Tematy ćwiczeń z przedmiotu Biomonitoring Środowiska

1. Ćwiczenia wprowadzające	18.02
2. Biomarkery. Wybrane próby czynnościowe wątroby i trzustki w badaniach monitorujących. 3. Farmaceutyki w środowisku. Ocena wpływu leków na behavior larw wodzienia (Chaoborus sp.)	07.03 14.03
4. Rozkład materii organicznej. Badanie tempa dekompozycji przy pomocy sączków celulozowych 5. Mieszaniny trucizn. Ocena wpływu TBT na działanie insektycydów pyretroidowych. Cz. I - intoksykacja organizmów; wyznaczenie stężenia niepowodującego skutków letalnych	21.03 04.04
6. Mieszaniny trucizn. Ocena wpływu TBT na działanie insektycydów pyretroidowych. Cz. II - ocena interakcji składników mieszaniny 7. Ocena stanu zanieczyszczenia powietrza w metodą skali porostowej. Odczyn kory drzew i gleby jako wskaźnik skażenia powietrza tlenkami siarki	11.04 18.04
8. Aktywność biologiczna gleb. Badanie respiracji gleby metodą SIR - cz. I 9. Ocena jakości wód powierzchniowych w rejonie na podstawie pomiarów produktywności i respiracji - cz. I	25.04
10. Aktywność biologiczna gleb. Badanie respiracji gleby metodą SIR. - cz II 11. Ocena jakości wód powierzchniowych w rejonie na podstawie pomiarów produktywności i respiracji cz. II	09.05 23.05
12. Odrabianie ćwiczeń i zaliczenie	30.05

REGULAMIN PRACOWNI

1. W pracowni STUDENCI mogą przebywać jedynie w obecności Prowadzącego.

2. Obowiązkiem STUDENTA jest utrzymanie ładu i czystości w miejscu pracy.

3. Podczas wykonywania ćwiczeń należy zachować spokój, powagę i unikać zbędnego gromadzenia się.

4. Ćwiczenia przeprowadzać z zachowaniem wskazanych przez Prowadzącego lub podręcznik środków ostrożności tak, aby nie narazić na niebezpieczeństwo siebie i innych.

5. Wykonywanie ćwiczenia i uruchomienie przyrządu może nastąpić tylko na polecenie Prowadzącego.

6. Pobrane odczynniki, szkło i przyrządy należy po zakończeniu ćwiczeń odnieść na właściwe miejsce w stanie czystym.

7. Każde uszkodzenie sprzętu lub szkła musi być zgłoszone Prowadzącemu.

8. Naczynia z chemikaliami należy zaraz po użyciu zamknąć właściwym korkiem. Nie dopuścić do pomieszania chemikaliów.

9. Nie należy wrzucać do kosza resztek niebezpiecznych substancji lecz zbierać je do przeznaczonych na ten cel pojemników.

10. Nie wrzucać do zlewów stłuczonego szkła i substancji stałych, które mogą spowodować zapchanie przewodów kanalizacyjnych.

11. Żadnych substancji i materiałów nie wolno z pracowni nikomu dawać, ani brać do domu.

12. W razie nieszczęśliwego wypadku należy natychmiast zgłosić się do nauczyciela i podać okoliczności wypadku. Nie wolno samemu podejmować środków zaradczych. We wszystkich sprawach nie objętych regulaminem należy zgłaszać się do Prowadzącego.

13. Zobowiązuje się wszystkich Studentów do ścisłego przestrzegania przepisów BHP dotyczących ćwiczeń laboratoryjnych.

INSTRUKCJA BHP

1. Prace doświadczalne należy zawsze wykonywać w fartuchu i rękawicach ochronnych.

2. W pracowni nie wolno spożywać żadnych produktów spożywczych. Na terenie całego budynku obowiązuje bezwzględny zakaz palenia.

3. Nie zapalaj ognia jeśli pracujesz z substancjami łatwopalnymi (eter, eter naftowy, benzen, aceton, itp.). Pamiętaj, że płytki elektryczne nie zabezpieczają przed zapaleniem się par większości rozpuszczalników organicznych. W przypadku rozlania się łatwopalnych cieczy zetrzyj je natychmiast starannie, a ściereczkę dokładnie spłucz wodą. Pożaru powstałego w skutek zapalenia się rozpuszczalników organicznych nie gas woda lecz kocem pożarniczym lub specjalną gaśnicą.

4. Wszystkie czynności ze stężonymi kwasami, amoniakiem, bromem i rozpuszczalnikami organicznymi przeprowadzaj pod sprawnie działającym wyciągiem.

5. Nie wlewaj nigdy wody roztworów kwasów lub zasad. Pamiętaj o zasadzie, że to kwas lub roztwór alkaliczny wlewamy do wody!!!

6. Nie pipetuj ustami żadnych roztworów. Posługuj się w tym celu pipetami wyposażonymi w gruszki gumowe. Pipetę używaną do pobierania stężonych kwasów lub zasad przepłucz natychmiast wodą. Kroplę stężonego kwasu lub ługu, jaka upadnie przypadkiem, np. na stół laboratoryjny natychmiast, starannie zetrzyj.

7. Przy oparzeniu skóry kwasem, ługiem- miejsce oparzone płucz dokładnie pod bieżącą wodą i przemyj odpowiednio: 2-3% roztworu wodorowęglanu sodowego w przypadku oparzenia kwasem i 1-2% roztworem kwasu octowego lub cytrynowego w przypadku oparzenia ługiem. Przy oparzeniu oczu- płucz je obficie wodą, wprowadzając strumień wody do zewnętrznych kącików powieki. Natychmiast udaj się do lekarza.

8. Po dostaniu się kwasu lub zasady do ust - przepłucz je natychmiast dużą ilością wody, a następnie odpowiednio rozcieńczonym roztworem wodorowęglanu sodowego, ewentualnie kwasu octowego czy cytrynowego.

9. Przy oparzeniu termicznym skóry z objawami I stopnia (zaczerwienienie, obrzęk, ból) - przemyj jej powierzchnię etanolem albo 10% roztworem nadmanganianu potasu. W razie poważnego oparzenia (oparzenie II stopnia, widoczne pęcherze), przemyj otoczenie rany etanolem, przykryj je gazą higroskopijna i udaj się do lekarza.

10. Zachowaj maksymalna ostrożność przy pracy z rtęcią. Nie rozlewaj (pary rtęci są silnie trujące)! W przypadku stłuczenia termometru rozlaną rtęć należy starannie zebrać do zamkniętego naczynia i zawiadomić pracownika.

11. Nie przechowuj nigdy roztworów alkalicznych w zetknięciu ze szlifem (biurety, butelki ze szlifem, itp.).

12. Przy montażu aparatury zaopatrzonej w szlify nie zapomnij o stosowaniu smaru na powierzchni złącza (wystarczy nałożyć smar na 1/3 długości złącza od szerszej strony szlifu).

13. Dla każdego roztworu używaj oddzielnej pipety szklanej. W przypadku niewielkich ilości cieczy należy używać pipet automatycznych z wymiennymi końcówkami automatycznymi. Końcówki należy zmienić po każdym odpipetowaniu roztworu.

14. Przy rozcieńczeniu roztworów posługuj się dokładnymi pipetami i kolbami miarowymi.

15. Na wadze analitycznej odważaj posługując się czystą łyżeczką oraz czystymi i suchymi naczyniami. Przed ważeniem oznacz położenie zerowe. Po ważeniu wagę wyłącz i usuń pędzelkiem ewentualne zanieczyszczenia. Łyżkę do ważenia substancji stałych po użyciu należy umyć i nie stosować jej do ważenia kilku różnych substancji.

16. Stosując wirowanie pamiętaj o następujących szczegółach:

1. poziom cieczy w probówkach powinien być co najmniej o 1 cm poniżej brzegu probówki;

2. w przypadku szklanych probówek konieczna jest podkładka (osłona) gumowa;

3. tulejki wraz z probówkami z cieczą winny być tarowane naprzeciwlegle, poziom cieczy w probówkach tarowanych winien być zbliżony;

4. przy ewentualnym stłuczeniu probówki w czasie wirowania należy natychmiast wyłączyć urządzenie i dokładnie oczyścić je z odłamków szkła i rozlanej cieczy.

