img003 (3)

106

METODA FILTRÓW MEMBRANOWYCH

Metodę te stosuje sie do liczenia bakterii w Środowiskach ubogich w drobnoustroje. Polega ona na przesączeniu przez odpowiednio zabarwiony filtr okreSlonej objętości próby (np. I cm³), a następnie wybarwiemu bakterii znajdujących się na filtrze • liczeniu ich pod mikroskopem. Po przesączeniu próby filtr wyjmuje sie z oprowy, suszy i umieszcza na szkiełku przedmiotowym. Komórki liczy sic przy użyciu obiektywu immersyjnego w określonej liczbie pól widzenia. Oblicza sic pole filtru i pole widzenia mikroskopu, a następnie współczynnik równy stosunkowi pola filtru do pola widzenia mikroskopu.

Liczbę bakterii w I cm’ badanej próbki oblicza sic ze wzoru: liczba bakterii

---—-—_;--współczynnik • rozcieńczenie

liczba pól mikroskopu

Zadanie ćwiczeniowe l

Liczenie drożdży w komorze Ttiomn

■    Na siatkę komory nanieść krople otrzymanej'»ąvicsiny drożdży i przykryć ściśle szkiełkiem nakrywkowym.

■    Stosując obiektyw 40x policzyć komórki w 80 małych kwadratach. Komórki leżące na granicy dwóch kwadracików liczymy, biorąc pod uwagę tylko krawędź górna i lewo.

■    Obliczyć średnią przypadająca na jeden kwadracik.

■    Obliczyć itość drożdży w I cm'¹ badanej próbki, posługując się wzorem ze str. 104.

Zadanie ćwiczeniowe 2 Liczenie bakterii metodą Breeda

■ Z otrzymanej próby mleka wykonać preparat mikroskopowy. W tym celu 0,01 cm'' mleka rozprowadzić na powierzchni kwadratu o boku I cm. Po wyschnięciu i utrwaleniu, preparat zabarwić błękitem metylenowym lub fioletem krystalicznym. Preparat ogladac przy użyciu obiektywu immersyjnego. Obliczyć liczbę bakterii według wcześniej podanego wzoru nn str. 105.

Zadanie ćwiczeniowe 3 Liczenie bakterii na (litrach

■ Przygotować rozcieńczenie hodowli wyjściowej w roztworze fizjologicznym soli (do 10'³).

■    Przygotować filtry membranowe. W tym celu filtr zanurzyć w roztworze fuksyny na 5-10 sekund, następnie na ten sam czas w 95-procentowym etanolu, po czym wypłukać w wodzie destylowanej przez 10-15 minut.

■    Tak przygotowany filtr membranowy włożyć do aparatu i zwilżyć go całkowicie woda.

■    Wlać i cm¹ zawiesiny drobnoustrojów i kilka kropli 10-procentowej formaliny, a następnie sączyć pod próżmq.

■    Przepłukać filtr roztworem zasady sodowej o pH 11,7.

■    Następnie nalać na filtr 3 cm ’ roztworu błękitu toluidynowego i pozostawić nn 5-11) minut, po czym przesączyć.

■    Wyjqć filtr membranowy i wysuszyć go w suszarce w temperaturze 55°C w ciągu 10-20 minut.

■    Suchy filtr umieścić na azkiełku przedmiotowym, dając pod filtr oraz na filtr kroplę olejku immersyjnego i oglądać pod obiektywem immersyjnym.

■    Policzyć komórki bakteryjne w 20 polacn widzenia. Obliczyć współczynnik stosunku pola filtru do pola widzenia mikroskopu i obliczyć liczbę bakterii w I cm¹ badanej zawiesiny.

METODY POŚREDNIE

Metody pośrednie oznaczania liczby bakterii polegają głównie na liczeniu kolonii metodą płytkowa.

Ogólną zasada metod płytkowych jest posiew określonej objętości badanej próbki na podłoże stałe, a po okresie inkubacji stwierdzenie liczby wyrosłych kolonii. Przyjmując, ze zjednej komórki wyrasta jedna kolonia, można obliczyć ilość drobnoustrojów występujących w l cm^-' lub w 1 g badanego produktu. Metodami tymi można z większym lub mniejszym prawdopodobieństwem określić rzeczywista liczbę drobnoustrojów. Wyniki jednak są zawsze niższe od uzyskanych metodami bezpośrednimi, ponieważ nn płytkach liczy sic tylko kolonie drobnoustrojów, które sa zdolne do wzrostu na danym podłożu i w danej temperaturze. Ponadto niektóre buktcric występujące w skupiskach • łańcuszkach złożonych niekiedy z kilkudziesięciu komórek dają również jedna kolonie.

Metody pośrednie oparte są aa:

-    posiewie i liczeniu kolonii metoda zalewową,

-    posiewie powierzchniowym,

-    oznaczeniu najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów (NPL).

Próbkę żywności przeznaczonej do oznaczeń ilościowych należy

odpowiednio przygotować, tzn. rozcieńczyć, a w wypadku produktów stotych najpierw rozdrobnić. Sposób przygotowania próbki do analizy podano na str. 126.