1250463196

Biochemia: Ćw. II - Metoda RT-PCR

3. Amplifikacja cDNA metodą PCR

Technika PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy lub reakcja łańcuchowa polimeryzacji) zapewnia uzyskanie w przeciągu krótkiego czasu milionów - miliardów kopii badanego fragmentu DNA. Miejsce syntezy w cząsteczce cDNA wskazują startery - krótkie sekwencje nukleotydowe komplementarne do początku i końca powielanego odcinka cDNA. Proces syntezy katalizowany jest przez termostabilny enzym - polimerazę DNA (najczęściej stosowana jest polimeraza Taq wyizolowana z teimofilnych bakterii Thermus aąuaticus).

Wykonanie: Do probówki o poj. 0.2 ml dodać 2 pi (300 ng) cDNA. Pizygotować mieszaninę odczynników do reakcji PCR - jedną wspólną dla wszystkich próbek dla danego genu. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodzi: bufor (10-krotnie stężony), Q-solution, roztwór czterech deoksyrybonukleozydotrifosforanów (dNTP), MgCh (jony magnezu są kofaktorami polimerazy Tag), para starterów (R - ang. reverse i F -ang. forward), woda wolna od RNaz oraz polimeraza Tag. Zamieszczona poniżej tabela 4 zawiera skład mieszaniny na jedną próbkę.

Tab.4, Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji PCR

	składniki mieszaniny	objętość M
1.	bufor 10x stężony	2.5
2.	Q-solution	5
3.	10 mM dNTP	1.6
4.	MgCh	1
5.	20 pM starterów R	1
6.	20 pM starterów F	1
7	woda wolna od RNaz	7.65
8.	polimeraza Taq	0.25
	objętość całkowita	20

Równocześnie z próbką badaną przygotować kontrolę negatywną (mieszanina reakcyjna z wodą wolną od RNaz w miejsce cDNA). Polimerazę Tag dodać na końcu, tuż przed przeniesieniem mieszaniny do probówki zawierającej matrycę. Po krótkim żwirowaniu probówki umieścić w termocyklerze PCR i prowadzić reakcję zgodnie ze schematem podanym w tabeli 5.

Tab.5. Etapy reakcji PCR.

	nazwa cyklu	temperatura	czas (min]
1.	wstępna denaturacja	94°C	3
2.	denaturacja	94°C	1
3.	hybrydyzacja	temp. zależy od starterów	1
4.	wydłużanie	72°C	2
30 - 35 cykli (pkly: 2-4)
5.	końcowe wycBużanie	72°C	10
6.	koniec reakcji	4°C

4