CCF20130428024

•    oznaczanie poziomu lizozymu

o    metoda turbidymetryczna

o    metoda płytkowa

•    oznaczanie białka całkowitego i frakcji gammaglobulinowej

o    metoda kolumnowa

o    metoda elektroforetyczna

o    metoda turbidymetryczna

Oznaczanie lizozymu

Metoda turbidymetryczna

•    porównanie gęstości optycznej zawiesiny wrażliwych bakterii (Micrococcus lysodeitcticus) i badanego płynu z gęstością optyczna tej samej zawiesiny z różnymi znanymi stężeniami lizozymu białka kurzego

•    najpierw sporządzamy roztwór bakterii w buforze fosforanowym

•    dodajemy badany materiał np. surowicę i mierzymy ekstynkcję E0- początkowa, a następnie po 5min El, 10 E2 do E5 -> E4 jest końcową

•    krzywa standardowa wykreślamy na podstawie pomiaru dla różnych koncentracji lizozymu np. lOOug/ml Metoda płytkowa

•    stosowana gdy oznaczanie lizozymu jest utrudnione przez znaczne zmętnienie lub zabarwienie np. hemoglobina badanego preparatu

•    najpierw w zawiesinie bakterii w żelu agarozowym wycinamy dołki o średnicy 4mm,odległość nie mniejsza niż 4 cm

•    do dołka wprowadzamy badaną próbę i inkubujemy przez 37'C/24godz

•    jeśli jest lizozym to są przejaśnienia wywołane rozpuszczeniem bakterii przez enzym

•    Średnicę mierzymy w mm (uzależniona od ilości lizozymu - stężenie odczytujemy z krzywej standardowej)

Oznaczanie białka całkowitego i frakcji gammaglobulinowej

Metoda kolumnowa

•    na kolumnę z Sefadexem g200 nakłada się na surowice i kilkanaście godzin filtruje

•    poszczególne frakcje skapują do probówek

•    najwolniej albuminy - najlżejsze, najcięższe frakcje spływają najszybciej Metoda elektroforetyczna

•    rozdział elektroforetyczny badanej próby przeprowadza się w polu elektrycznym przy użyciu różnych nośników, bibuły w buforze o zasadowym pH

•    zastosowanie głownie do celów analitycznych i w organicznym stopniu do celów preparatywnych

•    znajdujące się w roztworach cząsteczki maja ładunek i migrują po przyłożeniu zewnętrznego pola elektrycznego

•    białka + do katody a białka - do anody

•    albuminy i alfagiobuliny do anody, gammaglobuliny zostają do katody

•    na żelu agarozowym białka surowicy rozdzielają się na 5 : albuminy, al i a2, beta i gamma globuliny

Metoda turbidymetryczna (spektrofotometryczna)

•    określamy zawartość białka całkowitego w surowicy metoda biuretową

•    krzywa standardowa białka całkowitego: liofilizat białka rozpuszczamy w 5ml wody destylowanej(lml/50g/l białka)

•    następnie wykonujemy rozcieńczenia

® Dla każdego odczytujemy ekstynkcję (kreślimy krzywa standardową)

•    mieszamy badaną surowicę 1:1 z glikolem polietylenowym i inkubujemy 2godz cały czas mieszając

•    wirujemy 20tys/min i zbieramy odpowiednia ilość supernatantu

•    w nim metodą biuretową określamy zawartość białka całkowitego - odejmujemy E białka całkowitego - E supernatantu

•    wartość obliczona to podstawa do odczytania gammaglobulin z krzywej

28. Fazy swoistej odporności immunologicznej

• faza ROZPOZNANIA: wiązanie obcego antygenu do swoistych receptorów ® faza AKTYW Aa I

o proliferacja klonu limfocytów o różnicowanie komórek proliferujących ® faza EFEKTOROWA/WYKONAWCZA o cytotoksyczność o    wydzielanie cytokin

o    wydzielanie przeciwciał

25