17. Oszczędzaj odczynniki i szkło.

18. Posługuj się wyłącznie dokładnie umytym szkłem laboratoryjnym:

1. bezpośrednio po użyciu spłucz naczynie bieżącą wodą;

2. naczynia myj przy użyciu detergentu i z wykorzystaniem czystej szczotki;

3. spłucz bardzo starannie wodą bieżącą, aż do zupełnego usunięcia detergentu, co najmniej 3-krotnie spłucz szkło woda bieżącą i 1-krotnie destylowaną;

4. bączek do mieszadła magnetycznego należy wyjąć ze zlewki przed spłukaniem i umyć go osobno;

19. Pipety bezpośrednio po użyciu przemyj wodą bieżącą i wstaw do wysokiego naczynia wypełnionego roztworem detergentu.

20. Odpady:

1. zwykłe śmieci (papier, itp.)wyrzucane są do koszy z workami koloru czarnego;

2. zużyte końcówki do pipet automatycznych, eppendorfy, żele zawierające bromek etydyny i inne odpady toksyczne wrzuca się do specjalnych, oznakowanych pojemników;

3. odpady płynne należy magazynować w specjalnie przystosowanych i oznaczonych pojemnikach;

4. stłuczkę szklaną wyrzuca się do specjalnego pojemnika odpowiednio opisanego;

21. Przy konieczności wylatania do zlewu stężonego kwasu, zasady lub rozpuszczalników organicznych należy odkręć kran i strumieniem wody rozcieńczaj stężony związek, a następnie dokładnie spłucz zlew.

22. Wiele odczynników stosowanych w pracowni jest potencjalnymi truciznami. Często więc myj ręce podczas pracy i bezwzględnie po zdjęciu rękawiczek.

23. Po zakończeniu pracy uporządkuj swoje stanowisko. Wszystkie używane odczynniki i sprzęt laboratoryjny należy odstawić na miejsce.

Ćwiczenie 2

Biomarkery. Wybrane próby czynnościowe wątroby i trzustki w badaniach monitorujących.

1. Ilościowe oznaczanie kwasu hipurowego w moczu (metoda wagowa)

Na podstawie próby hipurowej można ocenić zdolności odtruwające wątroby. Próba ta polega na doustnym podaniu określonej dawki kwasu benzoesowego (dla dorosłej osoby b- 50 cm³ 3% roztworu benzoesanu sodu). Kwas benzoesowy wprowadzony do organizmu człowieka ulega w wątrobie połączeniu z glicyną do kwasu hipurowego, który następnie zostaje wydalony z moczem. Oznaczenie ilości tego kwasu wydalonego w ciągu 2 godzin pozwala na ocenę zdolności odtruwających wątroby.

C₆H₅COOH + H₂NCH₂COOH → C₆H₅CONHCH₂COOH + H₂O

Człowiek zdrowy wydala w ciągu 2 godzin 25-50% wprowadzonej dawki kwasu benzoesowego. Mniejsze wydalanie świadczy o zmniejszonej zdolności odtruwającej występującej przy uszkodzeniu miąższu wątrobowego.

Wykonanie oznaczenia:

Do zlewki przenieść 100 cm³ moczu oddanego 2 godziny po wypiciu 50 cm³ 3% r-ru benzoesanu sodu. Dodać 30 g chlorku sodu, rozpuścić całkowicie a następnie dodać 30 cm³ stężonego H₂SO₄. Wstawić na 15 minut do zamrażalnika. Kryształki kwasu hipurowego odsączyć na uprzednio zważonym sączku, przemyć lodowatą wodą, a następnie wysuszyć w temp. 100 ⁰C i zważyć powtórnie na wadze analitycznej. Przeliczyć na objętość moczu 2-godzinnego oraz wyliczyć jaki procent pobranej dawki kwasu benzoesowego został wydalony w ciągu 2 godzin.

2. Wykrywanie cukru i acetonu w moczu.

Ksenobiotyki (nadużycie alkoholu, zatrucia rtęcią lub tlenkiem ołowiu, niektóre leki np. furosemid) mogą być przyczyną przewlekłego zapalenia trzustki. Powstające zmiany strukturalne SA nieodwracalne i postępujące, upośledzona zostaje zarówno funkcja egzokryna (zmniejszanie wydzielania soków trawiennych) jak i endokrynna trzustki (uszkodzenie aparatu wysepkowego trzustki, zmniejszenie wydzielania insuliny). Konsekwencją zmniejszonego wydzielania insuliny jest wzrost stężenia glukozy we krwi, a po przekroczeniu progu nerkowego (160-180 mg/100 cm³ krwi) - pojawienie się cukru w moczu. Glukozouria występuje przy schorzeniach trzustki (cukrzyca), a tzw. glukozurię pokarmowa obserwuje się także u ludzi wygłodzonych po pierwszym obfitym posiłku. Jeżeli cukromocz stwierdza się przy prawidłowej zawartości cukru we krwi, to należy podejrzewać istnienie zaburzenia czynności cewek nerkowych.

Niedobór insuliny prowadzący do niedostatecznego dowozu glukozy do tkanek powoduje acetonurię. Stan ten jest typowy dla cukrzycy. W moczu świeżo oddanym może nie być acetonu a jedynie jego prekursory - np. kwas acetooctowy, który po pewny, czasie rozkłada się do CO₂ i acetonu, czy kwas β-hydroksymasłowy. Substancje te noszą wspólną nazwę „ciała ketonowe” (związki acetonowe), a stan zwiększonego ich wydalania z moczem to acetonuria lub ketonuria. Kwas acetooctowy powstaje wskutek niepełnej degradacji kwasów tłuszczowych przy wyczerpaniu zapasów węglowodanowych. Przedłużający się stan ketonurii prowadzi do wyczerpania rezerwy alkalicznej w organizmie organizmie do rozwoju kwasicy ketonowej. Acetonuria może czasem występować przy zatruciu etanolem, a także w warunkach głodu, zwłaszcza u dzieci lub po ciężkim wysiłku fizycznym na czczo.

Wykonanie oznaczenia:

Wykrywanie obecności cukru w moczu.

Próba Benedicta polega na redukcji przez glukozę i inne cukrowce niebieskiego jonu Cu⁺² do żółtopomarańczowego tlenku miedziowego. Słabą redukcję powoduja normalne składniki moczu np. kwas glukuronowy, kwas askorbinowy, a także niektóre leki.

Pobrać do probówki 1 cm³odczynnika Benedicta, dodać 1 kroplę moczu i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Oceny stężenia dokonuje się na podstawie zmiany barwy odczynnika:

barwa	stężenie glukozy	barwa	stężenie glukozy
bez zmian	0	oliwkowa, osad	1,0 g/100cm^3
zielona, brak osadu	0,1-0,3 g/100cm^3	pomarańczowa, osad	1,5 g/100 cm^3
zielona, osad	0,5 g/100cm^3	czerwona, osad	ok. 2,0 g/100 cm^3

Porównać z próbą, w której zamiast moczu zastosowano r-r glukozy

Wykrywanie acetonu w moczu

Do wgłębienia płytki porcelanowej wsypać szczyptę proszku Rothera, następnie nanieść kroplę moczu. Obecności acetonu powstaje intensywne fioletowe zabarwienie. Porównać z próbką, w której zamiast moczu naniesiono kroplę rozcieńczonego acetonu.

Odczynniki:

1. Odczynnik Benedicta (173g cytrynianu sodowego i 100 g bezwodnego węglanu sodowego rozpuścić na gorąco w 600-700 cm³ wody destylowanej, osobno rozpuścić 17,3 g siarczanu miedziowego w 100 cm³, zmieszać oba roztwory i dopełnić do 1000cm³ wodą).

2. Proszek Rothera (1 g nitroprusydku sodu rozetrzeć w moździerzu, dosypać 20 g siarczanu amonowego i 20 g bezwodnego węglanu sodowego, rozetrzeć na miałki proszek.

Ćwiczenie 3.

Farmaceutyki w środowisku. Ocena wpływu leków na behavior larw wodzienia (Chaoborus sp.)

