Laboratorium z biochemii

Ćwiczenie nr 3

SACHARYDY

Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności

Kierunek: biotechnologia

Rok studiów: III

Magdalena Dudek

Paulina Ziółczyk

Data wykonania ćwiczenia:

22.10.2008

Data oddania sprawozdania

29.10.2008

Cel ćwiczenia: celem naszych zajęć było poznanie metod rozróżniania cukrów w oparciu o ich własności oraz budowę.

Wstęp teoretyczny:

Związki którymi zajmowaliśmy się na 3 zajęciach laboratoryjnych to duża grupa związków zaliczanych do węglowodanów, zwana jest również sacharydami lub cukrami. Termin „węglowodany” obejmuje monosacharydy (cukry proste), oligosacharydy, polisacharydy oraz związki pokrewne
(aminocukry, kwasy uronowe, itp.). Węglowodany są szeroko rozpowszechnione w świecie roślinnym
i zwierzęcym. Odgrywają rolę zarówno strukturalną jak i energetyczną.

W skład węglowodanów wchodzą: węgiel, wodór i tlen. Z chemicznego punktu widzenia są to alkohole wielowodorotlenowe, zawierające w cząsteczce grupę aldehydową (aldozy) lub grupę ketonową (ketozy).

Związki zbudowane z jednej cząsteczki aldozy lub ketozy nazywa się monosacharydami lub cukrami prostymi. Monosacharydy nie ulegają hydrolizie do form prostszych. Na podstawie liczby atomów węgla można je podzielić na triozy, tetrozy, pentozy, heksozy oraz heptozy.

Przykłady:

Aldoza Ketoza

Triozy (C₃H₆O₃) Aldehyd glicerynowy Dihydroksyaceton

Tetrozy (C₄H₈O₄) Erytroza Erytruloza

Pentozy (C₅H₁₀O₅) Ryboza Rybuloza

Heksozy (C₆H₁₂O₆) Glukoza Fruktoza

Disacharydy to cukry, które podczas hydrolizy rozpadają się na 2 cząsteczki takich samych lub różnych monosacharydów. Jeżeli w wiązaniu glikozydowym wzięły udział obie grupy hydroksylowe półacetalowe połączonych monosacharydów (jak ma to miejsce np. w sacharozie),
to taki disacharyd nie wykazuje właściwości redukujących. Jeżeli w utworzonym disacharydzie jedna
z grup hydroksylowych półacetalowych jest nadal wolna (np. w maltozie), to taki disacharyd wykazuje właściwości redukujące.

Przykłady:

Sacharoza, laktoza, maltoza.

Oligosacharydy to cząsteczki, które podczas hydrolizy rozpadają się na 2-6 jednostek będących monosacharydami. Monosacharydy mogą kondensować tworząc disacharydy (zbudowane
z dwóch cząsteczek cukru prostego), trisacharydy, tetrasacharydy, itd. o ogólnej nazwie oligosacharydów (połączenie od 2 do 10 cząsteczek monosacharydów). Charakter i właściwości powstałego cukru zależą od ilości połączonych monosacharydów, samych monosacharydów, z jakich zbudowany jest cukier złożony, rodzaju wiązania glikozydowego z punktu widzenia konfiguracji α- lub β- i wreszcie od miejsca ich połączenia, tzn. miejsca grupy wodorotlenowej jednego
z monosacharydów, która utworzyła wiązanie glikozydowe (połączone mostkiem tlenowym) z grupą hydroksylową półacetalową drugiego monosacharydu.

Przykład:

Maltotrioza- nie jest ona triozą, a trisacharydem zbudowanym z 3 reszt α-glukozy.

