20080421037

Przeniesienie DNA na membranę (Southern Biot Transfer)

Dcpuiynacja/denatu racja

13 Po przepłukaniu przenieść żel agarozowy do kuwety zawierającej 200 ml 0,25M HC1 w temperaturze pokojowej na maksymalnie 8 minut. Zel należy wyjąć wcześniej, jeśli barwnik stanie się całkiem żółty przed upły w cm 8 minut

14.    Ostrożnie zlać roztwór HC1.

15.    Przemyć zel kilkakrotnie wodą destylowaną.

16.    Dodać 200 ml roztworu denaturującego DNA (0,5M/0,6M NaCl) i moczyć zel 15 minut

17.    Zlać roztwór i dodać drugą porcję 200 ml roztworu denaturującego DNA.

18.    Moczyć żel 30 minut Roztwór zachować do zamoczenia membrany.

Sothcm Biot Transfer

19.    Wyjąć żel z kuwety po 30 min. inkubacji w roztworze denaturującym. Roztwór zachować do zwilżenia membrany nylonowej.

20.    Umieścić żel (kieszonkami do dołu) bezpośrednio w plastikowej kuwecie, tak by odwTÓcona gładka powierzchnia żelu mogła się kontaktować z membraną

21.    Przyciąć membranę nylonowy do rozmiaru żelu i analogicznie odciąć górny róg membrany.

22.    Delikatnie podnieść membranę za krawędzie szczypcami, lekko zgiąć w środku i powoli zwilżać ją od środka ku krawędziom w zachowanym wcześniej roztworze denaturującym

DNA.

23.    Delikatnie zanurzyć zwilżoną membranę w roztworze denaturującym i trzymać przez 5 minut.

24.    Nasyconą membranę przenieść na wierzch odwróconego żelu agarozowego.

25.    Na membranę nałożyć bibułę filtracyjną przyciętą uprzednio do rozmiaru membrany.

26.    Usunąć powstałe bąble powietrza.

27.    Na bibule filtracyjnej ostrożnie umieścić w-arstwę ręczników papierowych o grubości ok. 4 cm. Obciążyć powstały stos. Pozostawić na całą noc.

Zakończenie transferu (Stopping point)

28.    Po całonocnej inkubacji usunąć obciążniki oraz papierowe ręczniki.

29.    Szczypcami odwrócić stos zawierający żel, membranę nylonową i bibułę filtracyjną tak by bibuła znalazł się na spodzie.

30.    Szczypcami usunąć żel z membrany. Żel można wyrzucić.

31.    Membranę położyć na suchym papierowym ręczniku stroną z DNA do góry (strona membrany, która była w bezpośrednim kontakcie z żelem).

32.    Oznaczyć membrany należące do poszczególnych grup.

33.    Umieścić membranę pomiędzy dwa arkusze bibuły i włożyć do piecyka nagrzanego do temperatury 80°C na 30 minut

34.    Suchą membranę przechowy wać w temperaturze pokojowej z dala od wilgoci, między arkuszami bibuły.

2