skanuj0024

43.oh.ce

Ćwiczenie III

IZOLAC JA CZYSTYCH KI L ITR

Obliczanie liczby komórek bakteryjnych " zawiesinie metodą bezpośredniego liczenia pod mikroskopem. Przygotowywanie rozcieńczeń.

1. Podstawowe pojęcia

KULTURA CZYSTA - kultura zawierająca komórki lylko jednego gatunku mikroorganizmu { pochodząca od jednej bakterii). Potomstwo jednej komórki nazywamy KOI..ONI A.

Uzyskanie czystych kultur:

A.    Metod) bezpośrednie (np. posiew uproszczony, redukcyjny)

B.    Metody pośrednie (metody rozcieńczeń. replik)2. Oznaczenie liczby drobnoustrojów Do oznaczania liczby drobnoustrojów w określonej objętości środowiska ciekłego lub w

jednostce wagowej materiału stałego opracowano metody bezpośrednie i pośrednie, podając odpowiednie wartości w mi lii itrze, ewentualnie w litrze. W metodach bezpośrednich dokonujemy zliczenia komórek stosując w tym celu komory (hcmocytometry) I borna. Howarda. Fuch Roseniitala. Biirkera lub szkiełka z odpow iednią podziałką.

2.1. Budowa komory do bezpośredniego liczenia bakterii

Komory do liczenia bakterii pod mikroskopem mają postać szklanych płytek z wciętym wgłębieniem podzielonym na kwadraty lub prostokąty o znanej pow ierzchni.

W komarach liczyć można większe komórki drobnoustrojów, takie jak drożdże, zarodniki, strzępki grzybów lub w y barw ionc bakterie.

Komorę Thoma przedstawia rysunek l. Jest to grube szkiełko przedmiotowe z wyciętymi wgłębieniami o głębokości 0.1 mm (I00,um)> wgłębienia te widoczne są gołym okiem po obydwu stronach środkowego kanalika jako równomierne krzy że, powstałe / przecięcia linii wyznaczających regularne, kwadratowe i prostokątne powierzchnie. Bok kwadratu wynosi I '20 mm (50pm). W każdej siatce znajduje się 400 kwadracików. Pod przykryciu komory szkiełkiem nakry wkowym nad każdym kwadracikiem powstaje prostopadłościan o objętości 1/400 mm \ 0.1 mm - i 4000 mm . Co piąty kwadrat w obu kierunkach podzielony jest na pół dodatkowa linią, w wyniku czego część kwadratów ma powierzchnię o połowę mniejszą, a cala komora podzielona jest w ten sposób na 16 dużych kwadratów. / których każdy składa się z 16 małych kwadratów. Na przecięciu dodatkowych linii powstają maleńkie kwadraciki o czterokrotnie mniejszej pow ierzchni równej 1 ż 1600 mnv .

Oznaczenie liczby drobnoustrojów przy użyciu komory Thoma wykonuje się następująco. Zawiesinę komórek mikroorganizmów, mających tendencję do zlepiania się rozcieńcza się. biorąc przykładów o: 5 objętości zawiesiny i 1 objętość kwasu siarkowego, rozcieńczonego wodą w stosunku 1:10 i wytrząsa się kilka minut, przenosi szybko do komory Thoma. przykrywa szkiełkiem przykrywkowym i przy stępuje do liczenia. Jeśli stwierdzi się zby t duże zagęszczenie drobnoustrojów, to należy próbę rozcieńczyć ilościowo np. 10-kromie i powtórzyć oznaczenie.

Oblicza się średnią liczbę drobnoustrojów z 40 kwadracików. W sumie należy policzyć około 700 komórek, by błąd nie przekroczył 10%. Komórki rozmieszczone są nierównomiernie, w jednych kwadracikach może być ich kilka w innych kilkanaście.

Przy średniej liczbie komórek w jednym kwadraciku (a) i rozcieńczeniu (n) zawartość komórek w (L) w IcnT wynosi: L = 4 x 10^ft x a * n w jednym cm '.

2.2 Pośrednia metoda wyznaczania liczby bakterii (żywe +martvve)

Metody pośrednie polegają wyznaczeniu parametrów ekstynkcji lub zmętnienia, a następnie na porównaniu ich z wzorcem (odczyt z krzywej wzorcowej).

W pomiarach zmętnienia porównuje się zmętnienie próbki ze zmętnieniem w serii probówek (np. Browna lub McParlanda) zawierających rosnące stężenia zawiesiny siarczanu baru. Probówki oznacza się od I (przezroczysta) do 10 (nieprzezroczysta). Dla danego gatunku bakterii gęstość w jednej z probówek odpowiada gęstości zawiesiny komórek o znanej liczbie komórek w mililitrze. Próbka badana znajduje się w probówce o grubości i wielkości zbliżonej do tych. w której znajdują się zawiesiny wzorcowe. Dopasowuje się optycznie gęstość probówki do gęstości w konkretnej probówce i odczytuje się stężenie w tabeli towarzyszącej probówkom.

1