Polisacharydy, w wyniku hydrolizy rozpadają się na ponad 6 cząsteczek monosacharydów. Niekiedy określa się je jako heksozany lub pentozany, w zależności od tego jakie monosacharydy otrzymujemy w wyniku hydrolizy. Polisacharydy zbudowane są z setek a nawet tysięcy połączonych ze sobą cząsteczek monosacharydów, tworząc jedną olbrzymią cząsteczkę. Ich skład z reguły przedstawia się wzorem sumarycznym: (C₆H₁₀O₅)_n. Są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. Niektóre, jak skrobia i celuloza, spotykane są powszechnie u roślin. Do związków pokrewnych polisacharydom zalicza się także hemicelulozy, aminocukry i pektyny.

Przykłady:

Skrobie i dekstryny,

W środowisku alkalicznym monosacharydy występują w formie łańcuchowej, natomiast
w kwaśnym lub obojętnym w formie pierścieniowej (półacetalowej): piranozowej (sześcioczłonowy pierścień) lub furanozowej (pięcioczłonowy pierścień).

Wzór strukturalny w formie prostego łańcucha pozwala zrozumieć tylko niektóre właściwości np. glukozy, to strukturą uprzywilejowaną termodynamicznie i warunkującą pozostałe właściwości chemiczne jest forma cykliczna. Dzięki temu cząsteczkę np. glukozy możemy przedstawić w postaci kilku różnych wzorów:

pH<7

forma łańcuchowa → forma pierścieniowa

←

pH>7

Część doświadczalna:

Działanie kwasów na sacharydy

1. Odczyn Molischa z α-naftolem

Wykonanie: do 1cm³ 2% roztworu glukozy dodałyśmy 2 krople 20% etanolowego roztworu α-naftolu. Następnie pod wyciągiem ostrożnie przelałyśmy 1cm³ HCl, tak aby nie zamieszać zawartości probówki.

Obserwacje: na granicy powstałych faz utworzyła się fioletowa (fioletowo-czerwnona) obrączka.

2)Próba z tymolem

Wykonanie: do 1cm³ glukozy dodałyśmy 4 krople 3% etanolowego roztworu tymolu i 2cm³ stężonego kwasu solnego. Następnie probówkę ogrzewałyśmy we wrzącej łaźni wodnej przez około 5min.

Obserwacje: roztwór zabarwił się na czerwono

Wnioski 1), 2): monosacharydy pod wpływem stężonych kwasów (octowego, solnego lub siarkowego) i podwyższonej temperatury ulegają odwodnieniu. Na działanie rozcieńczonych kwasów
w temperaturze pokojowej są stosunkowo odporne. Odwodnienie pentoz prowadzi do wytworzenia furfuralu, natomiast odwodnienie heksoz tworzy 5-hydroksymetylenofurfural.

Odwodnieniu najłatwiej ulegają pentozy, natomiast wśród heksoz ketozy. Disacharydy reagują wolniej niż monosacharydy, lecz szybciej od polisacharydów. Furfural i 5-hydroksymetylenofurfural kondensują z różnymi fenolami, chinonami lub aminami aromatycznymi, tworząc różnobarwne połączenia, które wykorzystywane są do wykrywania, różnicowania i oznaczeń ilościowych cukrów.

3)Próba Seliwanowa. Wykrywanie ketoz

Wykonanie: przygotowałyśmy 4 probówki do których kolejno wlałyśmy po 1cm³ następujących roztworów: (1)glukozy, (2)fruktozy, (3)maltozy, (4)sacharozy. Następnie do każdej dolałyśmy po 2cm³ roztworu HCl rozcieńczonego w stosunku 1:1, oraz po 1 kropli 2% etanolowego roztworu rezorcyny. Następnie wszystkie wstawiłyśmy do wrzącej łaźni wodnej.

Obserwacje: w probówce nr 2 po ok. 30sek. pojawiło się czerwono-łososiowe (czerwono-wiśniowe) zabarwienie. Po dłuższym okresie ogrzewania (ok. 20min) w innych probówkach także zaczęła się pojawiać czerwona barwa roztworu.

