1. Czynniki wpływające na jakość PAGE
2. Wypisać czułość metod do analizy Western
3. Cel stosowania ISH oraz jego typy
4. Rodzaje immunodetekcji w ICC
5. Metody do transformacji zwierząt

1. Czego należy unikać w SDS-PAGE
2. Przyczyny smug i miękkiego żelu
3. Substraty w znanych ci metodach Western (CN4/Dab, BCIB/NTB)
4. Etapy FISH
5. Zalety roślin transgenicznych

1. Etapy ISH
2. Czego należy unikać Western - ale w końcu kazał pisać o PAGE
3. Różnice i podobieństwa miedzy Dolly i Genia
4. Przyczyny rozmazanych prążków i bielenia żelu
5. Barwniki i ich czułość w Western

PAGE - (ang.: Poli-Acryl Gel Elektorphoresis) = POLIAKRYLAMIDOWA ELEKTROFOREZA ŻELOWA:

Może być prowadzona w różnych warunkach:

• natywnych (PAGE)

• denaturujących (np. w obecności SDS) - rozdział podjednostek

PAGE - stosowana jest zarówno do rozdziału:

• kwasów nukleinowych (anal. rest.) lub ich amplikonów (PCR),

• sekwencjonowanych białek natywnych lub zrekombinowanych

• białek produkowanych in vitro (nat. /rec).

CZYNNIKI wpływające na jakość elektroforezy PAGE:

1. Żel - (MONOMERY PAGE: AKRYL/BiS TO - !!!neurotoksyna !!!)

• Struktura: powstaje przez ko-polimeryzację bisakrylamidu:akrylamidu (np. stosunek molarny, 1:29w/v). W zależności od stosunku bis/akryl uzależniona jest struktura żelu, np. można rozdzielić polipeptydy różniące się masą o 3% (ok. 10% ??? )

• zakres koncentracji = od 3% T do 30% T (T=% ac/bis w/v)

• zmiana z 5% na 30% żel umożliwia redukcję starterów polimeryzacji o 20-50%

• koncentracja żelu:

Koncentracja akrylamidu [%]	Zakres rozdziału [kDa]
15	12-43
10	16-68
7.5	36-94
5.0	57-212

• powinien być przechowywany w ciemnych butelkach, ponieważ

• podczas przechowywania następuje przekształcanie w kwasy akrylowy i bisakrylowy (deamidacja),

• wymagana czystość monomerów = <0.001% kwasów (w/w)

CZUŁOŚCI W DETEKCJI WESTERN; HRP horseradish peroxidase od 500 pg, AP alkaline phosphatase od 100 pg, AP ulepszona od 10 pg, biotyna blot 50 ng, AP immun star od 10 pg.

CEL STOSOWANIA ISH I TYPY: hybrydyzacja in situ na skrawkach tkanek lub komórek hodowanych in vitro służy do ustalenia miejsca ekspresji genu.

SPOSOBY OTZYMYWANIA ZWIERZĄT TRANSGENICZNYCH: nastrzykiwanie in vitro DNA do przedjadrza męskiego zapłodnionej in vivo komórki jajowej, infekcje wczesnego zarodka zrekombinowanym wektorem wirusowym, w którym jest gen, który chcemy wprowadzić, modyfikacje genetyczne pierwotnych komórek zarodkowych w wprowadzanie ich do zarodka w stadium blastocysty, met wirusowe (retrowirusy, adenowirusy, w. Krowianki), niewirusowe: koprecypitacja solami wapnia, z dekstranem, elektropracja (destabilizacja błon salwami pola elektrycznego o wysokim napięciu), bombardzowanie, mikroiniekcja