1. Wprowadzenie

Wśród mikrozanieczyszczeń środowiska wodnego wzbudzających coraz większe zainteresowanie społeczeństwa i naukowców są farmaceutyki. Farmaceutyki są powszechnymi zanieczyszczeniami dostającymi się do środowiska z wielu rozproszonych źródeł: z urządzeń produkcyjnych, z hodowli ryb, z hodowli zwierzęcej i obiektów związanych z leczeniem ludzi. W konsekwencji, znaczące ilości farmaceutyków docierają do oczyszczalni ścieków, i jeśli nie są właściwie usuwane, są odprowadzane do wód powierzchniowych, gdzie mogą ulegać akumulacji i osiągać stężenia oddziaływujące na organizmy żywe.

Działanie leków w organizmie jest dobrze poznane przed wprowadzeniem preparatu do obrotu handlowego zostało dość dobrze przebadane, jednak działanie pozaustrojowe nie jest do końca znane. Na dzień dzisiejszy wiemy, że obecność pozaustrojowa leków powoduje mutację i powstanie odpornych kultur bakteryjnych., przez co wiele chorób wywołanych infekcją drobnoustrojową nie będzie mogło być leczone za pomoc znanych farmaceutyków. Stanowi to poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Stężenia farmaceutyków w środowisku osiągają znacznie niższe poziomy, niż te stosowane w celach leczniczych, jednak niebezpieczne może być długotrwałe narażenie organizmów żywych na mieszaninę wielu preparatów.

Badania sugerują, że przy obecnych poziomach farmaceutyków nie można wykluczyć ich efektów biologicznych w środowisku. Konieczne jest zatem intensywne poszukiwanie rozwiązań technologicznych, w tym możliwości jakie oferuje zaawansowane oczyszczanie ścieków (trzeciego stopnia).

Wodzień (Chaoborus) - owad należący do rzędu muchówek i rodziny wodzieniowatych. Postacie dorosłe tych zwierząt - imago swoim wyglądem przypominają komary, jednakże w odróżnieniu od nich samice wodzienia nie kąsają. Wodzienie przechodzą przeobrażenie zupełne. Chaoborus większość życia spędza w postaci larwalnej. Larwy są przezroczyste, trudno zauważalne "gołym okiem" i dlatego zwane są z angielskiego phantom midge larvae. Pomimo tego, że ciało wodzienia jest przezroczyste, po krótkiej obserwacji dostrzec można dobrze widoczne oko złożone, 2 pary przednich i tylnych pęcherzy pławnych, swoim kształtem przypominających ziarna fasoli oraz układ pokarmowy wypełniony pożywieniem. Larwy wodzienia zasiedlają wody stojące - jeziora, stawy, bajora itp., w zależności od rodzaju tego owada.

Celem ćwiczenia jest ocena stanu fizjologicznego larw wodzienia w środowisku zanieczyszczonym farmaceutykami za pomocą częstości skurczów ciała.

Materiały:

- pastylka ibuprofenu 200 mg,

- Tinctura valerianae - nalewka kozłkowa,

- Cardiamid coffein w kroplach,

- pastylka paracetamolu 200 mg,

- 6 zlewek o pojemności 500 ml,

- plastikowe kubki,

- moździeż, minutnik, termometr,

- pipety 5 ml

Wykonanie

A) Przygotowanie roztworów

R-r ibuprofenu i paracetamolu (0.3 mg/ml)

pastylkę ibuprofenu i pastylkę paracetamolu umyć pod bieżącą wodą, aby zmyć otoczkę. Rozgnieść osobno w moździeżu, rozpuścić w 600 ml wody destylowanej; po kilku minutach zlać do zlewki roztwór znad osadu.

R-r kropli walerianowych

odmierzyć 100 kropli nalewki kozłkowej i rozpuścić w 500 ml wody destylowanej

R-r kropli cardiamid-coffein

odmierzyć 80 kropli i rozpuścić w 500 ml wody destylowanej

B) ocena stanu fizjologicznego larw wodzienia za pomocą pomiaru częstości skurczów ciała

Doświadczenie wykonywane jest w 3 - 4 sekcjach. Kazdy z zespołów obserwuje wpływ ibuprofenu, paracetamolu, nalewki kozłkowej i kropli kardiamid-coffein na częstość skurczów ciała u 21 larw muchówki wodzienia (po 7 larw na kazdą badaną substancję). W tym celu należy do plastikowych kubeczków odlać ok. 100 ml wcześniej przygotowanych roztworów. Przed przystąpieniem do pomiarów skurczów ciała należy zmierzyć i zanotować temperaturę roztworów.

Metoda pomiaru:

Za pomocą pipety pobrać z hodowli jedną larwę i umieścić ją w kubeczkuu z czystą wodą (kontrola). Odczekać chwilę, a następnie liczyć skurcze ciała larwy przez 3 minuty (odliczanie należy rozpocząć w momencie jednego ze skurczów). Wynik zanotować. Następnie tego samego osobnika przenieść do kubeczka z badanym roztworem (za pomocą pipety w kropli wody, tak aby nie przenieść dużych ilości czystej wody do badanego r-ru. i po chwili rozpocząć zliczanie skurczów ciała, także przez 3 minuty. Wyni zanotować. Po pomiarze przenieść larwę do osobnej zlewki z czystą wodą, tak aby każda larwa była badana jednokrotnie.

Opracowanie wyników

Dla każdej z przebadanych larw policzyć zmianę częstości skurczów ciała (ilość skurczów ciała w r-rze np. ibuprofenu - ilość skurczów ciała w czystej wodzie = (+/-) zmiana). Wyniki dla wszystkich roztworów zebrać w tabeli, policzyć średnią dla każdego roztworu, a następnie za pomocą arkusza kalkulacyjnego wykonać wykres słupkowy (z naniesionymi odchyleniami standardowymi), na którym należy porównać badane grupy organizmów. Wyciągnąć wnioski.

Ćwiczenie 4 i 5

Interakcje substancji toksycznych w organizmie - efekt synergistyczny i potencjacja działania pestycydów i octanu tributylocyny

Wprowadzenie

W naturalnych warunkach środowiska organizmy zazwyczaj narażone są na działanie wielu czynników szkodliwych równocześnie. W badaniach laboratoryjnych określa się zazwyczaj toksyczność pojedynczo działającego związku. W praktyce nie jest możliwe (ani nawet celowe) ustalanie toksyczności działających równocześnie substancji obecnych w badaniej próbie w różnych możliwych kombinacjach. Dlatego też przeniesienie wyników laboratoryjnych do warunków naturalnych wiąże się z koniecznością przyjęcia pewnychj uproszczeń. Jednym z nich jest założenie, że toksyczność mieszaniny substancji chemicznych będzie sumą toksyczności jej składników (działanie addytywne). W wielu przypadkach jest to słuszne. Istnieją jednak sytuacje, gdy toksyczność mieszaniny jest znacząco wyższa, albo niższa. W pierwszym przypadku mamy do czynienia ze zjawiskiem potencjacji lub synergizmu, w drugim - z antagonizmem działania. Termin synergizm i potencjacja bywają używane zamiennie, co prowadzi do nieścisłości terminologicznych. Synergizmem nazywamy wystąpienie efektu toksycznego przy łącznym działaniu dwóch substancji o podobnym mechanizmie oddziaływania, przewyższającego toksyczność sumaryczną pojedynczych składników. Potencjację obserwuje się wówczas, gdy tylko jedna z substancji jest toksyczna, natomiast druga obecna jest w dawce nietoksycznej, jednak wzmaga toksyczność pierwszego składnika mieszaniny. Efektywność potencjacji mierzy się zwykle tzw. Współczynnikiem potencjacji (WP):

Jeżeli WP>>1, mamy do czynienia z potencjacją; gdy WP<<1, mamy do czynienia z antagonizmem.

Mechanizm potencjacji w powyższym rozumieniu polega najczęściej na hamowaniu przez potencjator enzymów detoksykacyjnych, które uczestniczą w metabolizmie danego związku toksycznego. Przykładem takiego działania może być współdziałanie butoksylanu piperonylu lub octanu tributylocyny i pestycydów pyretroidowych. Innym przykładem może być hamowanie karboksyloesteraz przez różne związki fosforoorganiczne, które działają tym samym jako potencjator względem innego pestycydu - malationu (insektycyd fosforoorganiczny).

