img042 (2)

0upł<** DfU

Metoda Maxama-Gilberta

(metoda chemicznej degradacji)

metoda opracowana w latach 1976-77

wymaga znakowania radioaktywnego (³²P) na 5' końcu DNA

degradacja cząsteczek DNA związkami chemicznymi przecinającymi wiązania fosfodiestrowe za nukleotydem odpowiadającym określonej zasadzie

zbiór fragmentów DNA o różnej długości, które rozdziela się elektroforetycznie i poddaje autoradiografii

prążki na autoradiogramie odpowiadają fragmentom DNA posiadającym na końcu 3' określoną zasadę

Metoda Sangera

(metoda terminacji łańcucha)

Opracowana w 1975r.

0

1

O —-PratO

ó

i

O—P—O

I

0

1

■-0“P«»O

Tiltosforan

di<»«ok*yrybonukl«o*ycni

I ddNTP}

•'    Zasad*

Ó    azotowa

Zalety: niska toksyczność odczynników, relatywnie prosta i wiarygodna

Wymaga: matrycy w postaci jednoniciowego DNA, startera, polimerazy DNA, nukleotydów (dNTP) oraz dideoksynukleotydów (ddNTP)

ddNTP - hamują elongację łańcucha DNA z powodu braku grupy 3’-OH

Metoda Maxama-Gilberta

(metoda chemicznej degradacji)

Figuro 4A.4 Seąuencing an oliganocleotide by the Maxam-Gi!bort method

Q Eleclropnorosis © hadioautography

Sarapte ONA

Preparatipn o1 hofnpgeneous Kingfe-stirond DNA

Q Actdition of ^s;: P as 5' phosphale

Q Ctoovnge at specific ruicteołkJcs

! (3 toaction A reactlon. j T reaclkm, with some [willi some j-G cl«*vagc j C cf«avnge i (imaeri i n<Kf^ (undOrllned)

Fragmońt

lehgth : «»»«*> *

W hol*    *.........

ollgomicuiotfd* -zalety: metoda niewrażliwa na trudne sekwencje (np. bogate w pary GC, modyfikacje epigenetyczne - metylacja)

wady: skomplikowana, stosowanie toksycznych odczynników, zakaz stosowania w komercyjnych zestawach

f Fead soguence

Metoda Sangera

(metoda terminacji łańcucha)

•    Produkty każdej z czterech reakcji rozdziela się elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących

•    Wizualizacja fragmentów za pomocą ekspozycji żelu z kliszą rentgenowską