HTH)

- pierwsza zidentyfikowana struktura wiążąca DNA

- dwie alfa helisy połączone ostrym skrętem, pierwsza helisa kontaktuje się ze szkieletem fosforanowym, druga dokładnie pasuje do rowka większego DNA w miejscu występowania specyficznej sekwencji,

- wysoce konserwatywny motyw wiążący DNA występujący w wielu prokariotycznych i eukariotycznych białkach wiążących DNA (represor laktozowy, regulatory)

Domena typu palec cynkowy

- palec cynkowy - najpowszechniejsza domena wiązania DNA u Eukariota

- składa się z beta-kartki, za którą następuje ostry skręt i alfa-helisa, atom cynku utrzymują 2 Cys i 2 His (Cys2His2) lub 4-6 Cys (Cys 4-6)

W niektórych białkach występują wielokrotne powtórzenia tej domeny.

(TFIIIA - dziewięć klasycznych palców cynkowych [Cys2His2]

receptory homonów steroidowych [Cys4-6])

Białko TBP (ang. TATA-binding protein)

- wiąże sekwencje TATA w promotorach, jest też niezbędne do inicjacji transkrypcji z promotorów pozbawionych TATA;

- wchodzi w skład TFIID, ale także ogólnych czynników dla pol I i pol III RNA;

- pojedynczy peptyd z częścią środkową w formie zgiętej beta-kartki, obejmującej DNA niczym siodło, z dwiema helisami po bokach 'siodła' i na końcach;

- lekko rozkręca helisę DNA i silnie ją zagina

Domena typu zamek leucynowy

- zamek leucynowy - złozony z alfa-helis dwu oddzielnych monomerów, które dimeryzują dzięki leucynom regularnie rozmieszczonym na obu helisach, zawierają też reszty argininy, które przytrzymują szkielet fosforanowy po obu stronach rowka większego

- rozpoznają i wiążą palindromowe sekwencje DNA w rowki większym

- zamykają się na DNA jak para nożyczek, albo zamek prostopadle do podwójnej helisy

- np. AP1, drożdżowy czynnik transkrypcyjny GCN4, C/EBP (ang. CCAAT enhancer-binding protein)

Regulacja aktywacji czynników transkrypcyjnych

a) brak czynnika: w pierwszej tkance jeden gen jest niekatywny, bo nie ma czynnika, w tkance drugiej czynnik obecny, migruje do jądra, wiąże się z DNA i aktywuje gen (gen ulega ekspresji)

b)czynnik nieaktywny - syntetyzowany jest cały czas w formie nieaktywnej, pod wpływem pewnych bodźcow jest aktywowany, migruje do jądra, wiąże się z DNA, gen staje się aktywny (gen ulega ekspresji)

Regulacja aktywności czynników transkrypcyjnych

aktywacja czynnika w wyniku:

- związania liganda - niektywny czynnik, nieaktywny gen - wiąże się ligand, czynnik z ligandem zmienia komfornację, wiąże się z genem, gen staje się aktywny.

- oddysocjowania od inhibitora - czynnik nieaktywny związany z inhibitorem, po oddyscocjowaniu zmienia konformację, wiąże się z genem, gen staje się aktywny.

- modyfikacji chemicznej - czynnik nieaktywny po modyfikacji wiąże się z genem, gen staje się aktywny.

- cięcia prekursora

Inicjacja transkrypcji przez polimerazę RNA II

promotor podstawowy z sekwencją TATA - jednostka transkrypcyjna → start transkrypcji

dołącza się TFIID

TFIID = TBP + TAFs

TBP łączy się z TATA,

TAFsy, białka towarzyszące TBP, dodatkowe białka o masach cząsteczkowych: 250, 150 - wiążą się do sekwencji inicjatorowej, 60, 40 - wiążą się do sekwencji DPE, 110, 80, 24, 30

Kompleks ten łączy się do sekwencji promotorowej, co umożliwia przyłączenie kolejnych czynników, TFIIA i TFIIB, po ich dołączeniu mogą się dołączyć: TFIIF z dołączoną polimerazą RNA II i inne czynniki, także TFIIE i TFIIH

polimeraza RNA II zawiera ogon CTD - największa podjednostka polimerazy II mająca reszty seryn mogące ulec fosforylacji,

do ogona CTD dołączają się reszty fosforanowe z UTP, ATP, CTP, GTP - przejście ze stadium inicjacji do elongacji, ma on właściwości helikazy - rozplatania DNA → zaczyna powstawać RNA, transkrypcja

