img088 2

Mciody fl/yc/nf i« wykorzystywanie nujc/ę*cle| ab*oi|H.jl Awintln. (luorcsccncji lub uutoradio£ grafu. W u-iliniu- ul»orpt-yjm-j plamy uwidocznione ua bibuł* w świetle aualityc/ncj lampy kwarcowci, np. / filtrem Wooda, Minerał light, obrysowuje się ołówkiem, a stężenie /wią/ku w cluacic plam oznacza się spcktrofotomctrycznie. W metodzie fluorescencyjnej -.tonuje się bibułę nasycomi substanejami fluory żującymi, np. ryboflawiną. chininą, fluorcscciną, lub wykorzystuje się właściwości fluorescencyjne zwią/ ków rozdzielanych chromatograficznie bądź ich pochodnych. W technice radiometrycznej natężenie promieniowania związku radioaktywnego rejestruje się za pomocą aparatu do liczenia impulsów bezpośrednio na chromatogramic lub w cluacic plamy. Wprowadzenie izotopów do badań pozwoliło zmniejszyć ilość wykrywanych substancji poniżej 1 pg. Wyrazem ogromnej czułości tej techniki chromatograficznej może być określenie 1/70000 pg znakowanej tyroksyny.

C hemiczne sposoby wywoływania chromatogramu mają na celu przeprowadzenie bezbarwny! li składników na bibule w związki barwne. W tym celu: !) umieszcza się chromatogram w komor/o z parami wywoływacza bądź 2) zanurza się go w odczynniku wywołującym lub też 3) spryskuje nid wywoływaczem za pomocą specjalnych rozpylaczy. Stosowane w chromatografii bibułowej odcz.) wywołujące dzieli się na odczyny specyficzne dla poszczególnych związków oraz lepsze od nu odczyny grupowe, które umożliwiają wykrycie na chromatogramic wielu związków tej samej grupy, np. odczyn z ninhydryną (por. s. 110) uniwersalny dla aminokwasów (chociaż niejednakowi czuły dla wszystkich aminokwasów). Należy pamiętać, że odczynniki wywołujące nic powinny b) zbyt kwasowe czy zasadowe, gdyż mogą zniszczyć bibułę chromatograficzną. Pewne rcaki barwne przeprowadzane na bibule (np. z ninhydryną) zacierają się dość szybko. Dlatego często utrwala się chromatogram, spryskując go drugim odczynnikiem, np. po ninhydrynic azotanem miedzi.

Pojawia się niekiedy znaczna deformacja wybarwionych plam w postaci „trenów”, „ogonów". i| wydłużenia plamy w kierunku przepływu rozpuszczalnika czy też uwielokrotnicnia plamy. Zjawisk! to łączy się w dużej mierze z naturą substancji chromatografowanych, tj. z istnieniem licznych jej form zjonizowanych i niczjonizowanych, z procesem adsorpcji na bibule, a także zanieczyszczeniami jonami nieorganicznymi (np. anionami Cl', S0₄² ). Zjawisku temu można częściowo przeciwdziałał przez: I) usunięcie przeszkadzających jonów z roztworu badanego (np. wielokrotne odparowywana' roztworu zawierającego HC1 w eksykatorzc próżniowym nad KOH, eliminowanie jonów SO/ w postaci BaS0₄ itp.) oraz 2) wprowadzenie do rozpuszczalnika, a nawet na dno komory, zasady (np. NH₄OH) ewentualnie kwasu (np. CH₃COOH. HC1), aby zahamować jonizację.

Biologiczne sposoby wywoływania chromatogramu, to głównie: metody enzymatyczne (inkubac).i chromatogramu z wyciągiem enzymatycznym) i bioautografia do identyfikacji substancji czynnych biologicznie, pobudzających lub hamujących wzrost bakterii, pleśni albo wyższych roślin. Ten typ metod stosuje się badając np. aktywność antybiotyków lub wykrywając czynniki wzrostowe.

Obliczanie współczynnika /?,. Współczynnik przepływu w chromatografii bibułowei wyraża stosunek prędkości migracji czoła pasma do prędkości wędrówki czoła rozpuszczalnika. Zgodnie z rys. 4.11 oblicza się go następująco:

^ _ x _ odległość środka plamy od startu ^f y odległość czoła rozpuszczalnika od linii startu

Wartość R_f jest wielkością stałą dla danego składnika, systemu rozpuszczalnika i stałych warunków doświadczenia oraz charakterystyczną dla poszczególnych substancji. Wartości współczynników R_f zależą od wielu czynników: gatunku bibuły i jej czystości, temperatury, stopnia uwodnienia bibuły, stanu nasycenia komory i bibuły, od ilości i wieku rozpuszczalników, od czasu i drogi przepływu, a nawet od odległości punktu startu od powierzchni fazy ruchomej.

Rys. 4.11. Schemat oznaczania współczynnika R_f na chromato-gramie

start

plama

czoło

Pewniejszych wyników dostarcza jednowymiarowa chromatografia badanej mieszaniny wobec roztworu wzorcowego, gdyż nie opiera się ona wyłącznie na współczynnikach zależnych od tak wielu parametrów. Różnice R_f dla substancji badanej i wzorcowej chromatografowanych na tym samym arkuszu bibuły nie powinny wynosić więcej niż ±0,02. Oznaczenia współczynników R_f nowej substancji wymaga serii równoległych chromatogramów i wprowadzenia średniej wartości z wyników o rozrzucie rzędu ±2%.

Chromatografia bibułowa ilościowa. Wyróżnia się 2 typy ilościowego oznaczenia zawartości substancji w wywołanym chromatogramic, tj. oznaczenie ilościowe bezpośrednio na bibule oraz przez elucję.

Oznaczenia ilościowe bezpośrednie zawierają: 1) porównanie wizualne intensywności zabarwienia plam roztworu badanego i wzorcowego; 2) pomiar powierzchni plam wywołanego chromatogramu (np. /a pomocą planimetru czy obrysowania ich na papierze milimetrowym), bądź wycięcie plam i ich zważenie | wg Rcida i Ledcrera (1951) powierzchnie plam zmieniają się jak logarytmy stężeń substancji]; 3) pomiar transmisji światła, o odpowiedniej długości fali, przechodzącego bezpośrednio przez plamy roztworu wzorcowego i badanego na bibule.

Oznaczenie ilościowe przez elucję polega na wycięciu plam obrysowanych według zabarwienia lub pochłaniania w nadfiolecie, pokrojeniu ich na wąskie paski wzdłuż bibuły, elucji odpowiednimi roztworami substancji wybarwionej lub bezbarwnej oraz na oznaczeniu stężenia substancji w eluacie za pomocą koloryme-tru czy spektrofotometru. Niezbędne jest ujęcie plam danego związku otrzymanych dla roztworu badanego i wzorcowego w prostokąty lub kwadraty o jednakowej powierzchni. W najpomyślniejszych warunkach uzyskuje się dokładność rzędu ±2%.

121