img109 3

Ćwiczenie 4.29. Izolowanie enzymów zulc/iiyili ml NAD i NADP z zastosown niem złoża Hlue Sepharose (G.E. Lamkin, I |{. king 1976: Biochem. Biophys. Kc* Commun., 72:560 565)

Zasada: Związany z żelem Sepharose CL-6B barwnik Cibacroń Bluc F3G A wykazuje duże powinowactwo do wielu enzymów i białek, w tym do enzymów zależnych od NAD* i NADP*, do albumin, czynników krzepnięcia krwi, a także do interferonu. Stosując złoże Blue Sepharose CL-6B można z łatwością oczyścić te białka. W tym ćwiczeniu zostanie to zilustrowane przykładem metody wy od tę h niania dehydrogenaz z ekstraktu komórek drożdży.

Materiał: Ekstrakt białek uzyskany z drożdży piekarniczych w wyniku lizy komórek drożdży w 0.1".. roztworze Tritonu X-100.

Odczynniki:

1)    Bluc Sepharose CL-6B.

2) Bufor. 0,02 M Tris/HCI - 5 mM MgCl, - 0,4 mM EGTA - 2 pM 2-merkaptoctanol (pH 6,4).

3) Bufor: 0,02 M Tris/HCI - 5 mM MgCl, - 0,4 mM EGTA - 2 pM 2-merkaptoctanol (pH 8.6).

4)    5 mM roztwór NAD' w 0,02 M buforze Tris/HCI (pH 6,4).

5)    10 mM roztwór NAD’ w 0,02 M buforze Tris/HCI (pH 6.4).

6)    10 mM roztwór NADP⁺ w 0,02 M buforze Tris/HCI (pH 6.4).

7)    20% roztwór etanolu.

Wykonanie: Odważyć 3 g suchego złoża Blue Sepharose CL-6B i zamoczyć ic w 20 ml 0,02 M buforu Tris/HCI o pH 6,4. Po około 30 minutach przemyć złoże 3-krotnie tym buforem, porcjami po 20 ml. Tak zrównoważone złoże (około 10 ml) upakować w plastikowej kolumnie. Ekstrakt białek drożdży rozcieńczyć buforem Tris/HCI o pH 6,4 do stężenia 10 mg/ml, odwirować (5000 xg przez 15 min) i nanieść 20 ml tak przygotowanego ekstraktu na kolumnę. Używając tego samego buforu (100 ml), odmyć białka niespecyficznie zaadsorbowane na złożu. Swoiście związane białka eluować za pomocą 5 mM roztworu NAD* (30 ml). Zbierat 2-mililitrowe frakcje. W następnych etapach kolumnę przemyć buforem Tris/HCI

0    pH 6,4 (20 ml), a kolejne białka związane swoiście eluować kolejno 10 mM roztworem NADP ^ł (30 ml), buforem Tris/HCI o pH 8,6 (30 ml), a w końcu 10 mM roztworem NAD^f (30 ml), cały czas zbierając materiał wypływający z kolumny Po zakończeniu elucji kolumnę przemyć buforem Tris/HCI o pH 6,4 (100 ml), wodą (100 ml) i 20% etanolem (30 ml). Kolumnę przechowywać w temp. 4°C do ponownego użycia. W zebranych frakcjach oznaczyć spektrofotometryczmo (A = 280 nm) stężenie białka.

W pierwszym szczycie białkowym, wymywanym przez 5 mM roztwór NAD', znajduje się dehydrogenaza alkoholowa (EC 1.1.1.71). W drugim, wymytym za pomocą 10 mM roztworu NADP^f, występuje dehydrogenaza glukozo-6-fosforano wa (EC 1.1.1.49). W kolejnym szczycie chromatograficznym, po elucji bardziej zasadowym buforem Tris/HCI (pH 8,6), znajduje się heksokinaza (EC 2.7.1,1)

1    w ostatnim 10 mM NAD^f eluuje dehydrogenazę gliccraldehydo-3-fosforanow.| (EC 1.2.1.12). Końcową identyfikację wyizolowanych enzymów można przeprowadzić stosując testy enzymatyczne.