Wnioski: ketozy w środowisku rozcieńczonego (1:1) kwasu HCl i po ok. 30sekundach ogrzewania przekształcają się w 5-hydrosksymetylenofurfural, natomiast aldozy w tych warunkach pozostają niezmienione. Pozwala to na różnicowanie heksoz. Wytworzony 5-hydroksymetylenofurfural kondensuje z roztworem rezorcyny tworząc barwny kompleks. Zwiększenie stężenia roztworu HCl lub/i wydłużenie czasu trwania ogrzewania może spowodować, że aldozy ulegną podobnej przemianie, dając dodatni wynik reakcji.

4)Reakcja Biala. Wykrywanie pentoz.

Wykonanie: przygotowałyśmy 3 probówki do których wlałyśmy po 0,5cm³ następujących roztworów: (1)arabinozy, (2)glukozy, (3)fruktozy. Następnie do każdej z nich dolałyśmy po 2cm³ 0,2% etylenowego roztworu orcyny i kroplę 1% roztworu FeCl₃. Następnie wszystkie wstawiłyśmy na kilka minut do łaźni wodnej.

Obserwacje: w probówce 1 w niedługim czasie pojawiło się zielone zabarwienie, które z upływem czasu przyjęło barwę morską (zielono-niebieską), w probówce 2 długo nie zachodziła żadna zmiana, lecz po kilkunastu minutach z żółtego zabarwienia zmieniło się na zielone, w probówce 3 najpierw pojawiło się pomarańczowo-czerwone zabarwienie z czasem przechodzące od barwy brunatnej do zielonej.

Wnioski: w probówce 1 znajdowała się pentoza - arabinoza. Jednak tak jak w przypadku wykrywania ketoz, kiedy wydłużymy czas ogrzewania może dojść do tego iż inne cukry ulegną podobnej przemianie.

Właściwości redukujące sacharydów

1) Próba Fehlinga

Wykonanie: przygotowałyśmy 5 probówek do których wlałyśmy po 1cm³ roztworów Fehlinga I i II. Później dodałyśmy po 1cm³ następujących 2% roztworów: (1)glukozy, (2)fruktozy, (3)maltozy, (4)sacharozy, (5) wody. Wszystkie probówki wstawiłyśmy do wrzącej łaźni wodnej.

Obserwacje: w przypadku probówek 1-3 wytrącił się czerwony osad, w probówkach 4-5 nie zaobserwowałyśmy zmiany

Wnioski: cukier wykazuje właściwości redukujące, kiedy posiada wolną grupę aldehydową lub ketonową, czyli w sytuacji kiedy występuje w formie łańcuchowej (w formie cyklicznej (pierścieniowej) brak jest wolnej grupy redukującej). Jest to możliwe w środowisku zasadowym. Enolizacja monosacharydów w środowisku zasadowym doprowadza do równowagi między empirycznymi aldozami i ketozami. Natomiast w roztworach zasadowych lub silnie kwaśnych cukry są obecne przede wszystkim w formach łańcuchowych, dzięki czemu mają wolne grupy aldehydowe, bądź ketonowe. W tych warunkach cukry mogą zachowywać się, jak typowe aldehydy lub ketony. Istotna różnica między aldehydami i ketonami polega na ich odmiennym zachowaniu się wobec odczynników utleniających. Aldehydy bardzo łatwo redukują słabe utleniacze (np. Cu+2, Ag+), wykazując swe własności redukcyjne, natomiast ketony z tymi słabymi utleniaczami nie reagują. Jednak cukry, które są ketonami, np. fruktoza, w środowisku zasadowym redukują słabe utleniacze - podobnie jak aldozy. Wynika to z faktu, że ketozy (oraz aldozy) w środowisku zasadowym przechodzą w formę łańcuchową, która dzięki przegrupowaniu tautomerycznemu do 1,2-endiolu pozostaje w równowadze
z epimerycznymi aldozami. Wodorotlenki metali ciężkich są nierozpuszczalne w wodzie. Winian sodowo-potasowy (sól Seignett'a) tworzy z Cu(OH)₂ rozpuszczalny kompleks, który jest zdysocjowany tylko w nieznacznym stopniu i w miare redukcji Cu²⁺ rozpada się dostarczając nowych jonów Cu²⁺, tworząc nierozpuszczalny barwny osad Cu₂O.