DNA (inicjacja transkrypcji przez RNAP II)

+ TF II D (TBP + TAFs) → + TF II A + TH II B → + TF II F + RNAP II → + TF II E + TF II H

Elongacja transkrypcji przez polimerazę II

- podstawowe zasady elongacji transkryptów - takie same dla bakterii i eukariontów, istotna różnica dotyczy długości transkryptów

- u bakterii transkrypty długości do kilku kpz - czas transkrypcji do kilku minut

- u ekariontów transkrypty do 2400 kpz (liczne introny) - czas transkrypcji do 20 godzin, co wymaga dużej stabilności kompleksu transkrypcyjnego

- w jądrze komórkowym przerywaniu i zatrzymywaniu polimeryzacji przeciwdzialają czynniki elongacyjne (np. P-TEFb, Elongina A, ELL, TFIIS).

Dojrzewanie pre-mRNA (hnRNA ang. heterogenous nuclear RNA)

- Tworzenie czapeczki na końcu 5' transkryptu (ang. capping)

- Splicing (składanie pre-mRNA)

- Poliadenylacja końca 3' transkryptu

- Redagowanie (ang. editing)

Budowa „czapeczki” (m⁷G)

Gppp + pppN → (transferaza guanylilowa) → GpppN → metylotransferaza guaninowa → 7MeGpppN - czapeczka typu 0 - guanozyna z grupą metylową przy pozycji siódmej guaniny, połączona jest ona wiązaniem 5'-5' trójfosforanowym z kwasem nukleinowym, mRNA

Rola:

- zabezpiecza przed działaniem egzonukleaz

- ułatwia asocjacje miejsca 5' splicingowego z U1 snRNA

- stanowi sygnał transportu do cytoplazmy

- stymuluje inicjację translacji.

Introny w genach człowieka

Gen	Długość (kb)	Liczba intronów	Część genu, jaką stanowią introny [%]
Insulina	1,4	2	67
Albumina surowicy	18	13	89
Kolagen typu VII	31	117	71
Dystrofina	2400	48	>99

Budowa intronów GU-AG

Intron GU-A-AG

Końcowka 3' eksonu (A/C A G)- intron: 5'GU PuAGU (...) miejsce rozgałęzienia CUPuAPy (...)trakt polipirymidynowy Py rich (…) akceptorowe miejsce składania: NC AG3' koniec 5' eksonu: (G)

Ogólny schemat splicingu pre-mRNA

Pre-mRNA 5'-ekson-intron GU—A—AG- ekson-3'

etap I: adenozyna atakuje GU

tworzy się struktura lassa - wiązanie pomiędzy guanozyną a adenozyną,

wolna grupa OH eksonu poprzedzającego atakuje miejsce splicingowe 3'

dochodzi do połączenia eksonów, lasso zostaje uwalnianie → likwidacja rozgałęzienia, degradacja.

Synteza ludzkiego snoRNA U16

Gen dla białka rybosomalnego L1

DNA Egzon - Intron 3' - Egzon

Część intronu przy końcu 3' to sekwencja U16 snoRNA

Transkrypcja

Powstaje pre-mRNA Egzon - Intron 3' - Egzon

Splicing

Powstaje mRNA i lasso intronu

przetwarzanie intronu

powstaje snoRNA - U16 i jakieś nieprzydatne skrawki

Błędy w splicingu

Pominięcie egzonu

Egzon 1 - Intron - Egzon 2 - Intron - Egzon 3

Egzon 2 został wycięty razem z intronami: zostaje Egzon 1 połączony z Egzonem 3

Egzon 1 - Egzon 3

Wybór kryptycznego miejsca splicingu → miejsce w egzonie przypomina koniec intronu, może zostać błędnie rozpoznane

Egzon 1- Intron - Egzon 2(w środku kryptyczne miejsce splicingu)