CZEGO NALEŻY UNIKAĆ W SDS PAGE zakres koncentracji żelu nie powinien być mniejszy niż 3%T ani większy niż 30%T (T to zawartość mieszaniny acryl/bis w żelu [% w/v]), żel nie powinien być przechowywany w jasnych pomieszczeniach ponieważ w czasie przechowywania następuje przekształcanie w kwasy akrylowy i bisakrylowy a my chcemy to opóźnić dlatego przechowujemy go w ciemnych butelkach, należy unikać zanieczyszczeń liniowym akrylamidem bo to powoduje autopolimeryzację i powoduje zmianę struktury żelu. Należy też unikać domieszek metali bo mogą być inhibitorami enzymów zmieniającymi ruchliwość białek lub peptydów lub mogą hamować trawienie kwasów nukleinowych, które zostały oczyszczone elektroforetycznie. Należy unikać zbyt niskiego pH bo to hamuje polimeryzację. Nie używać nieświeżego APS- u, roztwory higroskopijne powodują natychmiastową utratę aktywności, nadmiar APS- u powoduje utlenianie białek. Lepiej nie stosować buforów Tris- Cl czy trizma bo koncentracja soli będzie zbyt duża i polipeptydy będą migrować nieprawidłowo, zanieczyszczenie buforu metalami powoduje zmianę struktury żelu, nadmiar TEMED- u powoduje wzrost pH co oddziałuje na profil białek, za wolna polimeryzacja powoduje powstawanie pęcherzyków powietrza na krawędziach żelu. Temperatura polimeryzacji nie powinna wynosić 0-4 bo czas polimeryzacji jest zbyt długi i żel nie jest elastyczny, ponieważ prawidłowa temp polimeryzacji to 23-25 należy unikać dodawania odczynników przechowywanych w lodówce przed ogrzaniem ich do temp pokojowej.

PRZYCZYNĄ SĄ SMUGI W ŻELU: gdy żel polimeryzuje w czasie krótszym niż 10 min lub gdy żel nie polimeryzuje po 1 godz.

ETAPY FISH:
1. hodowla leukocytów i przygotowanie chromosomów metafazowych- pobieramy krew, wirujemy, izolujemy leukocyty, hodowla leukoc, zbieramy leukoc, wirujemy, dodajemy hipotniczny roztwór KCl aby komórki popękały i można było wydobyć chromosomy, wirowanie, oczyszczamy chromosomy, wirujemy, utrwalamy, schładzamy, rozkładamy na szkiełku podstawowym tak by każdy chromosom był oddzielnie.
2.produkcja sondy w oparciu o matrycę gDNA lub cDNA
3. znakowanie: sonda+chromosomy na płytce- detekcja sygnału

CZEGO NALEŻY UNIKAĆ PODCZAS ANALIZY WESTERN: zbyt częste zaglądanie do pojemnika z barwieniem powoduje powstawanie wysokiego tła ponieważ substraty są bardzo czułe.

PRZYCZYNY ROZMYCIA PRĄŻKÓW I BIELENIA ŻELU: bielenie żelu- zbyt dużo bis- akrylamidu, rozmyte prążki- słaba jakość bisakr, SDS bufor jest za stary.

CZUŁOŚCI METOD W PAGE: CBB- commassie brilant blue: 30-100 ng, SS- Sliver: 1-10 ng; AB- amido black: 100 ng; Coloidal Gold- 1ng; fluorescencyjne- od 1ng