Wpływ zasad na sacharydy

1)Próba Moore'a

Wykonanie: do pięciu probówek dodałyśmy po 1cm³ 10% NaOH, później dodałyśmy po 1cm³ następujących 2% roztworów: (1)glukozy, (2)sacharozy, (3)maltozy, (4)skrobi, (5) wody. Wstawiłyśmy wszystko na kilka minut do wrzącej łaźni wodnej.

Obserwacje: w probówce 1 i 3 pojawiło się „karmelowe” zabarwienie, w probówkach 2, 4, 5 nie zaobserwowałyśmy zmiany barwy

Wnioski: w środowisku obojętnym cukry występują w formie pierścieniowej. Kiedy zmieniamy pH
w kierunku zasadowym forma ta przekształca się w formę łańcuchową. Zachodzi zjawisko enolizacji, znika asymetria, wraz z zanikiem formy pierścieniowej powstają wolne grupy redukujące.
W probówkach 1 i 3 mamy do czynienia z cukrami redukującymi.

Rozróżnianie monosacharydów od disacharydów. Disacharydy

1)Próba Barfoeda

Wykonanie: do dwóch probówek wlałyśmy po 5cm3 odczynnika Barfoeda, następnie dodałyśmy po 1cm3 następujących 2% roztworów: (1)glukozy, (2)maltozy, następnie probówki wstawiłyśmy do wrzącej łaźni wodnej.

Obserwacje: po ok. 5minutach w probówce nr 1 powstał czerwony osad, w probówce nr 2 osad powstał dopiero po około 20 minutach

Wnioski: w środowisku odczynnika Barefoeda zachodzi redukcja kationów Cu2+ do Cu+.

Szybkość reakcji z udziałem monosacharydów różni się od szybkości reakcji z udziałem disacharydów redukujących. Monocukry dają dodatni wynik odczynu wkrótce po ogrzaniu mieszaniny reakcyjnej, natomiast disacharydy redukujące dopiero po dłuższym ogrzewaniu.

Polisacharydy

1)Reakcje skrobi z jodem

Strukturę skrobi tworzą dwa glukany, amyloza i amylopektyna. W roztworach liniowych łańcuch amylozy zwija się w przestrzeni, tworząc lewoskrętną helisę, w której na jeden skręt przypada 6 reszt glukozy. Helikalną strukturę przestrzenną amylozy stabilizują wiązania wodorowe, powstające między wolnymi grupami hydroksylowymi monocukrów.

A)

Wykonanie: do 2cm3 roztworu koloidalnego skrobi dodałyśmy kroplę J₂ w KJ. Po zabarwieniu roztworu probówkę ogrzałyśmy i obserwowałyśmy zmiany

Obserwacje: po dodaniu J2 roztwór zabarwił się na niebiesko, następnie po ogrzaniu barwa znikała
i przy oziębianiu znów się pojawiała

Wnioski: Amyloza tworzy kompleks z jodem o barwie niebieskiej, którą zawdzięcza temu,

że ma strukturę uporządkowanej helisy, z pustym wnętrzem wypełnionym jodem. Zabarwienie nie jest wynikiem reakcji chemicznej, lecz skutkiem uwięzienia cząsteczek jodu wewnątrz helisy. Jod wewnątrz helisy znajduje się w odmiennym otoczeniu niż w roztworze i ma inną barwę. Barwa wynika z ruchu elektronów wzdłuż łańcucha cząsteczek jodu, wypełniającego wnętrze helisy amylozy oraz
z pochłaniania światła przez cały kompleks. Natomiast podczas ogrzewania helisa amylozy rozwija się, skutkiem zerwania wiązań wodorowych, uwalniając uwięziony jod i barwa zanika. Amylopektyna
z jodem daje barwę fioletowoczerwoną. Natomiast skrobia z jodem daje zabarwienie fioletowoniebieskie.