Lasso tworzy się w miejscu kryptycznego miejsca splicingu i część egzonu od intronu do niego zostaje wycięta wraz z intronem. Powstaje RNA: Zawierajace Egzon 1 połączony z drugą cześcią Egzonu 2

Egzon 1-część Egzonu 2

Rola snRNP w splicingu pre-RNA

snRNP = snRNA (small nuclear RNA) + białka (proteins) - kompleksy

Kompleks angażujący:

5'-Egzon-Intron z przyłączonym U1-snRNP na końcu 5';

dalej w miejscu rozgałęzienia (tam gdzie adenozyna) przyłącza się białko, SF1;

dalej U2AF, gdzie szlak polipirymidynowy, koniec 5'-Egzon-3

następnie U2-snRNP przyłącza się tam, gdzie SF1, do miejsca rozgałęzienia → dochodzi do oddziaływań między U1-snRNP i U2-snRNP

(5') (3')

U1-snRNP

Egzon

U2-snRNP

SF1

Intron

U2AF

szlak polipirymidynowy

dołączenie się kolejnych kompleksów: U4/U6-snRNP i U5-snRNP → kompleksy te przyciągają się, dochodzi do zbliżenia końca 5' i 3' i miejsca rozgałęzienia → powstaje spliceosom

Rola białek SR w splicingu w pre-mRNA

5'-intron z dołączonymi białkami - eksonów wzmacniacz splicingu (ESE) - „jak Yoda mówisz mój padavanie”

Do ESE przyłączają się białka SR → umożliwia to rozpoznanie SF1 i U2AF-om końca 3' intronu: traktu polipirymidynowego, miejsca rozgałęzienia.

Introny AU-AC

- Znalezione jak dotąd w ok. 20 genach u człowieka, roślin i Drosophila

- Ich wycinanie przebiega identycznie z intronami GU-AG

- Odmienny zestaw snRNP (?)

Alternatywny splicing

DNA → Exon 1-Intron-Exon 2-Intron-Exon 3-Intron-Exon 4-Intron-Exon 5

pre-mRNA → Exon 1-Intron-Exon 2-Intron-Exon 3-Intron-Exon 4-Intron-Exon 5

Alternatywny splicing: mogą powstać cząsterczki mRNA o różnej kolejności eksonów:

12345 → po translacji powstaje białko A

1245 → po translacji powstaje białko B

123Int5 → po translacji powstaje białko C

Różne warianty białka to izoformy.

Możliwości alternatywnego splicingu RNA:

- wycięcie lub pozostawienie intronu - jeden intron zostaje i staje się egzonem

- wycięcie lub pozostawienie eksonu - jeden egzon jest usuwany wraz z przylegającym intronem

- wzajemne zastępowanie eksonów - wycina się eksony z intronami i zamienia eksony miejscami

- alternatywne miejsce splicingu - wycinane jest np. pół intronu - działa jak kryptyczne miejsce splicingu, tyle że nie jest to proces patologiczny.

- trans-splicing - łączone są ze sobą eksony pochodze pierwotnie z 2 różnych cząsteczek RNA.

Poliadenylacja końca 3' mRNA eukariotycznego

Pre-mRNA: 5'-(...) - AAUAAA - CA - GU - 3'

Składanie kompleksu poliadenylującego:

Do miejsca AAUAAA dołącza się CPSF, do CA-polimeraza poli(A), na nią siadają białka: PABP, CstF siada na dinukleotyd GU, koniec 3' jest zbędny i zostaje odcięty - wszystko za nukleotydem CA

Poliadenylacja:

poliadenylowane mRNA: 5'- (…) - AUAAAA - CAAAAAAAAAAAA, polimeraza poli(A) dołącza kolejne adenozyny, na niej siedzi białko PABP

Tworzenie końca 3' mRNA histonów

Sygnały cięcia:

trzon o długości 6 pz - 4-nukleotydowa pętla - ok. 12 nukleotydów - CAAGAAAGA - 3'

Cięcie z udziałem U7-snRNA

U7-snRNA ma sekwencję CUUUCU, która dołącza się do GAAAGA - (? dalej jest coś czego nie rozczytałam przy przepisywaniu, sorry ?) - reszty adenylowe nie są dodawane