Czynniki wpływające na jakość elektroforezy PAGE:1.Żel - (MONOMERY PAGE: AKRYL/BiS TO - neurotoksyna )*Struktura: powstaje przez ko-polimeryzację bisakrylamidu:akrylamidu (np. stosunek molarny, 1:29w/v). W zależności od stosunku bis/akryl uzależniona jest struktura żelu, np. można rozdzielić polipeptydy różniące się masą o 3% (ok. 10% ??? )*zakres koncentracji = od 3% T do 30% T (T=% ac/bis w/v)*zmiana z 5% na 30% żel umożliwia redukcję starterów polimeryzacji o 20-50%*koncentracja żelu*powinien być przechowywany w ciemnych butelkach, ponieważ*podczas przechowywania następuje przekształcanie w kwasy akrylowy i bisakrylowy (deamidacja),* wymagana czystość = <0.001% kwasów (w/w) 2.Startery polimeryzacji;-TEMED-przyspiesza polimeryzacje zeli poprzez katalizowanie formowania wolych rodników z APS.APS-przyspiesza polimeryzacje ,musza być swierze roztwory.3.Bufor do żeli:Trisbase, nie może być dużej koncentracji soli.4 Warunki:prawidłowe żelowanie(15-20 min), prawidłowa polimeryzacja(90 min), temp 23-25 stopni, przed wylaniem zelu należy go odgazowac.5dodtaki stosowane do PAGE:SDS-anionowy detergent wiążący polipeptydy,Tryton X-100,Formamid lub mocznik.Wybór odpowiedniej metody barwienia białek.Brawienie wszytkich białek badanej próbki (wiązanie barwnika z białkami prowadzace do powstanie widzialnego koloru)Systemy detekcji:CBB czułość od 30-100 ng wynik na membranie -niennieskie paski,SS-sliver od 1-10 ng .zółto-brazowe paski,AB 100 ng niebieskie paski,Colliodal GOLD 1ng czerwone paski, Fluorescent synchron 1ng żółte fluoroscencyjna.Transfer białek przeprowadza się na membrany nitrocelulozowa.Białka z membrana wiąza się niekonwalencyjnie.Poj wiązania wynosi od 80 -100 mikro gramów na cm3.Sonda na membranie sa przeciwciała mono i poliklonalne.Produkcja przeciwciał poloklonalnych:immunizacja(szczury króliki)->produkcja przeciwciał in-vitro->pozyskanie surowic z krwi obwodowej->izolacja i oczyszczanie przeciwciał.Prod przeciw monoklinalnych:immunizacja myszy->izolacja komórek B ze śledziony->fuzja z komórkami nowotworowym->hodowla in-vitro i selekcja hybryd->pozyskanie medium z przeciwciałami->izolacja i oczyszczanie przeciwciał. Absorpcja surowic: 1.Pseudo -screening (pseudoprzesiewanie) zaleta metody jest:oprócz łysinek nadaje się do kolonii bakteryjnej.Wada jest:nadaje się tylko do anty surowic o niskim mianie przeciwciał antybakteryjnych.2. Metoda hodowlana-wada metody jest:nadaje się tylko do antysurowic o niskim mianie niespecyficznych przeciwciał antybakteryjnych. 3.Adsorpcja antysurowic metoda chromatograficzna-zaleta jest :zalecana do antysurowic o wysokim mianie przeciwciał antybakteryjnych.Wymagane sa przygotowanie lizatu bateryjnego, przygotowanie kolumny.Metody immunochemicznej lokalizacji komórkowej antygenów:ICC,IHC.Rodzaje immunodetekcji antygenów:1.reakcja bezposrednia(antygen+znakowane swoiste przeciwciała) 2.reakcja posrednia(antygen+I swoiste przeciwciała+ znakowane II przeciwciała) 3.reakcja z kompleksem enzym-antyenzym(PAP) 4,reakcje z podwójnymi mostkami immunoglobulinowymi(antygen+I przeciwciało+II przeciwciało tworzące mostek z antyenzymem+PAP+II przeciwciało +PAP) 5.reakcja wzmocniona. Metody wykrywania aktywności enzymów znacznikowych:1Wykrywanie aktywności peroksydacyjnej - w obecności nadtlenku wodoru powoduje utlenianie substratów (donorów elektronów) 2.wykrywanie aktywności fosfatazy alkalicznej 3.wykrywanie aktywności beta-D-galaktozydazy 4.wykrywanie aktywności oksydazy glukozowejWady IHC/ICC :*antygen może być wykrywany w różnych lokalizacjach: miejscu syntezy, magazynowania oraz wiązania*podobieństwo determinant antygenowych kilku homologicznych białek*ukrycie determinant poprzez: wiązanie antygenu z receptorem, lub nośnikiem*zmiana determinat: uzależniona od okresowego profilu ekspresji oraz modyfikacji post-translacyjnych białek, np. glikozylacji i fosforylacji*wymagana konieczność zachowania konfiguracji determinant antygenowych

Czynniki wpływające na jakość PAGE:

1.Żel - (MONOMERY PAGE: AKRYL/BiS TO - !!!neurotoksyna !!!)