B)

Wykonanie: do 2cm³ roztworu koloidalnego skrobi dodałyśmy kilka kropli 1M NaOH i kroplę KJ. Po zaobserwowaniu zmiany barwy roztwór zakwasiłyśmy rozcieńczonym kwasem solnym.

Obserwacje: przed dodaniem HCl w roztworze obserwowałyśmy powstanie białej zawiesiny (osadu), natomiast po zakwaszeniu kolor roztworu zmienił się na jasnoniebieski

Wnioski: W skrobi, ogrzewanej w środowisku rozcieńczonych kwasów, rozrywane są wiązania glikozydowe, z towarzyszącym przyłączeniem jednej cząsteczki wody na każde hydrolizowane wiązanie. Początkowymi produktami hydrolizy są dekstryny, czyli krótsze fragmenty skrobi, wśród których kolejno pojawiają się: amylodekstryny, barwiące się z jodem na kolor niebieskofioletowy, erytrodekstryny, barwiące się z jodem na kolor brunatnoczerwony i achrodekstryny, które nie dają zabarwienia z jodem. Poza dekstrynami w trakcie hydrolizy zaczynają pojawiać się reszty maltozy
i glukozy, czyli cukry redukujące, które można wykryć, stosując jeden z odczynów na cukry redukujące.

Na zabarwienie skrobi z jodem ma wpływ pH roztworu. W środowisku zasadowym powstaje biały osad, ponieważ jod reaguje z zasadą

J₂ + 2 NaOH → NaJO + NaJ + H₂O

W środowisku kwaśnym reakcja przebiega z wydzieleniem jodu

NaJO+ NaJ + 2HCl → 2NaCl + J₂ + H₂O

2)Odróżnienie bibuły od papieru gazetowego

Wykonanie: po kawałku papieru gazetowego i bibuły zwilżyłyśmy na szkiełku kroplą 2% roztworu floroglucyny i kroplą stężonego HCl.

Obserwacje: próbka papieru gazetowego zabarwiła się na kolor „buraczkowy”, natomiast w przypadku bibuły nie zaobserwowałyśmy żadnych zmian.

Wnioski: dzięki tej reakcji mogłyśmy stwierdzić, że w skład papieru gazetowego wchodzą pentozy dające pozytywny wynik tej reakcji. Bibuła natomiast najwyraźniej nie zawiera pentoz.

Zadanie końcowe:

Paulina Ziółczyk

1) Wykrywanie cukru- Próba z tymolem

Roztwór zabarwił się na czerwono-brunatny kolor. Świadczy to o pozytywnym wyniku reakcji
i o obecności cukru w próbie

2)Reakcja Seliwanowa na obecność ketoz

Otrzymuje roztwór o zabarwieniu czerwonym. Pozytywny wynik reakcji. Szukanym przeze mnie cukrem jest ketoza.

3)Reakcja Fehlinga- na obecność cukrów redukujących

Nie wytrącił się osad, co wskazuje na obecność cukrów nieredukujących.

4)Reakcja Moore'a- w celu potwierdzenia, że badany cukier na pewno nie jest redukujący

Negatywny wynik reakcji, roztwór nie zabarwił się, świadczy to o tym, iż posiadamy przeze mnie cukier nie jest cukrem redukującym

Badany cukier to : SACHAROZA

Magdalena Dudek

1) Reakcja na wykrycie cukru

Reakcja Molischa

Na granicy faz powstał fioletowy pierścień. Dodatni wynik reakcji potwierdzający obecność cukru
w próbie

2) Sprawdzenie redukcyjności badanego cukru

Reakcja z odczynnikiem Fehlinga

Wytrącił się czerwony osad. Dodatni wynik reakcji. Badany cukier jest cukrem redukującym.

3) Reakcja na wykrywanie pentoz

Reakcja Biala

Roztwór zmienił barwę z zielonej na morskozieloną. Dodatni wynik przeprowadzonej reakcji potwierdza to, iż badany cukier jest pentozą.

Badany cukier to: ARABINOZA

---