Redagowanie mRNA

procesy powodujące zmianę informacji kodowanej w cząsteczce mRNA

Funkcje redagowania

- tworzenie nowych kodonów start lub stop

- usuwanie kodonów stop

- przesuwanie/tworzenie ramek odczytu

- zmiany w kodowanych aminokwasach

Mechanizm konwersji zasad:

deaminacja:

cytozyna + H₂O → urydyna + NH₃

5-metylocytozyna + H₂O → tymina + NH₃

adenozyna + H₂O → inozyna + NH₃

bądź aminacja_;

Redagowanie transkryptu apolipoproteiny B

kodon #1...gen apolipotroteiny B...kodon #4564

Edycja zachodzi w kodonie #2153 CAA

Transkrypcja zachodzi tak samo w wątrobie i jelicie, następnie:

a) w wątrobie - mRNA nie ulega edycji → po translacji powstaje apolipoproteina B-100; 4562 aminokwasy

funkcja: transport cholesterolu w krwi

b) w jelicie - niezedytowane mRNA ulega edycji RNA - na skutek tego kodon #2153 CAA (=Gln) ulega wymianie na UAA (=STOP) → pod wpływem translacji powstaje apolipoproteina B-48, 2152 aminokwasy, funkcja: absorpcja lipidów z jelita.

Mechanizm redagowania poprzez insercję/delecję nukleotydów.

Pan-editing - readagowanie na wielką skalę (mitochondria pierwotniaków)

Dodawanie lub usuwanie U - bierze w tym udział guideRNA (gRNA), które wiąże się z pre-mRNA, naznacza on miejsce w pre-mRNA gdzie ma dojść do zmiany, tam działa endonukleaza, następnie działa

- egzonukleaza - wycina U

- UTP + TUT-aza (transferaza) → dodaje U

Następnie następuje sklejenie porozczinanych kawałków.

Od DNA do mRNA - struktura eukariotycznego mRNA

DNA: promotor->Exon 1-Intron 1-Exon 2-Intron 2-Exon 3 (sekwencja ulegająca transkrypcji - gen podzielony intronami: od Exonu 1 do Exonu 2)

Transkrypcja

pierwotny transkrypt:

Exon1( zawiera kodon AUG - start dla translacji)-Intron 1-Exon 2-Intron 2-Exon3(zawiera kodon UGA, UAG lub UAA - stop translacji)

Dojrzewanie mRNA

Dojrzały mRNA: Czapeczka(m⁷G)-5'UTR(region 5' nie ulegający translacji)-część Exonu 1 od kodonu start (AUG)-Exon 2-część Exonu 3 od kodonu stop (UGA/UAG/UAA)-3'UTR (region 3' nie ulegający translacji)-AAA-AAA(ogon poliA)

Struktura bakteryjnego mRNA:

5'UTR-Białko 1-Białko 2-Białko 3-UTR3'

Przed genem kodującym każde białko ma oddzielne miejsce startu translacji (inicjacji).

Promotor polimerazy III

- geny dla 5S rRNA wewnątrz sekwencji kodującej - Box A, Box C

- geny dla tRNA wewnątrz sekwencji kodującej - Box A, Box D

- gen dla U6-snRNA - PSE i TATA, pod sekwencją kodującą

Inicjacja transkrypcji przez polimerazę RNA III

Gen dla tRNA

A-Box, B-Box → dołączają się czynniki TFIIIC → dolącza się TFIIIB: kompleks z 3ech białek: TBP, BRF, B^cośtam → dołącza się on przed A-Boxem, dołącza się polimeraza III RNA

Dojrzewanie pre-tRNA

Modyfikacja chemiczna nukleotydów

Urydyna → rybotymidyna (T)

Splicing pre-tRNA

Splicing tRNA oddzielnych aktywności nukleazy i ligazy. Wiązania ekson-intron są wycinane przez nukleazę, tworząc 2', 5'-cykliczny fosforan i koniec 5'-OH.

