05 2

poszczególnych zbiorniczków. Po powtórnym wysuszeniu wiskozymetru wprowadzić 10 ml badanego 0.002% roztworu DNA i zanotować czasy wypływu roztworu DNA dla poszczególnych zbiorniczków.

Dla każdego zbiorniczka wyliczyć lepkość zredukowaną korzystając z następujących zależności:

^r/wl ⁼ 0 —*o)/*0

lepkość zredukowana = t/_w)/c,

gdzie: i — czas wypływu roztworu DNA, t₀ — czas wypływu rozpuszczalnika, c — stężenie roztworu DNA (g/100 ml).

Lepkość istotną [>/] odczytać z wykresu na drodze ekstrapolacji do gradientu 0. Masę cząsteczkową badanych preparatów DNA wyznaczyć ze wzoru: [r;] = K • M\ przyjmując K = 6,9-10^-4, a = 0,7.

Ćwiczenie 10.25. Pomiar lepkości jcdnoniciowych preparatów DNA w zasadowych lizatach jąder (N.I. Rjabczenko i wsp. 1975: Radiobiologja, 15:171 174)

Zasada: Podczas denaturacji DNA, kiedy to rozpada się struktura II-rzędowa i następuje rozdzielenie łańcuchów polinukleotydowych, lepkość istotna zmienia się dość silnie, a zmiany te zależą od masy cząsteczkowej i siły jonowej roztworu.

Dla zdenaturowanego DNA Escherichia coli w standardowym roztworze soli wartość współczynnika K (0,4 10 ⁴) i wykładnika potęgi a (0,55) w równaniu na lepkość istotną różnią się dość znacznie od odpowiednich parametrów dla natyw-nego DNA o tej samej masie cząsteczkowej.

Większość metod otrzymywania DNA nie dostarcza preparatów' o masie cząsteczkowej większej niż 10⁷ Da. Wiąże się to z dosyć intensywnym odbiałczaniem DNP, podczas którego dochodzi do znacznej degradacji cząsteczki DNA.

Opracowano bardzo dogodną metodę wiskozy metrycznego oznaczania masy cząsteczkowej jednoniciowego DNA w zasadowych lizatach jąder komórkowych, pozwalającą otrzymać preparaty o średniej masie cząsteczkowej 10⁸ Da. Metoda ta nie wymaga odbiałczania preparatów DNA, ponieważ stwierdzono, że r/_w, preparatów DNA z białkiem w roztworze NNE (0,9 M NaCl - 0,1 M NaOH - 0,01 M EDTA) nie zależy od zawartości białka, a jedynie od masy cząsteczkowej DNA.

Na podstawie metody sedymentacyjnej białka ustalono empiryczną zależność [>/] od masy cząsteczkowej DNA w roztworze NNE:

0f] = 1,435-10^0,727

Materiał: Świeża krew świni.

Odczynniki:

1)    1,2% roztwór alkoholu poliwinylowego w 0,14 M roztworze NaCl.

2)    Płyn Hanksa: 8 g NaCl; 0,14 g bezwodnego CaCl₂; 0,4 g KCI; 0,2 g MgS0₃-4H₂O; 0,35 g NaHCOjj 0,12 g Na₂HP0₄-12 H₂0 i 0,06 g KH₂P0₄ uzupełnić wodą do 1 litra. Doprowadzić do pH 7,4 wobec czerwieni fenolowej.

3)    0,25 M roztwór sacharozy z dodatkiem CaCl₂ (0,03 M) i cytrynianu sodu (0,01 M).

4)    5% wodny roztwór Tritonu X-100.

51 Roztwór NNE: 0,14 M roztwór NaCl z dodatkiem NaOH (0,1 M) i EDTA (0,01 M).

405