IMG079 (4)

Obwodowy układ immunologiczny

Ćwiczenie 2. OTRZYMYWANIE LEUKOCYTÓW KRWI OBWODOWEJ

A)

Materiały

1.    Krew bydlęca

2.    0,3% roztwór gaiaktozy w H20 re destylowanej

3.    0,1% roztwór żelatyny w 0,85% NaCI

4.    0,85% roztwór NaCI w H20 re destylowanej

5.    Płyn Eagl’a z dodatkiem 10% surowicy cielęcej

6.    Probówki 10 ml

7.    Szkiełka nakrywkowe i podstawowe

8.    Pipety pasterowskie

9.    Pipety automatyczne

10.    kruchy lód

Wykonanie

•    Schłodzoną krew przenieść do 10 ml probówek (około 8 ml) i wirować przez 30 minut przy 500xg

•    Pipetą pasterowską zebrać kożuszek tworzący się na granicy między erytrocytami a osoczem i przenieść do świeżej probówki 10 ml

•    Zmierzyć objętość uzyskanego koncentratu leukocytów i zmieszać z zimnym0,3% roztworem gaiaktozy w proporcji 1 część roztworu leukocytów i 1,5 części roztworu gaiaktozy

•    Delikatnie wymieszać i pozostawić na lodzie przez 3 minuty. Powinna wystąpić silna liza erytrocytów widoczna jako zwiększona przejrzystość zawiesiny

•    dodać 0,1% roztwór żelatyny w proporcji 1 część lizatu i 1,5 części żelatyny

•    wirować przy 500xg przez 10 minut i zlać supematant

•    uzyskany na dnie osad leukocytów przemyć zimnym płynem fizjologicznym i odwirować 1 min

•    odciągnąć supematant, z osadu sporządzić zawiesinę w płynie Eagfa z dodatkiem 10% surowicy cielęcej

Określić żywotność komórek w zawiesinie