Do potencjatorów należą różne związki. Najwcześniej stosowanym była sezamina - naturalny składnik oleju sezamowego. W 1958 r odkryto potencjację pomiędzy pochodnymi metylenodioksyfenylowymi (MDP), a insektycydami N-metylokarbaminowymi, co dało początek syntetycznym potencjatorom. Od tego czasu poznano i zaczęto stosować liczne przypadki potencjacji pestycydów. Układ MDP ma kluczowe znaczenie w oddziaływaniu synergistycznym blokując miejsce aktywne cytochromu P450 w układzie monooksygenaz. Z tego względu w badaniach zjawiska potencjacji potencjator podaje się szybciej niż właściwy insektycyd (w warunkach polowych obydwa składniki podawane są równocześnie)

Część praktyczna

Materiał do ćwiczeń

1. Równowiekowe larwy muchy mięsnej lub innego gatunku

2. trociny

3. 16 płytek Petriego

4. aceton,

5. octan tributylocyny , r-r w acetonie,

6. cypermetryna lub deltametryna,

7. zlewki, bagietki, pipety, mikrostrzykawki, probówki

Część I - założenie hodowli, intoksykacja organizmów, wyznaczenie stężenia pestycydu niepowodującego skutków letalnych w ciągu 24h

Płytki Petriego wyłożyć trocinami

W I części ćwiczenia należy przygotować standardową pożywkę dla larw umożliwiającą im żerowanie i zagrzebanie się w celu przejścia w stan poczwarki.

Ok. 5 g drożdży rozpuścić w 0.5 l ciepłej, przegotowanej wody wymieszać i odstawić. Odważyć 40 g zmielonego Murigranu, dodać ok. 25 ml uprzednio przygotowanej zawiesiny drożdży i dobrze wymieszać. Można pożywkę dla wszystkich grup przygotować jednocześnie, ponieważ jest ona taka sama. Ważne jest, aby grubość podłoża na płytce wynosiła ok. 5-7 mm, co umożliwia larwom zagrzebanie się.

1. Przygotowanie roztworów pestycydu i potencjatora

Przed przygotowaniem r-rów należy obliczyć jakie ilości preparatów należy pobrać, aby uzyskać nast. Stężenia:

Grupa II - 5 µg TBT/ 1 µl r-ru

Grupa III - 0,5 µg pestycydu/ 1 µl r-ru

Grupa IV - 5 µg TBT / 0.5 µl r-ru i 0.5 µg pestycydu /0.5 µl r-ru

Należy wziąść pod uwagę fakt, że r-r pestycydu i potencjatora w grupie IV jest bardziej stężony niż w pozostałych grupach.

2. Owady należy zatruwać indywidualnie umieszczając na grzbietowej stronie ciała 1 µl odpowiedniego r-ru za pomocą mikrostrzykawki.. Larwy grupy I otrzymują 1 µl acetonu. Należy uważać, aby nie skaleczyć larwy przez wbicie igły. Kolejność zatruwania powinna być następująca: Grupa I - Grupa IV (TBT) - Grupa II - Grupa III - Grupa IV (pestycyd)

PRZY ZMIANIE PODAWANEJ SUBSTANCJI STRZYKAWKI NALEŻY PRZEMYĆ ACETONEM!

Po zatruciu larwy przenieść do cieplarki (temp. ok. 25
)

Kontrolę hodowli należy przeprowadzić po 24, 48 i 168 h (notować datę oraz liczbę żywych larw - martwe larwy należy usunąć)

Część II - Odczyt wyników i likwidacja hodowli

1. Dla oceny potencjacji zakłada się 4 grupy doświadczalne na płytkach Petriego:

Grupa I - kontrola (intoksykowana acetonem)

Grupa II - kontrola eksperymentalna (intoksykowana synergetykiem w acetonie)

Grupa III - zatruwana pestycydem

Grupa IV zatruwana synergetykiem, a następnie pestycydem

Po 7 dniach od założenia hodowli usunąć pożywkę, zanotować liczbę poczwarek na każdej z płytek. Poczwarki zważyć i wydzielić dwie grupy wyraźnie różniące się masą (poczwarki lżejsze uznajemy za martwe).

Płytki Petriego należy umyć dokładnie w płynie do naczyń, wypłukać wodą wodociągową i destylowaną i wstawć do suszarki.

Sprawozdanie:

Do oceny śmiertelności w grupach II-IV zastosować wzór Abbotta, który koryguje wyniki względem grupy kontrolnej:

Gdzie:

P - śmiertelność skorygowana [%]

P_o - śmiertelność obserwowana w grupie zatruwanej [%]

P_c - śmiertelność w grupie kontrolnej (I) [%]

Ocenić śmiertelność po 24 i 48 h oraz w kolejnych interwałach czasowych. Do obliczeń należy przyjąć całkowitą śmiertelność owadóww grupie stwierdzoną od początku eksperymentu do dnia obserwacji.

Dla kolejnych przedziałów czasowych wyznaczyć współczynnik potencjacji WP podstawiając śmiertelność skorygowaną grupy III w liczniku i dla grupy IV w mianowniku

Poprawne wyliczenie WP opiera się na wyliczonej dawce LD₅₀ dla pestycydu i mieszaniny z TBT, jednak taki układ doświadczenia przekracza ramy czasowe zajęć. Z tego względu ocenę potencjacji należy przeprowadzić prostszą metodą:

WP<1 (zasadniczo WP<0.5; gdyż wartości bliskie 1 mogą być obarczone błędem pomiaru) - potencjacja;

WP> 1 (zasadniczo WP>2) - antagonizm

0.5<WP<2 - brak wyraźnej zależności pomiędzy potencjatorem a pestycydem

P_II + P_IV = P_IV - addytywność

Ćwiczenie 6

Rozkład materii organicznej. Badanie tempa dekompozycji przy pomocy sączków celulozowych.

Wprowadzenie

Jednym z najważniejszych procesów zachodzących w glebie jest dekompozycja materii organicznej. W wyniku tego procesu do atmosfery wydzielany jest CO₂, natomiast składniki odżywcze (N, P, K, Mg itp.) są mineralizowane do form dostępnych dla roślin. Dekompozycja materii organicznej jest procesem złożonym, w którym biorą udział nie tylko mikroorganizmy, ale również przedstawiciele mezo i mikrofauny glebowej. Skażenie gleby metalami ciężkimi może w znaczący sposób wpływać na tempo dekompozycji, stąd też parametr ten może być użyteczny do oceny skutków zanieczyszczenia metalami ekosystemów leśnych. Najczęściej stosowane metody pomiaru dekompozycji materii organicznej opierają się na pomiarze tempa ubytki masy naturalnego materiału organicznego (ściółka, igły, liście) lub materiałów standardowych (sączki ligninowe, kawałki drewna, paski bawełny) umieszczonych w glebie, w warunkach terenowych. Należą tutaj takie metody jak metoda woreczków ściółkowych, metoda pasków bawełnianych i metoda kawałków drewna, metoda pomiaru intensywności rozkładu błonnika i metoda pasków bait- lamina. Wszystkie wyżej wymienione metody mierzą ogólną aktywność biologiczną gleb.

W metodzie woreczków ściółkowych materiał roślinny - ściółka, liście lub igły - o znanej masie jest umieszczany w woreczkach wykonanych z nylonowej siatki i umieszczany w glebie na okres od kilku tygodni do kilku lat. Zaletą metody woreczków ściółkowych jest stosowanie materiałów pochodzenia naturalnego, co pozwala na bezpośrednie powiązanie uzyskanych wyników z procesami zachodzącymi w ekosystemie. Wadą metody jest trudność uzyskania jednorodnej ściółki(zwłaszcza jeśli badania prowadzi się przez kilka lat) oraz długi czas potrzebny do uzyskania miarodajnych wyników. Jednym ze sposobów rozwiązania problemu jest stosowanie zamiast ściółki materiałów standardowych jak np. sączki celulozowe.

W metodzie pasków bawełnianych i metodzie kawałków drewna materiał badawczy umieszcza się bezpośrednio w glebie. Po określonym czasie dokonuje się pomiarów wytrzymałości na zrywanie (w przypadku pasków bawełny) lub pomiaru ubytku masy (kawałki drewna). Zaletą tych metod jest łatwość pozyskania materiału, natomiast wadą zastosowanie materiałów, których rozkład jedynie przybliża naturalnie zachodzące procesy rozkładu, stąd też uzyskiwane tymi metodami wyniki mogą być trudne w interpretacji. Rozkład pasków bawełny jest znacznie szybszy niż rozkład kawałków drewna, jednakże zastosowanie tej metody wymaga specjalnego sprzętu pozwalającego na pomiar wytrzymałości pasków na zrywanie.

