img227

•    Odczynniki: fiolet krystaliczny, płyn Lugola, etanol, fuksyna, 3% woda utleniona, 1% roztwór tetrametylo-p-fenylodwuaminy, liofilizowana plazma królicza z dodatkiem EDTA.

•    Pożywki: płyn do rozcieńczeń, testy biochemiczne API, podłoże Muelłer--Hintona, wystandaryzowane krążki bibułowe nasycone określonymi antybiotykami.

•    Wykonanie:

1.    Z hodowli sporządzić preparat mikroskopowy barwiony metodą Grama.

2.    Z hodowli 18-24-godzinnej sporządzić preparat w kropli wiszącej w celu sprawdzenia zdolności ruchu drobnoustrojów.

3.    Zbadać zdolność drobnoustrojów do wytwarzania enzymów: katalazy, koagulazy i oksydazy cytochromowej.

4.    W zależności od uzyskanych wyników przeprowadzić identyfikację drobnoustrojów na testach:

-    API 20 E - dla pałeczek oksydazo-ujemnych;

-    API 20 NE - dla pałeczek oksydazo-dodatnich;

-    API Staph - dla gronkowców katalazo-dodatnich.

5.    Sporządzić antybiogramy wybranych bakterii Gram-dodatnich i Gram--ujemnych metodą dyfuzyjno-krążkową na pożywce stałej lub płynnej Mueller-Hintona:

-    nanieść odpowiednią ilość (2 x 10®-3 x 10⁶ komórek w 1 ml) 18-24-go-dzinnej hodowli bakteryjnej na płytkę z wylanym, zestalonym oraz podsuszonym podłożem i rozprowadzić ją po powierzchni za pomocą głaszczki;

-    na przygotowane podłoże nanieść wystandaryzowane krążki bibułowe nasycone określonymi antybiotykami - krążki należy rozmieścić w odległości 2-3 cm od siebie, aby uniknąć nakładania się stref zahamowania wzrostu;

-    organizmy inkubować w temperaturze optymalnej przez 24 h;

-    po inkubacji zmierzyć strefy zahamowania wzrostu i porównać stopień wrażliwości mikroorganizmów na działanie poszczególnych antybiotyków, wyróżnić antybiotyki o szerokim i wąskim spektrum działania.

W czasie inkubacji cząsteczki danego antybiotyku dyfundują do pożywki, hamując wzrost wrażliwych drobnoustrojów. W miarę oddalania się od krążka stężenie antybiotyku w podłożu maleje, aż do stężenia, które nie działa już na drobnoustroje - wówczas pojawia się wzrost komórek w postaci jednolitego nalotu. Wokół krążków z antybiotykami mogą się pojawiać strefy zahamowania wzrostu, których średnica jest miarą stopnia wrażliwości drobnoustroju na antybiotyk. Odczyt wyników polega na pomiarze strefy zahamowania wzrostu, łącznie ze średnicą krążka, a wartość średnicy strefy zahamowania wzrostu podaje się po odjęciu średnicy krążka (rys. 17.2).

152