Ćwiczenie 4.30. Oczyszczanie niKNA z zastosowaniem /lu/u zawierającego |>oli(U)

(J.M. Taylor i wsp. 1976: ./. Biot. Ćhem., 251:7461 7467)

Zasada: Złoże Poly(U)-Sepharose 4B jest adsorbentem, który specyficznie i w sposób odwracalny wiąże kwasy nukleinowe pochodzenia roślinnego oraz mRNA. Złoże przygotowuje się przez związanie długich łańcuchów kwasu poliurydylowego (ok. 100 podjednostek) z żelem Sepharose 4B. Prawie wszystkie cząsteczki mRNA mają w swej strukturze sekwencję kwasu poliadenylowego [poli(A)], komplementarną do sekwencji poli(U). Dzięki temu, wykorzystując komplementarność obu zasad, / łatwością można wyizolować cząsteczki mRNA w drodze chromatografii powinowactwa.

Materiał: Odwodniony preparat całkowitego RNA.

Odczynniki:

1)    Poly(U)-Sepharose 4B.

2)    Destylowana H₂0, w której rozpuszczono DEPC (0.1%) (dicthylpyrocarbonatc dictylopirowę-glan) i następnie autoklawowano.

3)    0,1 M roztwór NaCI.

4)    Bufor ekstrakcyjny: 50 mM Tris/HCI - 1% N-lauroilosarkozyna - 30 mM EDTA (pH 7,5).

5)    Bufor startowy: 25% roztwór formamidu w układzie: 50 mM Tris/HCI - 0.7 M NaCI - 10 mM EDTA (pH 7,5).

6)    Bufor do elucji: 90% roztwór formamidu w układzie: 10 mM K₂HPO_A - 10 mM EDTA - 0.2% A'-lauroilosarkozyna (pH 7,5).

Wykonanie: Destylowaną H₂0 poddać działaniu DEPC (0,1%) przez 12 godz., a następnie autoklawować. Wszystkie bufory muszą być sporządzone z tak przygotowanej wody. Odważyć 1 g żelu Poly(U)-Sepharose 4B, nanieść na filtr szklany i przemyć 0,1 M roztworem NaCI (100 ml), a następnie upakować szklaną kolumnę (5 10 ml), uprzednio autoklawowaną. Przemyć kolumnę buforem startowym (100 ml). Próbkę RNA (ok. 1 3 mg) rozpuścić w buforze ekstrakcyjnym, podgrzać do 65°C i utrzymywać w tej temperaturze przez 5 min, a następnie szybko schłodzić na lodzie i rozcieńczyć 5-krotnie buforem startowym. Tak przygotowaną próbkę przepuścić przez kolumnę z żelem Poly(U)-Sepharose 4B. Kolumnę przemyć buforem startowym (100 ml) w celu usunięcia niespecyficznie zaadsorbowanych cząsteczek. Cząsteczki mRNA, umocowane wiązaniami wodorowymi, można wymyć buforem do elucji (20 ml), zawierającym dużą ilość (90%) formamidu, i zbierać l-mililitrowe eluaty. Frakcje zawierające mRNA zidentyfikować spektrofotomet-rycznie {/. = 254 nm), pamiętając o tym, aby jako próbę referencyjną zastosować bufor do elucji. Kolumnę przemyć ponownie buforem do elucji (100 ml), a następnie buforem startowym (100 ml) i przechowywać w temp. 4°C do 4 tygodni.

Ćwiczenie 4.31. Zastosowanie złoża Poly(A)-Sepharose 4B do oczyszczania białek wiążących mRNA z cytosolu komórek wątroby szczura (A. Schweiger, G. Mazur 1976: Z. Physiol. Chem. Hoppe Seylers, 357:481 485)

Zasada: Żel Poly(A)-Sepharose 4B jest adsorbentem mogącym specyficznie i odwracalnie wiązać cząsteczki komplementarne, m.in. białka wiążące się z mRNA, poprzez sekwencję poliadenylową.

163