Wszystkie omówione dotychczas metody umożliwiają oszacowanie i porównanie tempa dekompozycji między różnymi glebami (np. zanieczyszczonymi w różnym stopniu). Jednakże przy prowadzeniu badań tymi metodami należy pamiętać, aby materiał był umieszczany zawsze na tym samym poziomie genetycznym gleby i pobierany do badań w takich samych odstępach czasu.

Opis wykonania doświadczenia

Woreczki ściółkowe umieszcza się w glebie w kilku - kilkunastu blokach (minimum 5, choć dobrą dokładność uzyskuje się dopiero przy 10 próbach), każdy złożony z kilku - kilkunastu woreczków w zależności od przewidywanego czasu trwania eksperymentu i ilości zbiorów. Co pewien czas pobiera się po jednym woreczku z każdego bloku i w laboratorium waży ich zawartość, oznaczając ubytek masy jako funkcję czasu. Woreczki ściółkowe zapewniają swobodną wymianę wody, powietrza i składników odżywczych pomiędzy materiałem z woreczka a gleba, dzięki czemu mineralizacja badanego materiału zachodzi w warunkach zbliżonych do naturalnych. Dobór odpowiedniej wielkości oczek siatki pozwala na kontrolowanie, które grupy makrofagów glebowych będą miały dostęp do materiału zawartego w woreczkach, a tym samym będą brały udział w jego mineralizacji. Wielkość oczek jest także determinowana przez rodzaj używanego do badań materiału - w przypadku stosowania liści oczka mogą być większe niż w przypadku, gdy do badań używane są igły. Najczęściej stosowana jest siatka o oczku o średnicy ok. 1 mm. Wielkość woreczków oraz ich liczba w jednym bloku uzależniona jest od planowanego czasu trwania badań, a ten z kolei od szybkości rozkładu używanego materiału.

Materiały i sprzęt:

- sączki celulozowe

- siatka nylonowa o odpowiedniej średnicy oczek (dobrze nadaje się nylonowa gładka firanka)

- nić nylonowa

- waga laboratoryjna

- suszarka laboratoryjna

- nierozkładalne etykiety (np. taśma samoprzylepna)

1. Zważyć sączki wysuszone w temperaturze pokojowej. Wysuszyć sączki w suszarce w 105⁰C do stałej masy, zważyć ponownie i wyznaczyć zawartość wody w materiale w temperaturze pokojowej.

2. Z siatki nylonowej uszyć woreczki o wymiarach 10×10 cm.

3. Przygotować nierozkładalne, niezmywalne etykiety do woreczków. Etykiety posłużą do identyfikacji woreczków w terenie i mogą zawierać kolejne numery lub też dodatkowe informacje zakodowane w postaci znaków lub kolorów.

4. Sączki umieścić w woreczkach. Woreczki umieścić w terenie w wierzchniej warstwie ściółki, przytwierdzając je do podłoża plastikowymi lub metalowymi szpilkami. Przy umieszczaniu woreczków w terenie należy stosować układ w blokach, gdzie poszczególne bloki będą stanowiły powtórzenia pomiarowe. Bloki rozmieszczać w układzie systematycznym lub losowym.

5. Woreczki zbierać z terenu po jednym z każdego bloku w odstępach czasu zależnych od typu ekosystemu i celu badań (po 2 tygodniach, 3, 4, 8).

6. Zebrane woreczki należy oczyścić z zanieczyszczeń mechanicznych , wyjąć sączki i wysuszyć w suszarce do stałej masy w 105⁰C. Obliczyć utratę suchej masy biorąc pod uwagę wyjściową suchą masę sączka.

7. Na podstawie ubytku masy obliczyć tempo dekompozycji sączka

Ćwiczenie 7

Oznaczanie aktywności mikrobiologicznej gleb. Procedura oznaczania aktywności mikroorganizmów glebowych metodą oddychania indukowanego przez dodanie substratu (SIR)

Wprowadzenie

Metoda SIR wykorzystuje zjawisko wzrostu tempa respiracji wywołanego pojawieniem się w środowisku życia mikroorganizmów źródła łatwo dostępnego węgla. W metodzie tej ilość biomasy wyznacza się na podstawie pomiaru maksymalnego tempa oddychania występującego po dodaniu substratu, jakim jest glukoza. Oddychanie mierzy się jako ilość wydzielonego C)₂ na godzinę. Ilość wydzielonego CO₂ można oznaczyć takimi metodami jak w oznaczeniach respiracji podstawowej - jedyną różnicą jest krótszy czas inkubacji próbek. Metoda SIR służy do oznaczania aktywnej biomasy heterotroficznych mikroorganizmów tlenowych i opracowana została dla gleb użytkowanych rolniczo, niemniej jednak często jest także stosowana dla gleb leśnych.

Procedura oznaczania biomasy mikroorganizmów glebowych metodą SIR

Materiały i sprzęt

- gleba o znanej wilgotności i znanej maksymalnej pojemności wodnej;

- r-r glukozy

-waga analityczna;

- cieplarka;

- słoiki o pojemności ok. 1 dm³ szczelnie zakręcane;

- zlewki lub probówki o objętości 20 cm³ i 150cm³;

- kolby miarowe o pojemności 100, 250 i 1000 cm³;

- pipety,

Odczynniki

- r-r mianowany NaOH 0,2M

- r-r mianowany HCl 0,1M

- r-r BaCl₂ 20%

- r-r fenoloftaleiny 1%,

Przygotowanie próbek

- zmierzyć wilgotność gleby i maksymalną pojemność wodną

- dodać do próbek taką ilość wody, aby osiągnąć wilgotność równą 50% maksymalnej pojemności wodnej

Oznaczenie tempa respiracji

Do zlewek o pojemności 150 cm³ naważyć 5-10 g gleby (w przeliczeniu na suchą masę). Dodać glukozę w takiej dawce, aby wydzielanie CO2 było największe (dawka zależna jest od aktywności gleby i powinna mieścić się w zakresie (0,5÷6 g/kg). Glukozę dodać w formie roztworu, którego ilość i stężenie należy dobrać tak, aby po dodaniu r-ru próbka miała wilgotność mniejszą niż 60% WHC. Po dodaniu glukozy do każdej próbki dodać wody destylowanej, aby uzyskać wilgotność równą 60% WHC. Glebę dokładnie wymieszać, aby rozprowadzić r-r glukozy po całej jej objętości. Zlewki z glebą włożyć do słoików, do każdego ze słoików włożyć też zlewkę 20 cm³ zawierającą 5 cm³ 0,2M NaOH. Słoiki szczelnie zamknąć i umieścić w inkubatorze w temp. 22⁰C. Zmierzyć czas zamknięcia słoików z dokładnością do minuty. Przygotować co najmniej 3 ślepe próby umieszczając w pustych słoikach zlewki o pojemności 20 cm³ zawierające 5 cm³ 0,2M NaOH. Po upływie 4 h otworzyć słoiki, wyjąć zlewki z r-rem NaOH, dodać do nich 2 cm³ r-ru BaCl₂, dwie krople fenoloftaleiny i odmiareczkować nadmiar zasady 0,1M HCl. Miareczkowanie wykonać dla wszystkich prób oraz prób ślepych.

