05

8)    Fiiektroforezę powinno się przeprowadzać przez minimalny czas potrzebny do przeniesienia DNA na celulozę.

9)    W celu zabezpieczenia przed wprowadzeniem na celulozę niepożądanych fragmentów DNA, można badany fragment żelu wyciąć i włożyć go w otwór zrobiony w żelu z dala od innych pasm albo wstawić drugi kawałek celulozy powyżej interesującego nas pasma.

10)    Po wyjęciu celulozy z żelu nie można dopuścić do jej wyschnięcia, gdyż wówczas nie będzie można odzyskać związanego z nią DNA.

Ćwiczenie 10.40. Odzyskiwanie DNA przez elektroelucję do worka dializacyjnego (J. Sambrook i wsp. 1989: Molecular cloning. A laboratory manuał. Book 1. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 6.28- 6.29)

Zasada: Wycinki żelu. zawierające badane fragmenty DNA, umieszcza się w workach dializacyjnych w aparacie do elektroforezy wypełnionym buforem. Przepływ' prądu powoduje osadzanie się DNA na ściankach worka, z których można go przemieścić do buforu wewnątrz worka. Technika ta jest nieco kłopotliwa, jednakże w porównaniu / innymi daje dobre rezultaty, gdy długość odzyskiwanego DNA przekracza 5 kpz.

Materiał: DNA.

Odczynniki:

1)    Bulor TE o pH 7.6: 10 mM Tris/HCI - t mM EDTA.

2)    Roztwór bromku etydyny o stężeniu 0,5 pg/ml w buforze TE (odcz. I).

3)    Mieszanina: fenol/chloroform,-alkohol izoamylowy (obj. 25:24:1).

4)    10 mM roztwór CHjCOONH*.

5)    96% roztwór etanolu.

6)    70% roztwór etanolu.

Aparatura: Aparat do elektroforezy, lampa UV.

Wykonanie:

1.    Przeprowadzić elektroforezę DNA w żelu zawierającym bromek etydyny. Używając lampy UV zlokalizować pasma zawierające co najmniej 1 pg DNA. Wyciąć je za pomocą skalpela i umieścić na szpatułce zwilżonej buforem TE (odcz. 1).

2.    Wprowadzić pojedynczo kawałki agarozy zawierające badane fragmenty DNA do zamkniętego w jednym końcu worka dializacyjnego wypełnionego buforem TE (odcz. I); po zatonięciu fragmentów usunąć tyle buforu, aby pozostała jedynie jego ilość konieczna do zanurzenia fragmentów. Zamknąć worek dializacyjny tuż nad buforem i włożyć go do aparatu do elektroforezy zawierającego bufor TE (odcz. I).

3.    Połączyć elektrody ze źródłem prądu ustalając napięcie tak, aby natężenie pola elektrycznego wynosiło 4-5 V/cm. Przepuszczać prąd przez worek dializacyjny przez 2 3 godz. W czasie przepływu prądu DNA powinien osadzać się na worku, co można sprawdzać w świetle lampy UV. Zmienić polaryzacje elektrod i przepuszczać prąd przez 1 min w celu oddzielenia się DNA od ścianek worka.

4.    Wyjąć worek i łagodnie masować jego ścianki w celu oddzielenia od nich pozostałości DNA. Proces ten można śledzić w świetle UV. Otworzyć worek i przenieść bufor do probówki, przemyć niewielką ilością buforu wnętrze worka, ciecz z płukania połączyć z buforem w probówce.

445