Terminacja transkrypcji genów eukariotycznych

- terminacja transkrypcji genów grupy I

(?znowu nie mogę siebie doczytać?) dołączenie się PTRF powoduje oddysocjowanie polimerazy i transkryptu od matrycy DNA

- terminacja transkrypcji genów grupy II - związana z poliadenylacją końca 3' transkryptu

- terminacja trankrypcji genów grupy III - transkrypt odcinany przez polimerazę

Inhibitory transkrypcji w komórkach eukariotycznych:

alfa-amanityna - wiąże się do RNAPII w pobliżu centrum katalitycznego, jest nieodwracalnym inhibitorem, gdyż uruchamia degradację największej podjednostki RNAPII, do której się wiąże (inhibitor bardzo selektywny ale powoli działający)

aktynomycyna D - interkalator, wiąże się się do DNA w regionach bogatych w geny G-C, uniemożliwiając wykorzystanie takiego DNA jako matrycy w syntezie RNA (inhibitor szybko działający, malo selektywny)

DRP (5,6-dichloro-1-beta-Ribo-furanosyl-Benzimidazole) - hamuje elongację transkrypcji katalizowaną przez RNAPII, ponadto upośledza dojrzewanie rRNA (inhibitor szybko działający lecz mało selektywny)

Flavopiridol - jw.

Tryptolid - izolowany z rośliny Trypterygium wilfordii (?polskiej nazwy nie doczytam?) stosowanego w tradycyjnej medycynie chińskiej hamuje inicjację transkrypcji prowadzoną przez RNAPI i RNAPII (średnia szybkość i selektywność).

Model kompleksu poru jądrowego (NPC ang. nuclear pore complex)

- cytoplazmatyczne filamenty - dołączone do cytoplazmatycznego pierścienia

- cytoplazmatyczny pierścień w zewnętrznej błonie

- spoke-ring assembly (?) - kompleks poru jądrowego, w błonie jądra (transbłonowy)

- na środku pierścień środkowy - łączy poszczególne elementy

- w środku pierścienia środkowego centralny transporter - transbłonowy, centralny kanał (?dalej nie mogę rozczytać?)

- do wewnętrznej błony jądrowej zakotwiczony pierścień jądrowy

- do tego doczepiony jądrowy koszyk (kosz)

NPC kręgowców zbudowane są z około 30 różnych białek z nukleoporynami, które występują w 8 lub 16 (czasem nawet 32) kopiach na NPC

Nukleoporyny (nups) podzielono na trzy klasy

- FG - zawierają domeny bogate w powtórzenia Phe-Gly zaangażowane w translokację receptorów transportu

- nukleoporyny pozbawione domen FG; stanowią elementy strukturalne NPC

- nukleoporyny należące do białek błonowych, zakotwiczają NPC w błonie jądrowej.

Transport przez kompleks poru jądrowego

Transport aktywny:

RNA/białko rozpoznawane i wiązane z receptorami transportu → wiązanie kompleksu transportu z NPC i translokacja przez kanał centralny → uwolnienie RNA/białka z kompleksu transportu

Przejście przez poryny wiąże się z dostarczeniem energii (rozkładem GTP)

Karioferyny - pojedyncza rodzina receptorów transportu

- importyny

- eksportyny

Rozpoznają bezpośrednio lub pośrednio z udziałem cząsteczek adaptorowych (?) krótki peptyd sygnalny na transportowanym białku tj. sygnał lokalizacji jądrowej (NLS - ang. nuclear localization signal) lub sygnał eksportu jądrowego (NES - ang. nuclear export signal)

Jądro: Ran-GDP → ^{RanGEF (Ran-GDP-exchange factor)} → Ran-GTP

Cytoplazma: Ran-GTP → ^{RanGAP (Ran-GTPase-deactivating protein)} → Ran-GDP

Karioforyny - specyficzne receptory transportu przez błony jądrowe: eksportyny i importyny, wymagają białka Ran z GDP/GTP, w jądrze przewaga Ran-GTP, w cytoplaznie przega Ran-GDP

Import

Białka które są transportowane do jądra posiadają sekwencję NLS, czyli miejsce lokalizacji jądrowej, sekwencja ta wiąże się z importyną, powstaje taki kompleks transportu, przechodzi on przez kompleks poru jądrowego do jądra.

Do kompleksu białko-importyna w jądrze przyłącza się Ran-GTP - oddyscjowanie białka, importyna połączona z Ran-GTP powraca poryną do cytoplazmy.

W białku działa Ran GAP (hydrolaza GTP związanego z Ran) daje energię do rozdysocjowanie kompleksu.