Obliczenia

Obliczyć tempo respiracji próby (ml CO₂/gh) według wzoru

Gdzie:

R - tempo respiracji (ml CO₂/gh);

X_sl - średnia ilość ml 0,1M HCl zużyta do odmiareczkowania prób ślepych;

X_i - ilość ml 0,1M HCl zużyta do odmiareczkowania i-tej próby;

T - czas inkubacji (w godzinach)

m_i - masa i-tej próbki (g suchej masy)

Obliczyć biomasę na podstawie równania

C_mic= 40∙R+0,37

Gdzie

C_mic - węgiel biomasy mikroorganizmów (mg/g)

R - tempo wydzielania CO₂ (ml/gh)

Ćwiczenie 8 i 9

Ocena stanu zanieczyszczenia powietrza metodą skali porostowej. Odczyn kory drzew i gleby jako wskaźnik skażenia powietrza tlenkami siarki

Porosty (Lichenes) składają się z dwóch odrębnych współżyjących ze sobą organizmów: glonu i grzyba. Taka symbioza pozwala porostom rosnąć na nagich skałach, drzewach, płotach, a nawet murach domów. Grzyb dostarcza, z podłoża na którym rośnie, wodę z solami mineralnymi oraz zabezpiecza glon przed wysychaniem. Glon natomiast, dzięki zdolności fotosyntezy, produkuje substancje organiczne będące pokarmem dla obydwu komponentów. Porosty mogą pobierać również substancje odżywcze prosto z atmosfery - zawarte w pyłach i gazach - akumulują w swojej plesze również substancje trujące - są więc bardzo dobrymi organizmami wskazującymi stopień zanieczyszczenia atmosfery, zwłaszcza że mogą rosnąć tam, gdzie dla innych roślin jest zbyt mało gleby lub wody.

Skala porostowa to ukazanie w formie np. fotografii porostów, które są charakterystyczne dla środowisk o określonym stężeniu dwutlenku siarki. Na drzewach danego terenu należy odszukać porosty i po dokonaniu identyfikacji wystarczy odczytać przy odpowiedniej parze zdjęć podane wartości SO₂. Biorąc pod uwagę występowanie określonych porostów nadrzewnych przy określonym stężeniu dwutlenku siarki w powietrzu kwalifikuje się dany obszar do określonej strefy porostowej. Podstawową ilością stref jest 3, ale często badacze zwiększali ich ilość na skutek wyróżniania stref przejściowych.

Przykład skali porostowej.

Przykłady porostów epifitycznych		Stężenie SO2 (mikrogram/m^3)	Strefa porostowa	Opis
epifitów brak	glony	powyżej 170	1	Pustynia porostowa. Brak porostów nadrzewnych, na pniach mogą występować glony. Duże miasta i ośrodki przemysłowe.
misecznica proszkowata	obrost	170-100	2	Na korze drzew występują najodporniejsze porosty skorupiaste (proszkowate). Obszary w miastach i ośrodkach przemysłowych.
pustułka pęcherzykowata	złotorost ścienny	100-70	3	Na pniach drzew mogą rosnąć porosty listkowate. Obszary zadrzewione na obrzeżach miast.
mąkla tarniowa	obrost gniazdkowaty	70-50	4	Porosty listkowate. Mogą pojawiać się gatunki krzaczkowate. Obszary leśne w pobliżu miast i ośrodków przemysłowych.
mąklik otrębiasty	Flavoparmelia caperata	50-40	5	Porosty listkowate zajmują znaczne powierzchnie na pniach drzew, spotyka się też porosty krzaczkowate. Najczęściej duże obszary leśne.
brodaczka	odnożyca mączysta	40-30	6	Pnie i gałęzie drzew obficie pokryte porostami skorupiastymi, listkowatymi i krzaczkowatymi. Rozległe, naturalne kompleksy leśne.
granicznik płucnik	Nephroma resupinatum	poniżej 30	7	Nieliczne w Polsce obszary o powietrzu prawie czystym, z bogatą florą porostów na pniach i gałęziach drzew.

Badanie kwasowości gleby

Związki zakwaszające środowisko pochodzą głównie z niewłaściwego nawożenia mineralnego i organicznego oraz emisji do atmosfery zanieczyszczeń gazowych: dwutlenku siarki, tlenków azotu i amoniaku. W atmosferze przebiegają procesy, w wyniku których powstaje kwas siarkowy (VI), kwas azotowy (V) i ich sole, które w wyniku suchej lub mokrej depozycji osiadają na powierzchni gruntów i wód powierzchniowych (kwaśna depozycja). Amoniak natomiast ulega w atmosferze uwodnieniu, w wyniku czego powstają jony amonowe NH₄⁺. Wpływają one pośrednio na proces zakwaszenia, ponieważ po zdeponowaniu w glebach lub wodach ulegają nitryfikacji według reakcji:

NH₄⁺ + 2O₂ NO₃^- + H₂O + 2H⁺

Zwiększenie kwasowości środowiska glebowego poniżej wartości pH=4,2 obserwowane w odniesieniu do jakiegoś przedziału czasu powoduje szereg niekorzystnych procesów:

1. zubożenie zawartości składników odżywczych (kationów zasadowych) przez ich wypłukiwanie (ługowanie) z gleby

2. występowanie dysharmonii pokarmowej w zakresie zaopatrzenia roślin w składniki odżywcze

3. uwalnianie glinu (Al³⁺), który jest silnie fitotoksyczny, oddziałuje szkodliwie na system korzeniowy roślin powodując ich zamieranie

4. wzrost mobilności i dostępności dla roślin metali ciężkich zawartych w glebie

5. wypłukiwanie anionów, jonów wodorowych, glinu i metali ciężkich do wód powierzchniowych i podziemnych

6. zaburza rozwój i aktywność niektórych grup mikroorganizmów glebowych

7. ogranicza a nawet eliminuje ze środowiska dżdżownice uczestniczące w tworzeniu próchnicy

Kwasowość gleby oznacza stężenie jonów wodorowych w roztworze glebowym i jest wyrażana najczęściej w miligramorównoważnikach lub milimolach ładunków dodatnich na 100 g gleby. Z analitycznego punktu widzenia wyróżniamy w glebie kwasowość:

1. czynną - spowodowaną obecnością jonów wodorowych pojawiających się w roztworze glebowym po zalaniu gleby wodą

2. potencjalną - związaną z tą częścią jonów wodorowych, która jest silniej związana w kompleksie glebowym. wyróżnia się tutaj kwasowość potencjalną wymienną i hydrolityczną.

Przebieg ćwiczenia

Ćwiczenie nr 9

W trakcie ćwiczenia grupa studencka uda się w teren w celu poboru prób gleby oraz wykonania dokumentacji fotograficznej obrostów drzewnych. Studenci powinni w dniu ćwiczenia przynieść pojemniki z tworzywa sztucznego na próbki gleby (5 szt), łopatki, taśmy miernicze, aparat fotograficzny.

Ćwiczenie nr 10

W trakcie ćwiczenia wykonane zostaną analizy prób gleby pobranych w poprzednim tygodniu i wysuszonych powietrznie w laboratorium

Wykonanie oznaczeń

Odczynniki i materiały

1M r-r KCl

0,1M r-r NaOH

1% r-r fenoloftaleiny

0,5M r-r octanu wapnia

pehametr, mieszadło magnetyczne lub wytrząsarka, pipety, zlewki, cylindry, bagietki, waga analityczna

Pobraną glebę wysuszyć powietrznie w laboratorium, a następnie oddzielić części szkieletowe od ziemistych przesiewając glebę przez sito.

1. oznaczenie kwasowości czynnej

Odważyć 10 g gleby. Dodać 25 cm³ wody destylowanej i wymieszać. Po 10 min. zmierzyć pH

2. oznaczenie kwasowości wymiennej

Odważyć 10 g gleby. Dodać 25 cm³ 1M KCl i wymieszać. Po 10 min. zmierzyć pH

3. oznaczenie kwasowości hydrolitycznej

Odważyć 100 g gleby. Dodać 250 cm³ 0,5 M octanu wapnia i mieszać na mieszadle przez 1 godzinę. Następnie przesączyć na lejku Buchnera. Pobrać 125 cm³ klarownej cieczy miareczkować 0,1M r-rem NaOH wobec fenoloftaleiny

Kwasowość hydrolityczną wyraża się ilością zużytego roztworu NaOH lub w milirównoważnikach wodoru w przeliczeniu na 100 g gleby.

