skanuj0004

Naczynie o pojemności 100 ml z płaszczem wodnym ; cylinder miarowy na 100 ml ; kolba Erlenmayera o pojemności 1 litra z korkiem ; pipeta automatyczna, o-ring, siatka nylonowa, łopatka, korkobor o średnicy 6 mm

3.3. Wykonanie ćwiczenia

3.3.1.    Otrzymywanie membrany z unieruchomionym enzymem

Membrana z unieruchomionym enzymem jest przygotowana wcześniej według następującej procedury. 25 g owocnika pieczarki homogenizowano z 50 ml 0,05 M buforu fosforanowego, pH 7 przez 10 min przy 14 000 obr/min. Otrzymany homogenizat odwirowywano 15 min przy 20 000 obr/min. W otrzymanym wyciągu rozpuszczano albuminę wołową w ilości 4 g na 50 ml. Do 2 ml otrzymanego roztworu dodawano 0,2 ml 25 % wodnego roztworu aldehydu glutarowego i po wymieszaniu wylewano na szalkę Petriego o średnicy 7 cm. Mieszaninę zostawiano na 1 godzinę do stężenia, a otrzymaną błonę zalewano buforem, pH 7 i pozostawiano w lodówce (4°C) do następnego dnia.

3.3.2.    Sposób wykonania pomiarów krzywej kalibracyjnej

Przygotować 100 ml buforu fosforanowego o pH = 7 nasyconego tlenem z powietrza. Włączyć ultra termostat, mieszadło magnetyczne i tlenomierz. Przelać bufor do naczynia pomiarowego. Z otrzymanej błony albuminowej wyciąć krążek o średnicy 6 mm, nałożyć na elektrodę tlenową i umocować kawałkiem siatki nylonowe i o-ringiem. Włożyć otrzymaną elektrodę enzymatyczną i czujnik temperatury do buforu. Pomiary wykonywane są w temperaturze 25°C, przy stałej szybkości mieszania 500 obr/min.

Poczekać na ustalenie się wskazań tlenomierza i zapisać jego wskazania. Dodać 0,1 ml 0,1 M roztworu katecholu i czekać, aż ustali się wskazanie tlenomierza. Trwa to zwykle około 5 minut. Wynik zanotować. Powtarzać dodawanie porcji substratu i odczyty, aż do momentu kiedy po dodaniu kolejnej porcji wskazania tlenomierza będą bliskie zeru lub zaczną wzrastać.

Zdemontować układ pomiarowy i elektrodę. Umyć wszystko wodą destylowaną. Przygotować nową porcję buforu. Przygotować elektrodę enzymatyczną i cały układ pomiarowy do pomiaru tak, jak to opisano uprzednio. Po ustaleniu się wskazań tlenomierza (wynik zanotować) dodać 0,5 ml roztworu katecholu o nieznanym stężeniu. Po ustaleniu się wskazań tlenomierza wynik ponownie zanotować.

Zdemontować układ, elektrodę tlenową pozostawić zanurzoną w wodzie

Tabela wyników

roztwór	dodana objętość [ml]	stężenie katecholu [mol/dm^3]	wskazania tlenomierza	sygnał S znormalizowany [%]	AS [%]
0,1 M katechol	0 0,1 0,2 0,3	0		100	0
nieznany roztwór katecholu	0 0,5	—

4