 | Pobierz cały dokument pcr.ochrona.srodowiska.ug.semestr.v.biologia.doc Rozmiar 451 KB |
PCR - zasada działania i praktyczne zastosowanie
W 1983 roku narodziło się nowe narzędzie biologii molekularnej, które pozwoliło badać, klonować i sekwencjonować geny z pominięciem wektorów plazmidowych i fagowych i całej magii związanej z przenoszeniem kolonii bakteryjnych wykałaczką.
Kary Mullis otrzymał w 1993 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii za prace, w których 10 lat wcześniej wykazał, że używając prostych substratów i enzymu polimerazy DNA można w czasie kilku godzin uzyskać miliony kopii DNA o pożądanej sekwencji. W swojej pierwotnej wersji przeprowadzenie reakcji namnażania kopii DNA in vitro, zwanej często amplifikacją, wymagało dodania w każdym cyklu porcji enzymu - polimerazy z E. coli, który następnie ulegał zniszczeniu na etapie denaturacji DNA.
Niedogodność ta została pokonana dzięki zastosowaniu w 1987 roku polimerazy termostabilnej, pochodzącej z bakterii Thermophilus aquaticus żyjących w gorących źródłach wulkanicznych. Enzym ten jest wytrzymały na ogrzewanie nawet do 96°C, co jest niezbędne do roztopienia dwuniciowego DNA. Reakcję można zatem prowadzić bez otwierania probówki, stosując 30-40 cykli ogrzewania i chłodzenia. W łańcuchowej reakcji polimerazy (polymerase chain reaction - PCR) każda nowo kopiowana cząsteczka staje się matrycą dla dwóch następnych kopii, co decyduje o lawinowym tempie reakcji.
Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (z angielskiego Polymerase Chain Reaction), technika umożliwiająca amplifikację (namnażanie) fragmentów DNA in vitro przy użyciu polimerazy DNA.
PCR zrewolucjonizowała współczesną biologię molekularną, umożliwiając wyprodukowanie milionów kopii fragmentu DNA w zaledwie kilka godzin. Stosuje się ją w diagnostyce chorób dziedzicznych, ustalaniu ojcostwa, w kryminalistyce przy ustalaniu pochodzenia śladów krwi, do powielania DNA ze szczątków organizmów wymarłych, wykrywania wirusów we krwi, np. wirusa HIV.
Rysunek 1. Schemat budowy wirusa HIV: 1. nić RNA; 2. enzym odwrotna transkryptaza; 3. enzym integraza; 4. zewnętrzna otoczka wirusa utworzona: a. ze struktur lipidowych; b. z białka; 5. rdzeń zbudowany z białka; 6. otoczka rdzenia.
 | Pobierz cały dokument pcr.ochrona.srodowiska.ug.semestr.v.biologia.doc rozmiar 451 KB |