Ø Struktura: powstaje przez ko-polimeryzację bisakrylamidu :akrylamidu (np. stosunek molarny, 1:29w/v). W zależności od stosunku bis/akryl uzależniona jest struktura żelu, np. można rozdzielić polipeptydy różniące się masą o 3% (ok. 10% ??? )

Ø zakres koncentracji = od 3% T do 30% T (T=% ac/bis w/v)

Ø zmiana z 5% na 30% żel umożliwia redukcję starterów polimeryzacji o 20-50%

Økoncentracja żelu: Øpowinien być przechowywany w ciemnych butelkach, ponieważ

Ø podczas przechowywania następuje przekształcanie w kwasy akrylowy i bisakrylowy (deamidacja),

Ø wymagana czystość monomerów = <0.001% kwasów (w/w)

Ø Wymagana czystość akrylamidu = < 0.005% (w/w)

Ø Zanieczyszczenia: liniowy akrylamid (powoduje auto-polimeryzację), powoduje zmiany struktury żeli oraz spadek powtarzalności metody (różna ruchliwość kw.n. i białek).

Inne zanieczyszczenia (domieszki metali):

Ømogą być inhibitorami enzymów zmieniającymi ruchliwość białek lub poli- oraz peptydów

Ø mogą hamować trawienie enzymatyczne kw. n., które zostały oczyszczone z agarozy (wycięcie z żelu) lub elektroforetycznie (brak hamujących oligosacharydów)

Ø mogą hamować enzymy modyfikujące, np. Taq lub RT-polimerazy.

2.Startery polimeryzacji:

ØTEMED (N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine) - przyspiesza polimeryzację żeli poprzez katalizowanie formowania wolnych rodników z APS. Niskie pH hamuje polimeryzację.

- higroskopijny = wiązanie wody przyspiesza utlenianie

- utlenia się i traci stopniowo aktywność katalityczną (rozpoznanie = żółty kolor)

- powinien być ultra-czysty = 99% (6.62 molarny)

ØAPS - ammonium persulfate lub PPS (potasium persulfate) - do „Silver”) - przyspiesza polimeryzację. Świeże 10% (w/v) roztwory („stocki”) powinny być przygotowywane w dj.H20 (każdego dnia) lub przechowywane w 4oC. Roztwór powinien być:

- higroskopijny = rozpuszczanie powoduje natychmiastową utratę aktywności

- nadmiar APS powoduje utlenianie białek (sulfhydrylowych) i kw.nukleinowych.

Ø ryboflawina - fotochemiczna polimeryzacja - stara metoda

3. Bufory do żeli rozdzielających rozwijających i koncentrujących

Ø musi być Tris base, jeżeli zastosujemy Tris-Cl lub Trizma, to koncentracja soli będzie zbyt duża i polipeptydy będą migrować nieprawidłowo, a prążki będą rozmyte!

Ø zanieczyszczenia metalami powodują zmianę struktury żelu i większą ruchliwość białek

Ø nadmiar TEMED-u - powoduje wzrost pH, oddziaływuje na profil białek

Ø redukcja ilości APS/TEMED-u zwalnia tempo polimeryzacji ale za to poprawia elastyczność żelu

Ø zbyt wolna polimeryzacja powoduje powstawanie pęcherzyków powietrza na górnych krawędziach żelu

Ø niezpolimeryzowane monomery reagują z grupami sulfhydrylowymi i hydroksylowymi białek

Ø prawidłowe żelowanie = 15 - 20 min

Ø prawidłowa polimeryzacja = 90 min - do 2 h stabilizacji żelu

Temperatura

polimeryzacja = proces egzotermiczny = polimeryzacja generuje ciepło, które katalizuje polimeryzację

- optymalna 23-25oC

- 0-4oC- długi czas polimeryzacji, żel nie jest elastyczny

- >25oC - szybka polimeryzacja, krótsze polimery, żel nie będzie elastyczny

Odgazowanie żelu:

Ø przyspiesza polimeryzację

Ø przed wylewaniem żeli - istotne jest usunięcie tlenu z mieszaniny przez podłączenie do pompy próżniowej na 5-10 min.

