1250463193

Biochemia: Ćw. 11 - Metoda RT-PCR

Ćwiczenie 11 Metoda RT-PCR

Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpieczny! bromek elydyny -T»

Uwagi wstępne

Praca z kwasami nukleinowymi (np. izolacja, reakcja PCR) wymaga zachowania szczególnej czystości, ponieważ kwasy nukleinowe łatwo ulegają degradacji. Dotyczy to głównie fiNA, ze względu na powszechną obecność rybonukleaz (RNaz) - enzymów katalizujących niespecyficzne rozrywanie łańcuchów rybonukleinowych. Poniżej zamieszczono kilka uwag istotnych podczas eksperymentów, w których używamy kwasów nukleinowych.

Wszystkie czynności wykonujemy w czystych rękawiczkach, które przemywamy 70% etanolem.

cji PCR przeprowadzamy w komorze laminarnej wysterySzowanym lampą UV. Miejsce do izolacji i aparat dc

1o reakcji PCR, pokmerazy pobieramy używając końcówek z filtrem.

PBS sterylizujemy przez filtrowanie (filtr o średnicy porów 0.2 pm); bufory z gotowych zestawów do izolacji i reakcji PCR są sterylne.

Metoda łańcuchowej reakcji polimerazy poprzedzona odwrotną transkrypcją RT-PCR (ang. reuerse transcription polymerase Chain reaction) służy m.in. do analizy ekspresji badanego genu. Bezpośrednim i najbardziej miarodajnym sposobem sprawdzenia, czy gen ulega ekspresji w danej komórce jest wykrycie obecności transkryptu danego genu - cząsteczek mRNA. Technika RT-PCR składa się z dwóch etapów:

-    reakcji odwrotnej transkrypcji, w której mRNA przepisywane jest na cDNA,

-    amplifikacji (wielokrotnego powielenia) cząsteczek cDNA metodą klasycznej reakcji PCR.

Ostatnim etapem badania ekspresji genu jest elektroforeza produktów (amplifikatów) reakcji PCR wykonywana najczęściej w żelu agarozowym.

1. Przygotowanie RN A

1.1 Izolacja RN A (zestaw firmy Qiagen)

Materiał do izolacji kwasów nukleinowych stanowią skrawki tkankowe, całe narządy pobierane od zwierząt, komórki ustalonych linii komórkowych lub linii piemotnych hodowane in iritro w naczyniach hodowlanych (szalkach Petriego, płytkach wielodolkowych lub butelkach). Zamieszczona poniżej procedura w punktach 1 - 4 odnosi się do komórek adherentnych hodowanych in vitro.

1.    Po osiągnięciu 70 - 90% zarośnięcia naczynia hodowlanego (szalki Petriego o średnicy 6 cm) komórki przemyć zimną pożywką nie zawierającą surowicy a następnie zimnym sterylnym PBS*.

2.    Po dokładnym odciągnięciu roztworu PBS komórki zebrać sterylnym skrobakiem do probówki typu Eppendorf o poj. 1.5 ml w 350 pl buforu lizującego RLT zawierającego [1-merkaptoetanol. Tak zebrane komórki można przechowywać w temp. -70°C przez okres 1 miesiąca.

3.    Do ekstraktów komórkowych dodać 350 pl 70% etanolu, zamieszać pipetą.

4.    700pl mieszaniny nałożyć na minikolumnę do izolacji RNA. Po żwirowaniu (8000 RPM”, 15 s, RT"*) kolumnę przełożyć do nowej probówki wirowniczej o poj. 2 ml.

5.    Dodać 700 pl buforu RW1, żwirować (8000 RPM, 15 s, RT).

6. Kolumnę umieścić w nowej probówce wirowniczej o poj. 2 ml i dodać 500 pl buforu RPE, żwirować (8000 RPM, 15 s, RT).

7. Kolumnę umieścić w nowej probówce wirowniczej o poj. 2 ml i dodać 500 pl buforu RPE, żwirować (8000 RPM, 2 min, RT).

8.    Kolumnę umieścić w nowej probówce wirowniczej o poj. 2 ml i żwirować w celu wysuszenia membrany (15000 RPM, 1 min, RT).

9.    Kolumnę przenieść do probówki wirowniczej o poj. 1.5 ml i dodać na membranę 100 pl wody wolnej od RNaz, żwirować (8000 RPM, 1 min, RT). Czynność powtóizyć nakładając na kolumnę eluat otrzymany z pierwszego wirowania.

'PBS (ang. Phosphate Butfered Salinę) - zbuforowany roztwór soli fizjologicznej "RPM (ang. Revolutions Per Minutę) - liczba obrotów na minutę '"RT (ang. Room Temperaturę) - temperatura pokojowa