Obraz (12)

SD

Cześć II

Ogólny schemat procesu trawienia u pierwotniaków jest analogiczny jak u organizmów wyższych. Zamknięty w wodniczkach pokarm jest przenoszony kolejno ze środowiska kwaśnego do zasadowego. W tym czasie szereg lizosomów wbudowuje się w ścianę wodniczki, uwalniając izolowane dotąd enzymy.

Tak więc w celu przebadania pierwotniaczych enzymów trawiennych pożądanym byłoby wyizolowanie całej frakcji lizosomów komórkowych. Operację tę umożliwia technika frakcjonowanego wirowania. Dogodnym materiałem do przeprowadzenia tego typu doświadczeń jest akseniczna hodowla ameb (np. Acanthamoeba castellanii).

I. Dezintegracja ameb

1. Kroplę hodowli ameb nanosimy na komorę Btirkera.

			t
		-	- 1
	>—J 0.3	-4	H- O.OS t

Komora Btirkera składa się z 9 dużych kwadratów o powierzchni 1 mm². Każdy z nich podzielony jest podwójnymi liniami (oddalonymi od siebie o 0,05 mm) na 16 małych kwadratów o długości boku 0,2 mm. Podwójne linie tworzą mini kwadraciki o powierzchni 0,0025 mm². Głębokość komory wynosi 0,1 mm.

2. Liczymy ilość ameb w 100 małych polach i wyciągamy średnią arytmetyczną. Ponieważ objętość cieczy nad jednym małym polem wynosi 1/250 mm^{1 2 3 4} wynik mnożymy przez 250 (dla 1 mm¹) i przez 1000 (il.ameb/ml).

ii, ameb w 1 ml = n x 250 x tOOO x rozc, n- il.ameb na jedno małe pole

N

1

   Hodowlę odwirowujemy przy 1,5 tys.obrotów przez 10 min.(zagęszczanie materiału).

2

   Mierzymy ilość supernatantu (5ml odlewamy do probówki do dalszych badań). Ameby (otrzymany osad) zawieszamy w 0,25 M roztworze sacharozy w 20 mM buforze

fosforanowym o pH 7,0 tak, aby otrzymać 5x10^ ameb/ml.

3

   Zagęszczoną hodowlę wlewamy do uprzednio schłodzonego dezintegratora Potera i homogenizujemy ameby ruszając tłoczkiem 150-200 razy (dezintegrator cały czas trzymamy w lodzie). Należy sprawdzić pod mikroskopem czy ameby uległy rozbiciu.

4

   3 ml dezintegratu odlewamy do probówki i wstawiamy do zamrażarki.