101654

Polimerazowa reakcja łańcuchowa PCR- technika biologii molekularnej pozwalająca na uzyskiwanie dużej liczby kopii (amplifikację) cząsteczki DNA o określonej sekwencji. Istotą mechanizmu PCR są dwa zjawiska:

•    odwracalna denaturacja DNA (rozerwanie niskoenergetycznych wiązań wodorowych między nićmi)

•    sposób inicjacji jednokierunkowej syntezy DNA przez polimerazę DNA zależną od DNA.

Cechy PCR:

•    wykładnicza amplifikacja

•    generacja fragmentów o identycznej sekwencji i określonej długości

•    możliwość przeprowadzenia w przypadku posiadania wiedzy tylko o skrajnych fragmentach sekwencji

•    czułość w odniesieniu do matrycy wyjściowej.

Mieszanina reakcyjna do PCR:

1.    woda

2.    bufor- specyficzny dla każdej polimerazy. Stabilizuje pH mieszaniny reakcyjnej. Zwykle są w nim jednowartościowe jony w postaci KC1.

3.    substrat (dNTP- trifosforany deoksyrybonykleozydów: dATP, dTTP, dCTP, dGTP)

4.    primcry (jednoniciowe DNA komplementarne do obu nici matrycy).

Primery to syntetyzowane na zamówienie oligonukleotydy DNA o określonej sekwencji komplementarnej do matrycy na krańcach sekwencji przeznaczonej do amplifikacji.

Primcr górny (lewy, przedni) ma sekwencję identyczną z sekwencją osi sensowej, a primer dolny (prawy, tylny) ma sekwencję anty komplementarną do nici sensowej (sekwencję 5’-3’ nici antysensowej).

•    powinny zawierać około 50% par GC, gdyż ilość tych nukleotydów wpływa na temp topnienia starterów, która nie może być większa niż optymalna temp działania polimerazy.

•    nie mogą one tworzyć struktury „szpilki do włosów” lub konkatamerów.

•    nie powinny zawierać w części 3’ końcowej odcinków do siebie komplementarnych ani komplementarnych do drugiego startera.

5.    matryca DNA jednonidowa lub dwuniciowa (DNA genomowy)

6.    termostabilna polimeraza (Paq5000) specyficzna dla organizmu. Cechy:

•    wierność (aktywność redakcyjna- egzonukleazowa 3’-5’)

•    wydajność (liczba nukleotydów przyłączanych na sekundę)

•    optymalna temperatura i stabilność

•    stochastyczna długość łańcucha (powinowactwo do DNA)

1.    Wstępna denaturacja DNA- rozerwanie wiąz wodorowych między 2 komplementarnymi łańc DNA matrycowego.

2.    Denaturacja (95°C, 30”-5')- rozplecenie podwójnej helisy matrycowego DNA, pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. Otrzymujemy DNA jednoniciowe, ponieważ polimeraza DNA wykorzystuje jednoniciowe DNA jako matrycę do syntezy nici komplementarnej.

3.    Annealing (59°C, 20”, -0,5°C na cykl)- (roztwór gwałtownie cliłodzony) hybrydyzacja odcinków starterowych- tworzenie odcinków dwunidowych, składających się z przygotowanych starterów- cząsteczek DNA komplementarnych do sekwencji DNA