Eksport

Białka ma sekwencję NES (sygnał eksportu jądrowego) - sekwencja ta łączy się z eksportyna i z bialkiem Ran-GTP, tworzy się potrójny kompleks, przechodzi przez porynę w cytoplazmie białko Ran GAP, rozdysocjowanie eksportyny, białka, Ran-GDP + Pi. Eskportyna przechodzi z powrotem przez por jądrowy.

Szlaki eksportu RNA

tRNA → przetwarzanie, dojrzewanie i wiązanie z czynnikami transportowymi → wiązanie z exp-t i Ran-GTP, przez pory przechodzą do cytoplazmy.

mRNA → przetwarzanie, dojrzewanie i wiązanie z czynnikami transportowymi → wiązanie z exp-5 i Ran-GTP → transport przez pory do cytoplazmy.

snRNA → przetwarzanie, dojrzewanie i wiązanie z czynnikami transportowymi → wiązanie z białkami CBC, PHAX, CRM1, Ran-GTP - transport przez pory do cytoplazmy.

mRNA - nie wymaga białka Ran-GTP → przetwarzanie, dojrzewanie i wiązanie z czynnikami transportowymi → mRNA przechodzi przez pory jako kompleks białkowy, do tego dowiązują się inne białka.

Mechanizmy transkrypcyjnej i potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów przy udziale RNA

Regulacja ekspresji genów przy udziale ryboprzełączników (ang. riboswitch)

Ryboprzełącznik - ustrukturyzowany fragment mRNA, znajdujący się na końcu 5' w części nie ulegającej translacji (nie zawierającej sekwencji kodującej białko. Ma on dwa fragmenty: aptamer, mogący wiązać specyficzny ligand i platformę ekspresyjną. Wiązanie ligandu w aptamerze powoduje zmianę w platformie ekspresyjnej tak, że transkrypcja nie zachodzi.

A - hamowanie tranksprypcji - jeżeli aptamer nie ma związanego ligandu, platforma ekspresyjna tworzy struktura zwaną anty-terminatorem (spinka do włosów w dół -hairpin down), nie przeszkadza to w transkrypcji;

jeżeli aptamer zwiąże ligand, anty-terminator przekształca się w terminator (spinka do włosów w górę - hairpin up), transkrypcja nie zachodzi.

B - hamowanie translacji - w platformie ekspresyjnej siedzi RBS - białko wiążace rybosom, tak dowiązuje się rybosom i rozpoczyna translację

jeżeli ligand wiąże się z aptamerem zmiana konformacji RNA tak, że RBS staje się niedostępne dla rybosomu - translacja nie zachodzi.

Regulacja przy udziale ryboprzełączników wiążących TPP (pirofosforan tiaminy) - niezbędna substancja dla metabolizmu cukrowego.

mRNA - białka wiążące TPP (receptory) są wiązane przez mRNA związane z syntezą i transportem TPP, jeżeli TPP jest obficie w pożywce, wtedy synteza własnego bylaby stratą energii, dlatego mamy mechanizm hamujący wtedy transkrypcje.

Jeżeli stężenie TPP jest małe - komórka musi dosyntetyzować → mRNA 5'-ryboprzełącznik z aptamerem i miejscem na wiązanie rybosomu → dołącza się rybosom → translacja regionu kodującego, wtedy gen działa → zwiększa się poziom TPP → nowozsyntetyzowane TPP dołącza się do ryboprzełącznika (aptameru) → translacja nie zachodzi (miejsce wiążące rybosom niedostępne), gen wyłączony.

Mechanizmy potranslacyjnej represji genów przez snRNA w komórkach bakteryjnych.

Mamy mRNA z miejscami wiązania rybosomu, przyłączają się rybosomu, jeżeli jest tam snRNA wiąże się z sekwencją RBS - 'przykrywają ją' - uniemożliwiając wiązenie rybosomów, jeżeli takie snRNA się dowiąże to zaraz wpada RNaza (E, III) i tnie mRNA powodując jego degradację.

Interferencja RNA - mechanizm kontroli ekspresji genów u Eukariota

Interferencja RNA (RNAi) to zachowawczy ewolucyjnie mechanizm wyciszenia ekspresji genów przez małe cząsteczki RNA o długości ~ 20-30 nukleotydów.

