0
5

9.    Powtórnie wytrącić DNA przez dodanie Vio objętości CH₃COONa (odcz. 9) i 2 objętości schłodzonego etanolu (odcz. 7). Używając bagietki lub pipety ze ściętą końcówką przenieść DNA do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml 70% roztworu etanolu.

10.    Płukać osad DNA 2 razy 70% roztworem etanolu, suszyć powietrzem i rozpuszczać w buforze TE (odcz. 10) przez 24 godz.

Uwagi:

1)    Podczas dodawania NaC10₄ (etap 8) może dochodzić do wytrącania się SDS, jednakże kilkakrotne odwrócenie probówki powinno spowodować jego ponowne przejście do roztworu.

2)    Wydajność tej metody: 150-250 pg DNA/10 ml pełnej krwi.

3)    Dla otrzymanego tą metodą DNA stosunek A₂₆₀/A_2S0 ma wartość 1,7-1,8.

4)    Wyizolowany DNA jest podatny na działanie enzymów restrykcyjnych, m.in. Bam HI, Eco RI, Hindlll i Pstl oraz może być substratem do hybrydyzacji metodą Southerna (podrozdz. 10.3.4).

Ćwiczenie 10.6. Izolowanie mitochondrialnego DNA ssaków metodą lizy zasadowej

(K. Tamura, T. Aotsuka 1988: Biochem. Genetics., 26:815-819)

Analiza mitochondrialnego DNA (mtDNA) dostarcza wielu cennych informacji dla różnych dziedzin biologii. Szybka i prosta technika izolowania mtDNA ma znaczenie szczególnie w genetyce populacyjnej i diagnostyce genetycznej, gdzie istnieje konieczność analizy wielu próbek. Ponadto niezbędny jest preparat charakteryzujący się czystością pozwalającą trawić go enzymami restrykcyjnymi oraz hybrydyzo-wać metodą Southerna. Metoda lizy zasadowej wzorowana na izolowaniu plazmidowego DNA pozwala uniknąć długotrwałego ultrawirowania oraz drogiego chlorku cezu, stosowanych w standardowych metodach izolowania mtDNA.

Zasada: W metodzie tej mitochondrialny DNA izoluje się z mitochondriów, które otrzymuje się według takich samych zasad z materiału zwierzęcego, jak z roślinnego. Pierwszym krokiem jest dezintegracja błony komórkowej z zachowaniem strukturalnej integralności mitochondriów. Następnie komórki z naruszoną błoną poddaje się wirowaniu różnicowemu, aby oddzielić mitochondria od innych organelli i fragmentów komórkowych (por. rozdz. 17). Wydajność otrzymywania mitochondriów oraz łatwość, z jaką można otrzymać je w czystej postaci, silnie zależy od typu tkanki. Po lizie komórek stosuje się wirowanie wolnoobrotowe w celu usunięcia komórek, które nie uległy lizie, ich jąder i dużych fragmentów błonowych oraz otrzymania frakcji mitochondrialnej, która może zawierać oprócz mitochondriów także lizosomy, peroksysomy i fragmenty błonowe. Frakcję tę poddaje się płukaniu, polegającemu na rozpuszczeniu jej w buforze do lizy i powtórnym wirowaniu. Płukanie to można w razie potrzeby powtarzać kilkakrotnie.

Materia): Tkanka zwierzęca.

Odczynniki:

1)    Bufor do homogenizacji: 0,25 sacharoza - 10 mM EDTA - 30 mM Tris/HCl (pH 7,5).

2)    Bufor o składzie: 0,15 M NaCl - 10 mM EDTA - 10 mM Tris/HCl (pH 8,0).

3)    Świeżo przygotowany 0,18 M roztwór NaOH w 1% roztworze SDS.

375