Obraz (13

salicyli

barbiti

benzo<

Chlo

Diaze

Tenotii

Chlc

trój pi przeci

I. Wykrywanie pochodnych kwasu barbiturowego.

Izolacja z materiału biologicznego: ekstrakcja bezpośrednia ze środowiska kwaśnego.

♦    2 cm^{1 2} moczu przenieść do rozdzielacza i doprowadzić do pH 4 1N kw. solnym (ok. 0,2 cm²),

♦    dodać 10 cm² chloroformu i ekstrahować przez 5 minut,

♦    po rozdzieleniu się warstw (przy trudnościach w rozdzieleniu, roztwór przelać do probówek wirowniczych i odwirować) dolną warstwę (chloroformową) zlać do czystej probówki,

♦    rozdzielacz wymyć i ponownie przelać do niego zawartość z probówki,

♦    do rozdzielacza dodać 2 cm² wody destylowanej i wytrząsać 5 min.,

♦    po rozdzieleniu się warstw dolną warstwę (chloroformową) zlać na szkiełko zegarkowe i odparować do sucha,

♦    suchą pozostałość rozpuścić na szkiełku w 0,3 cm² etanolu. W ten sposób przygotowano roztwór do naniesienia na płytkę chromatograficzną.

1. Wykonanie chromatografii cienkowarstwowej (TLC)

♦ na płytkę chromatograficzną nanieść kapilarą (4 dotknięcia) roztwór wzorcowy barbituran< (roztwór I zawierający: luminal, weronal, ewipan) oraz badany ekstrakt (próby na płytkę nale nanosić ok. 2 cm od boków i 1,5 cm od dołu płytki) (Uwaga: badany ekstrakt na szkiełl pozostawić do dalszej analizy!).

♦    płytkę wstawić do komory z układem rozwijającym izopropanol:chloroform:amoniak 25% (60:30:10),

♦    po rozwinięciu (ok. 2-3 godz.) i wysuszeniu chromatogram spryskać roztworem siarczanu rtęci (r suszyć), a następnie po ok. 1 minucie 0,01% roztworem dwufenylokarbazydu w chloroform Uzyskane barwne plamy i ich Rf porównać z danymi otrzymanymi dla roztworu wzorcowego.

Kolejność plam (od linii startu) jest następująca: luminal, weronal, ewipan.

W celu potwierdzenia wyników uzyskanych metodą chromatografii cienkowarstwowej wykon; badanie widm barbituranów w ultrafiolecie.

2

1

Identyfikacja barbituranów - metoda spektrofotometrii w zakresie nadfioletu

(widmo w UV)

♦    suchą pozostałość na szkiełku zegarkowym rozpuścić w 7 cm² wody i przez 3 minuty ogrzewa w temp. 60°C w celu lepszego rozpuszczenia identyfikowanych leków,

♦    po ostudzeniu roztworu do temp. pokojowej, odpipetować do dwóch probówek po 1,5 crr badanego roztworu,

♦    do pierwszej probówki dodać 0,1 cm² 15% NH₄CI i 0,2 cm² 1N NaOH (w ten sposób (czyli \ środowisku słabo alkalicznym) w probówce uzyskano związek w postaci monoanionu] Odnośnikiem jest: 1,5 cm² wody + 0,1 cm² 15% NH₄CI + 0,2 cm² 1N NaOH.

♦ do drugiej probówki dodać 0,3 cm² 3N NaOH (w ten sposób (czyli w środowisku silnie alkalicznym) związek przeprowadzono w postać dianionu). Odnośnikiem dla dianionu jest 1,5 cm² wody + 0,3 cm² 3N NaOH,

2

♦    zarejestrować na spektrofotometrze (Cary 1) w UV widma: monoanionu, dianionu oraz widmc różnicowe badanego roztworu (widmo dianionu rejestrować względem monoanionu w zakresie 220-300 nm). Występowanie w widmie różnicowym (czyli widmie uzyskanym przez pomiar dianionu wobec monoanionu. który będzie odnośnikiem) maksimum przy 260 nm i minimum przy 240 nm świadczy o obecności barbituranów.