Funkcją maszynerii RNAi jest m.in. ochrona genomu przed wirusami, hamowanie przemieszczania się do transpozonow wewnątrz genomu, regulacja aktywności genów.

Historia odkrycia interferencji RNA

Pierwszych dowodów na wyciszanie RNA dostarczyły w 1990 roku badania zespołu R. Jorgensena nad modyfikacją koloru kwiatów petunii.

Wprowadzenie transgenu - dodatkowej kopii genu syntazy chalkonowej - syntaza chalkonowa odpowiedzialna za produkcję antyocyjanów - badacz myślał, że więcej genów będzie powodowało nadekspresję i ściemnienie kwiatów - wynik nietypowy, cześć kwiatów pstrokata (purpurowo-biała), a część w ogóle biała.

Sytuację, w której wyciszeszniu ulega zarówno własny gen jak i wprowadzony nazywamy kosupresją.

S. Guo i K. Kemphues użyli antysensownego RNA, aby specyficznie inaktywować gen zwany PAR-1 u Caenorhabditis elegans (1995 r.)

DNA → na jego matrycy mRNA → do niego dołącza się komplementarny antysensowny framgent RNA → rybosom nie może się po tym fragmencie przesuwać → translacja nie zachodzi.

Caenorhabditis elegans

Pierwszy podzial zygoty w trakcie embriogenezy jest asymetryczny → odpowiada za to gen PAR-1.

Wprowadzenie antysensownego RNA kinazy PAR-1 spowodowało zanik aktywności tego białka. Pierwszy podział był symetryczny.

Ku zaskoczeniu badaczy ten sam efekt obserwowano po wprowadzeniu sensownego RNA! - a miala to być próba kontrolna.

Przełom w wyjaśnieniu tego zjawiska - badania Andrew Fire'a i Craiga Mello opublikowane w Nature w 1998 r.

C. elegans typu dzikiego→ mutageneza delecyjna genu unc-22 → fenotyp twitcher (kurczenia ciała, spowodowany unieczynnieniem genu unc-22 (delecja unc-22), co powoduje utratę kontroli nad mięśniami, stąd nazwa unc od ang. uncoordinated)

po wprowadzeniu sensownego RNA - brak efektu

po wprowadzeniu antysensownego RNA → brak efektu

po otrzymaniu dwuniciowego (ds) RNA → fenotyp twitcher.

Analiza ilościowa mRNA genu unc-22

Tam gdzie nie było efektu fenotypu ilość mRNA była stabilna i zbliżona do typu dzikiego

Tam gdzie był twitcher mRNA było na bardzo niskim poziomie lub niewykrywalne

Wniosek: dsRNA powoduje wyciszenie endogennego genu - nazwano do zjawisko interferencją.

Wnioski płynące z badań nad C. elegans.

- Mechanizm RNAi jest bardzo specyficzny (wprowadzony do komórki dsRNA) o sekwencji odpowiadającej fragmentowi endogennego genu, wycisza tylko ten mRNA);

- dsRNA musi zawierać sekwencje odpowiadające dojrzałemu mRNA aby wywołaś efekt RNAi (dsRNA zawierający sekwencje intronowe lub promotorowe nie wywołuje odpowiedzi);

- wyciszenie przebiega postranskrypcyjnie, prawdopodobnie na terenie cytoplazmy;

- do wywołania RNAi wystarczy obecność zaledwie kilku cząsteczek dsRNA, co generuje działanie mechanizmu amplifikujacego cząsteczki dsRNA i/lub katalitycznego

- RNAi może być przydatnym narzędziem w genomice funkcjonalnej organizmów eukariotycznych.

W jaki sposób dwuniciowe cząsteczki RNA wywołują wyciszanie docelowego mRNA?

A. J. Hamilton i D.C Baulcombe, jako pierwsi (1999 r.) pokazali, że w potranskrypcyjne wyciszanie genów u roślin (PTGS) są zaangażowane krótkie, 25-nukleotydowe dsRNA.

Mechanizm interferencji RNA - badania nad Drosophila melanogaster

dsRNA - obcy dwuniciowy RNA bedący składnikiem RNA → muszki potrafią go zniszczyć.

