PCR

4. Łańcuchowa reakcja polimerazy (Polymerase Chain Reaction - PCR)

4.1. Podstawowe wiadomości o reakcji PCR

Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) jest technika pozwalającą na powielanie in vitro specyficznej sekwencji DNA. Aby ^amplifikować taki fragment DNA. należy spełnić kilka warunków. Musi być znana, choćby częściowo, sekwencja początkowa i końcowa badanego fragmentu, konieczne jest posiadanie przynajmniej jednej pary starterów, termostabilnej polimerazy DNA. odczynników do reakcji oraz urządzenia zwanego termocyklerem. Najważniejsze cechy dobrego terniocykiera to: duża dokładność i powtarzalność w utrzymaniu temperatury, idealna zgodność i dokładność zmian temperatury w każdym miejscu przeznaczonym na probówkę, szybkie zmiany temperatury o l-2^MC-s

Najczęściej w objętości 20-30 pi reakcji PCR stosuje się następujące komponenty reakcji: 10-100 ng matrycy DNA, 5-15 pmoli starterów, 5 10 niM dNTP, 1,5 2.5 tnM MgCI,, 0,5-2,5 u polimerazy (u - jednostka).

Przygotowaną mieszaninę reakcyjną poddaje się około 25-30-cyklicznym zmianom temperatury' (rys. 2). Pierwszym etapem jest denaturacja wstępna dupleksu DNA, która odbywa się w temperaturze 94-95°C przez 2 10 minut. Potem denaturacja właściwa w temperaturze 90 95°C przez 30-60 sekund,

TT

I I I I I I I I l I

5'    3'

□

J-,1.11 I 1 I I I I

lilii

LLL, 1.1-1 I I I I

A A

A A AA

A A

A A AA

Rysunek 2. Przebieg reakcji PCR

- 26 -