Kwasowość hydrolityczną (H_h) obliczyć ze wzoru:

H_h = V × c × 2 × k [mmol(+)/100g]

gdzie:

V - objętość r-ru NaOH zużytego na zmiareczkowanie (cm³)

c - stężenie r-ru NaOH (mmol)

2 - współczynnik przeliczenia na 100 g gleby

k - współczynnik empiryczny, który pozwala na wyliczenie całkowitej kwasowości na podstawie jednorazowego wytrząsania, waha się od 1,5 do 2 w zależności od składu granulometrycznego gleby

Uzyskany wynik porównać z danymi z tabeli i zakwalifikować badaną glebę do określonej klasy

pH (KCl)	Gleby
< 4,5	bardzo kwaśne (bielicowe, torfowe torfowisk wysokich)
4,6-5,5	kwaśne (bielicowe, rdzawe płowe, torfowe torfowisk wysokich)
5,6-6,5	słabo kwaśne (czarnoziemy, brunatne, płowe, deluwialne)
6,6-7,2	obojętne (czarnoziemy, brunatne, mady, mułowo-gytiowe)
> 7,2	zasadowe (rędziny słone)

Ćwiczenie 10

Ocena jakości wód powierzchniowych w rejonie Górnego Śląska na podstawie pomiarów produktywności i respiracji (PN-88 C-05552)

Produkcja pierwotna - szybkość, z jaką producenci w biocenozie gromadzą energię promieniowania słonecznego w postaci energii chemicznej, zmagazynowanej w materii organicznej, stanowiącej potencjalne źródło pokarmu.

W ćwiczeniu wykorzystuje się możliwość pomiaru zawartości O₂ w zamkniętych butelkach ciemnej i jasnej, w których znajdują się próbki wód naturalnych. Metoda służy do oceny stopnia zanieczyszczenia wód rzecznych w okresie wegetacji sestonu, który można określić na podstawie wartości współczynnika charakteryzującego stosunek produkcji do respiracji P/R. Wskaźnik ten określa się w warunkach standardowych świetlno-termicznych i oblicza z wielkości produkcji potencjalnej brutto i oddychania. Jest on przydatny jako oznaczenie kontrolne w badaniach przebiegu oceny procesu samooczyszczania wód oraz do oceny jakości wody przeznaczonej do celów komunalnych, rolniczych, przemysłowych i rekreacyjnych.

Zasada metody

Badanie polega na oznaczeniu współczynnika P/R na podstawie stosunku ilości wytworzonego tlenu w procesie fotosyntezy w jasnych (niezaciemnionych) próbkach przy odpowiednim oświetleniu, do zużytego tlenu w procesie oddychania mikroorganizmów w ciemnych (zaciemnionych) próbkach po 7 dniowej inkubacji. Badanie prowadzi się w temperaturze pokojowej. Wartość współczynnika obrazuje stopień zanieczyszczenia z badanego miejsca rzeki. Na podstawie zmian zawartości tlenu rozpuszczonego po uwzględnieniu początkowego jego stężenia oblicza się współczynnik P/R. Zawartość tlenu w próbkach oznaczana jest metodą Winklera.

Wykonanie oznaczenia

Odczynniki i materiały

butelki szkalne o pojemności 100 ml z doszlifowanymi korkami,

folia aluminiowa,

lewar,

alkaliczny r-r jodku potasu z azydkiem sodowym

siarczan manganawy

kwas siarkowy stężony

skrobia r-r 0,5%

tiosiarczan sodu 0,025 n

Próbkę wody powierzchniowej wymieszać delikatnie bagietką szklaną, a następnie za pomocą lewara napełnić 3 butelki szklane.

W 1 butelce oznaczyć natychmiast zawartość tlenu rozpuszczonego. Kolejną butelkę zaciemnić owijając ją folią aluminiową, zabezpieczyć korki przed wypadnięciem. Pozostałą butelkę pozostawić niezaciemnioną zabezpieczając również korek.

Butelki umieścić pod lampami w pozycji leżącej na 7 dni. Po tym czasie oznaczyć zawartość tlenu rozpuszczonego. Na podstawie zawartości tlenu w próbkach przed inkubacją i po inkubacji oznaczyć produkcję potencjalną brutto i oddychanie bisestonu.

Wykonanie oznaczenia tlenu metodą Winklera

Po otwarciu butelki wprowadzić pipetą 2 cm³ siarczanu manganawego tak, aby zanurzyć ją do dna i wyjmować pipetę w miarę wypływania z niej odczynnika. Następnie drugą pipetą wprowadzić do niej 2 cm³ jodku potasu zanurzając koniec pipety pod powierzchnię cieczy. Butelkę zakorkować nie pozostawiając w niej pęcherzyka powietrza. Starannie wymieszać przez kilkakrotne obrócenie dnem do góry, a następnie odstawić w ciemne miejsce. Po opadnięciu osadu wodorollenków manganu wprowadzić pod powierzchnię cieczy 2 cm³ stężonego kwasu siarkowego i ponownie zakorkować bez pęcherzyka powietrza. Zawartość butelki wymieszać jak wyżej aż do całkowitego rozpuszczenia osadu. Pobrać z butelki 100 cm cieczy i przenieść ją do kolby stożkowej. Zawartość kolby miareczkować tiosiarczanem sodu aż do uzyskania bladożółtego zabarwienia. Dodać 1-2 cm³ skrobii i domiareczkować do pierwszego zniknięcia barwy fioletowo-niebieskiej.

Zawartość tlenu rozpuszczonego obliczyć z wzoru:

X =

gdzie:

a - ilość tiosiarczanu zużyta do zmiareczkowania próby, cm³

V - objętość próby wzięta do miareczkowania, cm³

0,2 - ilość tlenu odpowiadająca 1 cm ściśle 0,025 n tiosiarczanu sodowego, mg

Obliczanie wyników

Produkcję brutto (P) obliczyć wg wzoru

P =

gdzie:

BI - zawartość tlenu w próbkach niezaciemnionych po inkubacji, mg/l,

BC - zawartość tlenu w próbkach ciemnych po inkubacji, mg/l,

PQ - iloraz fotosyntezy biosestonu = 1,25.

Oddychanie (R) obliczyć w mg/l wg wzoru

R = P - BC·RQ

gdzie:

P- początkowa zawartość tlenu przed inkubacją, mg/l

BC - zawartość tlenu w próbkach ciemnych po inkubacji, mg/l

RQ - iloraz respirometryczny biosestonu = 0,8

Za wynik końcowy oznaczenia przyjąć wartość współczynnika P/R i zinterpretować go zgodnie z zależnościami podanymi w tabeli

Wartości współczynnika P/R	Stopień zanieczyszczenia	Charakterystyka
<1.0	I	wody silnie zanieczyszczone związkami organicznymi, przeważają procesy rozkładu
1.0÷2.0	II	wody średnio zanieczyszczone związkami organicznymi i mineralnymi, zachodzą procesy rozkładu z niewielką przewagą procesów produkcji
2.0÷6.0	III	wody słabo zanieczyszczone związkami organicznymi, lecz silnie zanieczyszczone związkami mineralnymi, procesy produkcji wyraźnie przeważają nad procesami rozkładu
>6.0	IV	wody silnie zanieczyszczone związkami mineralnymi, zachodzą głównie procesy produkcji z częstymi i długotrwałymi zakwitami fitoplanktonu

WSKAŹNIKI STOSOWANE PRZY OCENIE EUTROFIZACJI ŚRÓDLĄDOWYCH WÓD POWIERZCHNIOWYCH I MORSKICH

Wartości graniczne podstawowych wskaźników eutrofizacji, wód powyżej których występuje eutrofizacja

Wskaźniki	Jednostki	Wody stojące  (sezon wegetacyjny)	Wody płynące  (średnia roczna)	Morskie wody wewnętrzne^2)	Morskie wody przybrzeżne
Fosfor ogólny	mg P/dm^3	> 0,1	> 0,25	> 0,3	> 0,1
Azot ogólny	mg N/dm^3	> 1,5	> 5	> 7	> 4
Azot azotanowy	mg NNO3/dm^3	-	> 2,2	> 3,4	> 1,8
Azotany	mg NO3/dm^3	-	> 10	> 15	> 8
Chlorofil a	μg/dm^3	> 25	> 25^1)	> 50 / > 30^3)	> 10
Przezroczystość	m	< 2	-	< 4	< 2

¹⁾ Dotyczy rzek o wystarczająco długim dla rozwoju glonów czasie rezydencji wody.
²⁾ Z wyłączeniem morskich wód wewnętrznych Zatoki Gdańskiej.
³⁾ Na odcinku przyujściowym rzeki Odry > 50 / na odcinkach przyujściowych w zlewniach pozostałych rzek >30.

