02

^T

dE/dt —f(E) zależą od liczby par G-C w cząsteczce DNA, przy czym im większa zawartość par G-C, tym później pojawia się pierwsza zmiana. Tak więc np. u Bacillus alvei o zawartości 33% par G-C, pierwsza zmiana pojawi się w temp. 50°C, w DNA grasicy (42% par G-C) — w temp. 60°C, w DNA izolowanym z Serratui marcescens (57,5% par G-C) — w temp. 67°C, a w DNA Micrococcus lysodeicticus, zawierającym 72% par G-C — w temp. 80^CC.

Ciekawe wyniki w badaniu struktury DNA pozwoliła osiągnąć metoda polarografii impulsowej (pulsopolarografii). Analizowano zachowanie się roztworów DNA z różnych źródeł i wykazano, że w danych warunkach natywny DNA wytwarza falę przy potencjale -1,2 V, określaną jako fala I, a DNA w dużych stężeniach (300 pg/ml) — falę II, w potencjale ok. +1,5 V. denaturowany DNA wytwarza falę III w potencjale ok. 1,6 V. Na rysunku 10.10 przedstawiono pulsopolarogramy DNA natywnego i zdenaturowanego.

Analogia przeprowadzona między wynikami uzyskanymi na drodze polarografii oscyloskopowej i pulsopolarografii wykazuje, że fala II jest odpowiednikiem wgięcia katodowego na krzywej dE/dt = /(£). Pojawienie się dodatkowej fali II nie jest związane z zanieczyszczeniami, ani z występowaniem denaturacji, nawet częściowej, denaturowany DNA, choćby w niewielkich stężeniach, tworzy wysoką falę III, która maskuje falę II o bardzo zbliżonym potencjale. Stopniowa degradacja stężonego DNA w kapilarach szklanych, jak również ogrzewanie do temperatury przedtop-nieniowej nie dają zmian wysokości fali II. Fala ta zwiększa się natomiast wyraźnie po działaniu DNazy 1 o stężeniu 9 -10“³ pg/ml, przy czym w początkowej fazie działania DNazy zaobserwowano wzrost fali II, a następnie — po długim okresie działania enzymu — denaturację, którą sygnalizuje pojawienie się fali III. Naświetlając DNA promieniami y zaobserwowano również wzrost fali II, przy czym fala powiększa się wraz z dawką energii pochłoniętej. Zgodnie z danymi piśmiennictwa zarówno DNaza, jak i promieniowanie w dawkach stosowanych przez autorów — należą do czynników, które powodują pojedyncze złamania łańcucha DNA. Można więc przypuszczać z dużą dozą prawdopodobieństwa, że fala II jest odzwierciedleniem pojedynczych złamań w cząsteczce DNA.

Stwierdzono również zmiany wysokości fali II, a także fali III po działaniu związków fosforoorganicznych, stosowanych jako insektycydy. Związki te, jak wynika z wielu badań, mogą być czynnikiem mutagennym dla wielu organizmów, w tym również dla człowieka.

Ćwiczenie 10.27. Oznaczanie oscylopolarograficzne puryn i pirymidyn

Zasada: Oznaczenia oscylopolarograficzne wykonuje się na oscyloskopie typu OSA 601, z przystawką umożliwiającą otrzymanie charakterystyk dE/dt = /(£). Obraz krzywej dE/dt =/(£) otrzymany na ekranie oscyloskopu należy utrwalić wykonując zdjęcie fotograficzne (stosuje się film negatywowy, zdjęcie wykonuje się przy' otwartej migawce i przesłonie 2,8). Głębokość wgięć anodowych i katodowych mierzy się bezpośrednio z negatywu, po odpowiednim powiększeniu na powiększalniku i przerysowaniu na papier milimetrowy. Sposób pomiaru głębokości wgięcia przedstawia rys. 10.11.

412