Bierze w tym udział występująca u eukariotów rybonukleaza Dicer → dsRNA jest cięte na siRNA i inaktywowane

siRNA - małe, interferujące RNA, dwadzieścia kilka nukleotydów, specyficzne, dwa końce niezwiązanie na nici jednej z jednej strony, dwie z drugiej - lepkie końce

Dołączają się białka - argonauta i inne, tworzy się RISC (ang. RNA-induced silencing complex)

siRNA zostaje rozwinięte, jedna nić zostaje pocięta czyli zdegradowana, a druga wiąże się z komplementarnym RNA i powoduje jego degradację, tną nam to nukleazy, gdzie jest zaznaczone siRNA.

Proces RNAi przebiega w szczegółach nieco inaczej u roślin, grzybów, bezkręgowców i kręgowców. Odpowiednio też u roślin proces ten często nazywa się potranskrypcyjnym wyciszaniem genów - PTGS (ang. postrtranscriptional gene silencing), tłumieniem genów u grzybów (ang. quelling) i RNAi u zwierząt.

Obecnie wiadomo, że małe RNA są kodowane przez genomy eukariotyczne. Ze względu na mechanizm biogenezy i typ białek Argonaute (Ago), z którymi są zasocjowane dzielimy je na trzy klasy:

- siRNA (~21 nt): endo-siRNA i exo-siRNA

→ oddziałujące z białkami Ago

- miRNA (microRNA, ~22nt)

- piRNA (~24-31 nt) → oddziałujące z białkami Piwi

miRNA - regulatory ekspresji mRNA w komórkach zwierzęcych i roślinnych

- regulują ekspresję genów poprzez hamowanie ekspresji mRNA (uważa się, że ekspresja ok. 10-30% genów kodujących białka w komórkach zwierzęcych jest regulowana przez miRNA)

- odkryte w 1993 roku (lin-4 u C.elegans)

Biogeneza miRNA

w jądrze mamy geny je kodujące, czasem są to introny, RNA pol II/II transkrypuje, mamy pri-mikroRNA → tniemy, powstaje pre-mikroRNA, eksportyna 5 i Ran-GTP dowiązuje się, transportowane do cytoplazmy → cięcie Dicerem w kompleksie z TRBP

Zasady oddziaływania miRNA - mRNA

Sekwencja kodująca - koniec 3' UTR - koniec poliadenylowy,

Do fragmentu 3' UTR dołącza się miRNA w kompleksie białkowym na zasadzie komplementarności - komplementarność pełnia u roślin, u zwierząt tylko niektóre nukleotydy (od 2 do 8 nukleotydu i potem znowu)

Wyciszanie ekspresji genów

a) transkrypcyjne wyciszanie genów (ang. transcriptional gene silancing - TGS) → modyfikacja chromatyny → brak transkryptu RNA

b) potranskrypcyjne wyciszanie genów (ang. post-transciptional gene silencig-PTGS)

- zahamowanie translacji

- degradacja mRNA

RNAi jako narzędzie badawcze

Jeżeli wprowadzimy dwuniciowe RNA i wyciszymy dany gen możemy po obserwacji fenotypu wnioskować o jego funkcji

gotowe wektory ekspresji RNAi → do jądra, tam powstaje RNAi, możemy tez od razu zsyntetyzować RNAi de novo w wyniku syntezy chemicznej i wprowadzić do komórki gotowe

Zastosowanie technologii malych RNA w rolnictwie

wyciszanie genów sluży do eliminacji alergenów z orzeszków ziemnych;

kontrola szkodników

Zastosowanie technologii małych RNA w terapii chorób u człowieka

Schorzenie Etap

AMD (starcze zwyrodnienie plamki) II faza badań klinicznych

Cukrzycowy obrzęk plamki (DME) II faza badań klinicznych

RSV (wirus zapalenia oskrzeli) II faza badań klinicznych

Aktywacja RNA (ang. RNA activation, RNAa)

Pierwsze doniesienie o istnieniu mechanizmu RNAa - 2006r. → aktywacja ekspresji genów za pośrednictwem małych dsRNA zwanych saRNA (ang, small activating RNA) → saRNA są komplementarne do pewnych regionów promotorowych DNA i aktywują transkrypcję DNA ok. 10-krotnie.

---