Ćwiczenie 11 i 12

Wpływ zanieczyszczenia podłoża na zawartość chlorofilu u roślin wskaźnikowych

Analizę barwników chloroplastowych przeprowadza się po wyekstrahowaniu ich z tkanek roślinnych za pomocą rozpuszczalników organicznych. Użycie rozpuszczalników organicznych jest niezbędne ze względu na lipofilne właściwości barwników.

Fotosynteza to złożone reakcje syntezy związków organicznych z prostych substancji nieorganicznych (CO₂, H₂O), odbywające się z wykorzystaniem energii świetlnej. W procesie tym powstają związki o mniej utlenione, a tym samym bogatsze w energię. Im bardziej zredukowany jest związek (im więcej zawiera atomów H) tym ma wyższą wartość energetyczną. Głównymi związkami powstającymi w wyniku redukcji CO₂ są cukry.

Fotosynteza przebiega w chloroplastach w dwóch fazach: świetlnej (w tylakoidach chloroplastów) i ciemnej (w stromie chloroplastu). Istotą fazy świetlnej jest przekształcenie energii świetlnej w energię wiązań chemicznych zawartych w ATP W fazie świetlnej biorą udział dwa fotosystemy (fosforylacji cyklicznej i niecyklicznej) chlorofilu, określane jako PS I i PS II, różniące się głównie właściwościami występujących w nich cząstek chlorofilu i karotenoidów.

Z fosforylacją niecykliczną jest związana fotoliza H₂O, która polega na rozpadzie cząsteczki pod wpływem światła na jony wodorowe (H⁺). i wodorotlenowe (OH^-). Jony wodorowe tworzą NADPH₂, który łącznie z ATP stanowi siłę asymilacyjną wykorzystywaną w fazie ciemnej, natomiast z jonów wodorotlenowych uwalnia się tlen, będący końcowym produktem fotosyntezy.

Równanie fosforylacji fotosyntetycznej niecyklicznej

światło

NADP + H₂O + ADP + P_i NADPH₂ + ATP + ½ O₂

chlorofil

gdzie: P_i - reszta kwasu fosforowego

Ciemna faza fotosyntezy zwana także cyklem Calvina -Bensona, polega na fotosyntetycznym cyklu redukcji CO₂, podczas którego zachodzą 3 etapy przemian:

1. karboksylacja (czyli przyłączenie cząsteczki CO₂),

2. redukcja (w tej fazie jest zużywana „siła asymilacyjna”: ATP i NADPH + H⁺)

3. regeneracja (polega na odtworzeniu związku pięcioweglowego (RuDP) z cząsteczek związku trójwęglowego (PGA).

Produktem końcowym fotosyntezy jest glukoza, która powstaje w wyniku wielu złożonych reakcji.

Niektóre węglowodany, wytworzone w fazie ciemnej są później użytkowane jako źródło energii, inne natomiast - jako surowce do produkcji niezbędnych dla komórki roślinnej związków organicznych, np komórki roślinne wykorzystując pobrane z gleby takie składniki mineralne jak azotany i siarczany mogą przekształcać węglowodany w aminokwasy, elementy budulcowe białek.

Dzięki istnieniu fotosyntezy możliwe jest przekształcanie energii świetlnej w energię chemiczną, wytwarzanie związków organicznych z CO₂ i H₂O i uwalnianie tlenu.

Produkty fotosyntezy, utrzymujące życie i rozwój roślin samożywnych są warunkiem istnienia organizmów cudzożywnych, gdyż dostarczają im pokarmu, tlenu i energii.

Chlorofil - główny barwnik fotosyntezy, pochłania światło widzialne przede wszystkim w zakresie światła niebieskiego i czerwonego widma, nie pochłania natomiast światła zielonego, które się od niego odbija. Rośliny na ogół wydają się zielone, ponieważ ich liście odbijają większość zielonego światła, które na nie pada.

Istnieje kilka rodzajów chlorofilu. Najważniejszy z nich to chlorofil a, barwnik rozpoczynający reakcje zależne od światła. Dodatkowym barwnikiem, który bierze udział w fotosyntezie, jest chlorofil b. Różni się on od chlorofilu a jedynie grupą funkcyjną pierścienia porfirynowego - grupa metylowa (-CH₃) chlorofilu a jest zastąpiona grupą aldehydową (-CHO) w chlorofilu b. Ta różnica przesuwa długość fali światła pochłanianego i odbijanego tak dalece, że chlorofil b ma barwę zielonożółtą, podczas gdy chlorofil a jaskrawozieloną.

Komórki roślinne zawierają także inne dodatkowe barwniki fotosyntetyczne np. karotenoidy o zabarwieniu żółtym i pomarańczowym. Pochłaniają one światło o innej długości fali niż chlorofil, dzięki czemu powiększa się zakres widma światła, które dostarcza energii do fotosyntezy. Chlorofil może być wzbudzony bądź światłem, bądź energią przekazaną z innych barwników, które zostały wzbudzone światłem. Jeśli zatem cząsteczka karotenoidu zostanie wzbudzona, jej energia może być przekazana chlorofilowi.

Wykonanie oznaczenia

Materiał

Nasiona wyki na 3 tygodnie przed terminem badania namoczyć przez noc w wodzie, a następnie wysiać do gleby lub uprawy hydroponicznej, (gdzie zamiast gleby zastosować wyciąg glebowy) 3 - 5 skiełkowanych nasion wyki (w zależności od wielkości naczynia testowego). Równolegle przygotować po 3 powtórzenia dla każdego rodzaju gleby, próbę kontrolną (w której jako podłoże zastosować niezanieczyszczoną glebę lub płynne podłoże mineralne) oraz tzw. kontrolę pozytywną, gdzie do podłoża należy wprowadzić substancję hamującą syntezę chlorofilu. Siewki ustawić w fitotronie, lub pod lampami zapewniając cykl świetlny mi. 16/8 h dzień/noc. Wilgotność gleby utrzymywać na stałym poziomie; W hodowlach hydroponicznych uzupełniać podłoże płynne tak, aby końce korzeni zawsze znajdowały się pod powierzchnią cieczy. Hodowlę kontrolować 3 razy w tygodniu!!

Ekstrakcja chlorofilu

Sprzęt

moździerze porcelanowe, probówki, lejki, sączki, waga, nożyczki, spektrofotometr

Odczynniki

aceton schłodzony do 4⁰C

benzyna ekstrakcyjna

Z każdej próby zważyć trzy łodygi, zmielić je w moździerzu i ekstrahować chlorofil dwiema 10-mililitrowymi porcjami acetonu schłodzonego do 4ºC. Po przesączeniu roztworu przez karbowane sączki dodać do niego po 5 cm³ wody destylowanej i mierzyć absorbancję roztworu przy dwóch długościach fali - 645 nm i 663 nm.

Zawartość chlorofilu obliczyć na podstawie wzorów:

C_a = (12,7A₆₆₃ - 2,7A₆₄₅)/m

C_b= (22,9A₆₄₅ - 4,7A₆₆₃)/m

Rozdział barwników metodą Kraussa

Do suchej probówki nalać 2 ml wyciągu barwników. Dodać 4 ml benzyny i silnie wstrząsnąć. Odczekać kilka minut. Jeżeli uzyskany rozdział nie będzie wyraźny należy dodać 3 krople wody destylowanej i ponownie wstrząsnąć. Zanotować barwy poszczególnych warstw. Porównać ekstrakty uzyskane z różnych prób.

Literatura wykorzystana do przygotowania instrukcji

Bajguz A., Piotrowska A.: Ćwiczenia z toksykologii środowiska. Wydawnictwo Uniwersytetu w Białymstoku, 2005.

Adomas B., Murawa D.: Ćwiczenia z toksykologii środowiska. Wydawnictwo Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego, Olsztyn, 2006.

Namieśnik J. (red): Zarys ekotoksykologii. Franciszkański ruch Ekologiczny Eko-Pharma, Gdańsk, 1999.

Kozak D., Chmiel B., Niećko J.: Ochrona środowiska. Wydawnictwo UMCS, Lublin, 1999.

PN-88 C-05552 - Woda i ścieki. Badanie stopnia zanieczyszczenia wód rzecznych z zastosowaniem testu ciemnych i jasnych butelek.

Praca zbiorowa: Toksykologia żywności. Przewodnik do ćwiczeń. Wydawnictwo SGGW, Warszawa, 2004.

---