biotechnologia3

PCR - Reakcja łańcuchowa połłmerazy (ang. Polymcrase Chain Rcacdon) - łańcuchowa rcakcia pohmcrazy. metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegają na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Technika wynaleziona w 1983 roku przez Karv'eyo Mulliia i współpracowników z kalifornijskiej fumy Cetus. Za pracę w tej ifcwłrfiw Kaiy Mullis otrzymał w roku 1993 Nagrodę Nobla.

Do reakcji wprowadza się matrycowy DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydów, startery (primery), czyli krótkie (najczęściej ok. 20 nukleotydów) fragmenty DNA komplementarne do matrycy, oraz termostabilną poluiicrazę DNA (może nią być na przykład poHmeraza Tag wyizolowana z bakterii Therrma aauaticus lub polimeraza Pfu z bakterii Pyrococcta furiosis. Polimeraza Pfu charakteryzuje się większą progresywnością niż Taq, jednakże działa wolniej. Dostępne są także inne polimerazy, będące z reguły modyfikacjami wyżej wymienionych). W wyższej temperaturze (zwykle około 95 *C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (pomiędzy 45-70°C), przyłączają się one do matrycy. Podwyższenie temperatury do około 72°C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimeraza DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy.

Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2* cząsteczek. W praktyce wydajność jest mniejsza, co nie zmienia faktu, że metoda PCR znajduje wiele zastosowań, m.in. w klonowaniu genów, diagnostyce klinicznej, identyfikacji osób zaginionych, kryminalistyce, pracach nad gatunkami, które wyginęły.

Stosuje się również modyfikacje metody PCR m.in:

-    RT-PCR (Reverse Transcription) modyfikacja polegająca na użyciu mRNA jako matrycy

-    Real time PCR. PCR-RFLP .RG-PCR, ACRS-PCR, ARMS-PCR, ASA-PCR, PCR-ASO.

PCR-HD, PCR-SSCP, PCR-DGGE, PCR-TGGE, inversed PCR, PCR-OLA, PCR-CCM,

PCR-PTT, RAPD-PCR oraz REP-PCR

PCR - ŁAŃCUCHOWA REAKCJA POLIMERAZY - umożliwia ampHfikagę, czyli namnażanie Aby ją przeprowadzić potrzebne są:

-    substrat / matryca DNA, czyli fragment, pojedyncza cząstka nie oddzielona od genomu/

-    startery / oiigonukleotydy, czyli krótkie, jednoniciowe fragmenty DNA umoZliwójące rozpoczęcie

procesu replikacji/

-    nukleozydotrifosforany - pozostałe substraty tej reakcji /hp.rATP, CTP, CTP, TTP/

-    polimeraza DNA - enzym katalizujący reakcję

ETAPY:

Ł denaturacia - rozdział nici DNA (I min/ 95 O

IL renaturacia /hybrydyzacja/ komplementarnych starterów z rozplecionymi mani DNA (45s/54Q III. replikacja - wydłużanie ze startem /polimeraza DNA przyłączając ATP, GTP.CTP łub TTP buduje nici DNA (T72C)

Podniesienie temperatury powoduje wznowienie /ponowienie/ reakcji PCR. każdorazowo zostaje podwojona (liczba kopii DNA z udziałem Taq)