img047 (51)

Doskonalenie mikroorganizmów metodą rekombinacji genetycznej

Rekombinacja genetyczna polega na łączeniu się cech rodzicielskich w nowe kombinacje u potomstwa mieszańców. Wyróżnia się dwa typy rekombinacji genetycznej:

-    powstawanie nowych kombinacji w wyniku krzyżowania się cech znajdujących się w różnych (niehomologicznych) chromosomach komórek rodzicielskich;

-    tworzenie nowych kombinacji cech sprzężonych (znajdujących się w chromosomach homologicznych) z których każdy pochodzi od innego rodzica.

Rekombinacja genetyczna to bardziej racjonalny, w porównaniu z mutagenezą sposób otrzymywania szczepów przemysłowych.

Hybrydyzacja metodą fuzji protoplastów

Hvbrvdvzac ja - przekazanie informacji genetycznej z komórek dawcy dc komórek biorcy w wyniku fizycznego kontaktu obu komórek polega na wymianie homologicznych fragmentów DNA między chromosomami dawcy biorcy, w wyniku rozdzielenia materiału genetycznego w komórkach potomnych otrzymuje się hybrydy o zmienionym genotypie

Hybrydyzacja pozwala łączyć cechy szczepów pochodzących z różnych linii mutacyjno-selekcyjnych, eliminować cechy niepożądane, umożliwia poprawę wielu ważnych cech szczepów przemysłowych.

Naturalna hybrydyzacja zachodzi bardzo rzadko. Podstawowa przeszkoda: to ściana komórkowa i ujemny potencjał po zewnętrznej stronie błony cytoplazmatycznej

Pierwszym etapem w procesie fuzji jest otrzymanie protoplastów. Barier w plazmogamii jest sztywna ściana komórkowa. Konieczne jest jej pokonanie by dokonać fuzji protoplastów, a co za tym idzie praktycznie wykorzystać rekombinacji w doskonaleniu szczepów.

Ulepszanie szczepów na drodze rekombinacji genetycznej, fuzja protoplastów

Ścianę komórkową usuwa się na drodze enzymatycznej. Protoplasty bakterii gram „+“ i promieniowców otrzymuje się przy zastosowaniu lizozymu, w przypadku bakterii gram dodatkowo w obecności EDTA i odpowiednich warunków jonowych, dla grzybów (w tym drożdży) stosuje się sok żołądkowy ślimaka Helix pomatia.

Następnie protoplasty dwóch szczepów miesza się w środowisku alkalicznym (pH 9) w obecności jonu wapniowego i 307° PEG indukującego fuzję. Uzyskane w wyniku fuzji protoplasty inkubuje się w podłożu stabilizowanym osmotycznie w celu regeneracji ściany komórkowej i otrzymania ponownie pełnowartościowych komórek. Regeneracja ściany komórkowej poprzez inkubację hybrydowych protoplastów w odpowiednio dobranych pożywkach.

Ulepszanie szczepów na drodze rekombinacji genetycznej, fuzja protoplastów

Zalety hybrydyzacji na drodze fuzji protoplastów

-    zwiększenie wydajności produkcji

-    zmiana wymagań pokarmowych

-    ograniczenie wytwarzania produktów ubocznych

-    zwiększenie szybkości wzrostu

-    zmiana przyswajalności różnych substratów

-    zwiększenie oporności na substancje toksyczne

-    zwiększenie oporności na bakteriofagi

Selekcja rekombinantów, hodowla na odpowiednio dobranych podłożach selekcyjnych. Najczęściej stosowane markery selekcyjne: markery auksotroficzne, morfologiczne, oporności na antybiotyki.

Elektrofuzja

Działanie na komórki stałym prądem elektrycznym prowadzi, na skutek zmiany ładunku błony plazmatycznej, do powstania w niej porów o średnicy do kilkunastu nm.

Przygotowanie komórek niższych grzybów i roślin do elektrofuzji i elektro-transformacji wymaga enzymatycznego usunięcia ściany komórkowej w celu uzyskania protoplastów.

Elektroporacja - do komórki mogą przeniknąć substancje nieprzechodzące przez błonę natywną

Elektrofuzja

Elektrofuzja - impuls stosowany jest w stosunku do komórek ustawionych wzdłuż linii pola i znajdujących się w bliskim kontakcie, może dojść do wymieszania się błon w regionie kontaktu, utworzenia mostka cytoplazmatycznego między różnymi komórkami i wspólnej błony otaczającej cytoplazmy uprzednio oddzielonych komórek, czyli do fuzji komórek.

Proces elektroporacji umożliwia wprowadzenia kwasów nukleinowych do komórek mikroorganizmów prokariotycznych (elektrotransformacja) i komórek eukariotycznych (elektrotransfekcja).

Metoda fuzji umożliwia uzyskiwanie korzystnych kombinacji cech genetycznych nawet w sytuacji, gdy nieznane jest w szczegółach genetyczne i molekularne podłoże takich cech.