1

10

kftfcfeafwi eto C hi * by oeJtetu*

Ir At* fi, UifCf VHX, 200&

I. Metody oznaczania białka

3. SZYBKA I CZUŁA METODA OZNACZANIA BIAŁEK METODA BRADFORD Z UŻYCIEM BARWNIKA COOMASSIE BRILLIANT BLUE G-250

WSTĘP

W metodzie tej wykorzystano zdolność wiązania barwnika Coomassie Brilliant Blue G-250 z białkiem. Wiązanie to ma charakter oddziaływań elektrostatycznych. Błękit brylantowy Coomassie G-250 (powszechnie stosowany do wykrywania białek w elektroforogramach) w kwaśnym środowisku ma zabarwienie brunatne, które po reakcji ' Ełkiem zmienia się na błękitne. Wiąże się z tym zmiana maksimum absorpcji z X = 465 na 595 nm. Natężenie błękitnej barwy jest proporcjonalne do zawarto? :a w roztworze. Czułość metody wynosi 20 pg białka cm\ zakres 20-1200 pg Jr.u cm*.

Zaletami tej metody są: prostota, szybkość oznaczeń oraz duża czułość, porównywalna z metodą Lowry, jak również mała wrażliwość na obecność różnych związków przeszkadzających w metodzie Lowry i wsp. [3]. Oznaczenia można wykonywać w obecności powszechnie stosowanych buforów, EDTA, Mg²*, związków tiolowych (merkaptoctanol o stężeniu 1 mol/dm¹), sacharozy i glicerolu.

Wadą metod barwnika przez i siarczanu dodecy kowy zakłócając kow. Zakłócenie używając odpow stężenia białek s

METODYKA

Odczynniki:

1.    Roztwór pod pusc w 50 cn łość mieszań przechowyw podstawowej roztworu prz

2.    Roztwór star wowego przy row o stężeń

3.    Surowicę kr. NaCl.

Wykonanie krz

Do 50 mm' • wicy krwi dodaj spienienia), a na spektrofotometr długości fali k = Oblicz wspó Oznacz zaw; wykorzystaj wy;

LITERATURA

1. M. M. Bradforc ties of protein i

4

prole:? 3. O. H. Lowiy. b Folin phenol re

Coommw® BriSont Bk t C-