Ø po wylaniu żeli - istotne usunięcie tlenu z górnej ich powierzchni poprzez dodanie kilku *l:

- wody lub

- alkoholu izoamylowego

- wody nasyconej isobutanolem

Ø Efektywna polimeryzacja w temp. 23-25oC, a zatem wszystkie odczynniki przechowywane w +4oC muszą być doprowadzone do temp. pokojowej.

Dodatki do żelu:

• SDS (Sodium dodecyl sulfate) - anionowy detergent wiążący polipeptydy (-). Ilość wiązań SDS jest prawie wprost proporcjonalna do masy cząsteczkowej polipeptydów i jest niezależna od ich sekwencji (około 1.4 g SDS/ g polipeptydu)

• Triton X-100

• formamide lub mocznik (do efektywnego rozdziału małych białek i polipeptydów)

Modyfikacje: N- lub O-glikozylacje polipeptydów zakłócają prawidłowy przebieg elektroforezy, a przez to również ustalanie masy molekularnej białka.

Crosslinkery alternatywne do bis-akrylamidu:

•PDA (piperazine di-acrylamide)

•DATD (di-allyl-tartar-di-imide)

•DHEBA (dihydroxy ethylene bis acrylamide)

•BAC (bis-acrylyl-cystamine)

ADSORBCJA przeciwciał anty-E.Coli z surowic (poli/mono) uzyskanych przeciwko białkom rekombinantowym

Metody:

1."Pseudo-screening" - pseudoprzesiewanie - do usunięcia Ab-anty-E.Coli przez:

Ø namnożenie bakterii transfekowanych nierekombinowanym wektorem biblioteki ekspresyjnej na podłożu stałym (np.bakteriofagów λ)

Ø uzyskanie "łysinek" (liza bakterii powodowana przez bakteriofagi)

Ø odcisk łysinek (zawierających białka bakteryjne) na mNC

Ø inkubacja mNC (z odciskami łysinek) z surowicami anty białko rekombinantowe (min. 6 godz w 4oC)

Ø absorbowana anty-surowica gotowa do zastosowania w "immuno-screeningu", czyli przesiewaniu immunologicznym.

Zaleta: oprócz łysinek nadaje się do kolonii bakteryjnych (wektor bez insertu)

Wada: nadaje się tylko do anty-surowic o niskim mianie przeciwciał anty-bakteryjnych.

2.Metoda hodowlana

-Namnożyć bakterie E.Coli (odpowiedni szczep) w odpowiedniej objętości hodowli (np. 100 ml)

- Zwirować namnożone bakterie

- Osad bakteryjny rozpuścić w małej objętości buforu 50 mM Tris/10 mM EDTA ( np. 3 ml)

- Zniszczyć błonę komórkową bakterii - wielokrotne zamrażanie lub sonikację (uwolnienie białek bakteryjnych)

- Usunąć błony przez odwirowanie, zachować nadsącz (zawierający białka bakteryjne)

- Inkubować (min. 4 godz) białka bakteryjne (0.5 ml lizatu) z antysurowicą przeznaczoną do adsorbcji (na każdy 1 ml)

- Usunąć immuno-kompleksy (białka bakteryjne+Ab anty-E.Coli)

Wada: nadaje się tylko do anty-surowic o niskim mianie niespecyficznych przeciwciał anty-bakteryjnych

3.Adsorbcja antysurowic metodą chromatograficzną

Zaleta: zalecana do anty-surowic o wysokim mianie przeciwciał anty- bakteryjnych

Wymagane:

Przygotowanie lizatu bakteryjnego

- Przygotowanie kolumny - powiązanie lizatu bakteryjnego z Sepharozą 4B

Ø Namnożyć bakterie E.Coli (odpowiedni szczep) w odpowiedniej hodowli (np. 1 litr)

Ø Zwirować namnożone bakterie, usunąć medium hodowlane

Ø Osad bakteryjny rozpuścić w odpowiednim buforze (100 ml)

Ø Zniszczyć błonę komórkową bakterii - dodanie lizozymu

Ø Zniszczyć bakteryjne DNA - dodanie pankreatynowej DNA-azy I

Ø Usunąć błony przez odwirowanie, zachować nadsącz (zawierający białka bakteryjne)

ØI nkubować alkalizowane białka bakteryjne (pH 9) z ekwilibrowaną Sepharose 4B (aktywowaną bromkiem cyanogenu)

Ø Adsorbować antysurowicę: 1 ml związanych białek E.Coli/Sepharose 4B na każdy 1 mg immunoglobulin antysurowicy przeznaczonych do oczyszczania, inkubować ok. 18 godz.

Ø Przygotować kolumnę i wypłukać oczyszczone antysurowice przez elucję buforem TBS, zbierać małe frakcje (np. 0.2 ml) do uzyskania wartości zerowych OD280 wypływających frakcji.

Uzyskanie natywnego lub rekombinacyjnego białka wymaga:

Ø metody identyfikacji interesującego nas białka wśród kompleksu endogennych białek (oznakowanie-oflagowanie) lub immunosondy

Ø dezaktywacji proteaz obecnych w tkankach lub komórkach wykorzystanych do syntezy białek rekombinacyjnych.

Do identyfikacji - (oznakowania - “oflagowania”) rekombinantów wykorzystywane są:

1.Białka:

ØGST - transferazy glutationu z Shistosoma mansoni

Øthioredoksyna z E.coli

Ø*-galaktozydaza z E.coli

ØMBP- białko wiążące maltozę z E.coli

Øfosfataza alkaliczna z ludzkiego łożyska

2.Peptydy (<25 aa)-wklonowane w plazmidy ekspresyjne-lepsze dla większych białek

ØHis6 tag (sekwencja 6 histydyn)

ØMyc tag (fragment 408-439 c-myc)

ØFlag tag (specyficzna dla Kodak-a)

ØHA tag (9aa fragment hemaglutyniny influenzy)

3.Przeciwciała do w/w białek i peptydów - rozpoznają “znaczniki-flagi-tagi” i pozwalają na identyfikację oraz izolację białek fuzyjnych, np. anty-His6 (wykorzystuje się bardzo duże powinowactwo do niklu)

Zalety znakowania poli-histydynowego:

- duże powinowactwo histydyny do diwalentnych kationów

- np. żywice związane z niklem ułatwiają szybką izolację oraz oczyszczanie białka rekombinantowego

- His-Tag nie interferuje z sekrecją białka w fizjologicznym pH

- His-Tag nie interferuje z strukturą białka

üN-terminalny His-Tag zawiera miejsce restrykcyjne dla enterokinazy, co pozwala na usunięcie His-Tag-a i uzyskanie struktury białka rekombinantowego podobnego do natywnego

IHC/ICC - IMMUNODETEKCJA ANTYGENÓW

Cel: lokalizacja antygenów (białek) jako składników komórek i tkanek:

- antygenów wewnątrz - komórkowych

- antygenów zewnątrz - komórkowych (przestrzeń międzykomórkowa)

- antygenów błonowych

Wymagania: specyficzne przeciwciała rozpoznające determinanty antygenowe (umożliwiające wiązanie epitopów)

Determinanty antygenowe = epitopy (fragmenty sekwencji aminokwasowej o powierzchniowej homologii cząsteczek w konfiguracji przestrzennej =3D)

Wady IHC/ICC:

- antygen może być wykrywany w różnych lokalizacjach: miejscu syntezy, magazynowania oraz wiązania

podobieństwo determinant antygenowych kilku homologicznych białek

ukrycie determinant poprzez: wiązanie antygenu z receptorem, lub nośnikiem

zmiana determinat: uzależniona od okresowego profilu ekspresji oraz modyfikacji post-translacyjnych białek, np. glikozylacji i fosforylacji

wymagana konieczność zachowania konfiguracji determinant antygenowych (podczas przygotowywania tkanek do badań: zatapianie tkanek w parafinie lub różnych żywicach oraz utrwalania i odwadniania tkanek)

-podobieństwo determinant antygenowych kilku homologicznych białek

-antygen może być wykrywany w różnych lokalizacjach: miejscu syntezy, magazynowania oraz wiązania

-zmiana determinat: uzależniona od okresowego profilu ekspresji oraz modyfikacji post-translacyjnych białek, np. glikozylacji i fosforylacji

Rodzaje immunodetekcji antygenów:

1.Reakcja bezpośrednia (antygen + znakowane swoiste Io przeciwciała)

Ø wada - konieczność znakowania przeciwciał we własnym zakresie

2.Reakcja pośrednia (antygen + Io swoiste przeciwciała + znakowane IIo przeciwciała)

3. Reakcja z kompleksem " enzym-antyenzym" (PAP; immunoperoksydaza

4.Reakcja z podwójnymi mostkami immunoglobulinowymi-

- A+ Io przec

- + IIo przeciwciała tworzące mostek z "antyenzymem" + PAP

+ IIo przec + PAP

Wymagania i warunki detekcji typu 3 i 4:

Ø Io przeciwciała oraz "antyenzym" (przeciwciała przeciwko enzymowi muszą pochodzić od tego samego gatunku zwierząt)

Ø koncentracja Io przeciwciał nie może być zbyt wysoka (ponieważ IIo przeciwciała „mostkujące” będą wiązać jedynie Io przeciwciała i wtedy zablokują przyłączanie kompleksu PAP)

Ø koncentracja IIo przeciwciał musi być tak duża aby tylko jeden fragment Fab tworzył wiązanie z Io przeciwciałami, natomiast drugi fragment Fab pozostał wolny do powstania wiązania z PAP

5. Reakcja wzmocniona (np. z biotynylowanymi IIo przeciwciałami + kompleks substratów streptawidyny/peroksydazy)

Metody wykrywania aktywności enzymów znacznikowych:

1.Wykrywanie aktywności peroksydacyjnej - w obecności nadtlenku wodoru powoduje utlenianie substratów (donorów elektronów) i powstawanie barwnych produktów (precypitatów), np.:

•peroksydaza +2H2O2 * O2 +2H2O, pH 7.6

•O2 + DAB = brązowo-czarny precypitat

ØDAB (3,3' - diaminobenzydyna), nierozpuszczalny, pozwala na intensyfikację sygnału w obecności soli niklu, kobaltu, miedzi oraz złota.

Ø4CN (4-chloro-1-naftol) - niebieski, rozpuszczalny

Ø3-amino-9-etylokarbazol - czerwony precypitat, rozpuszczalny w EtOH

2.Wykrywanie aktywności fosfatazy alkalicznej (BCIP/NBT lub fosforan naftolu AS-MX+ Fast Blue BB)

3.Wykrywanie aktywności *-D-galaktozydazy (galaktopiranozyd 5-bromo-4-chloroindolu)

4.Wykrywanie aktywności oksydazy glukozowej (*-D-glukoza, metosiarczan fenazyny, błękit nitrotetrazolowy-NBT)

Metody transgenizacji najczęściej stosowane

1. Nastrzykiwanie in vitro DNA (200-2.000 kopii) do przedjądrza męskiego zapłodnionej in vivo komórki jajowej

2. Modyfikacje genetyczne pierwotnych komórek zarodkowych (ESC - embryo stem cells) i wprowadzenie ich do zarodka w stadium blastocysty

3. Infekcje zarodka konstruktem (zrekombinowanym genem w wektorze wirusowym

4. “Znokautowane” myszy- celowe uszkodzenie badanego genu - umożliwia badanie funkcji produktów genów

---