img077 (32)

pipetą kroplę osadu na szkiełko podstawowe i - po ewentualnym podbarwieniu płynem Lugola - bada pod mikroskopem.

Można też zastosować wirowanie rozcieńczonego wodą kału, następnie przygotować preparat z osadu i zastosować barwienie w/g ZiehTa - Nielsena;

metoda ta jest szczególnie przydatna do wykrywania oocyst Cryptosporidium.

W metodzie z zastosowaniem formaliny, eteru oraz octanu przeprowadza się kilkakrotne wirowanie (każdorazowo przy 500g przez 2 min.), po czym także bada się pod mikroskopem próbki osadu.

Metody sedymentacyjne stosowane są m.innymi do wykrywania oocyst Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis, jaj przywr, jaj oraz proglotydów tasiemców oraz jaj, larw a także form dorosłych nicieni.

Utrwalanie kału do badań mikroskopowych

Najczęściej stosuje się utrwalanie przy pomocy alkoholu poliwinylowego -PVA.

Utrwalacz ten nadaje się do utrwalania rozmazów kału, ale stosuje się go także do utrwalania większych porcji kału, jeżeli nie jest możliwe szybkie przekazanie materiału do laboratorium.

Sposób utrwalania a) większych porcji oraz b) rozmazów kału:

a)    większą porcję kału (ok. 20cm³) miesza się z 4 do 5- krotnie większą objętością utrwalacza.

Tak utrwalony materiał można przekazać do laboratorium, gdzie przygotowane zostaną z niego rozmazy, które można poddać barwieniu, a następnie badać pod mikroskopem;

b)    niewielką grudkę lub kroplę kału miesza się na szkiełku podstawowym z 3 kroplami utrwalacza, rozprowadza na jego powierzchni, suszy przez ok. 12 godzin w temperaturze 37°C.

Utrwalone w ten sposób rozmazy kału mogą być przechowywane, ewentualnie barwione nawet po upływie dłuższego czasu.

Do utrwalania kału stosowane są także inne utrwalacze: MIF, SAF czy utrwalacz Schaudina.

Niektóre z tych utrwalaczy pozwalają na wykonanie trwałych preparatów barwionych, inne - na zastosowanie metod zagęszczających. Pewne utrwalacze nadają się lepiej niż inne do utrwalania danych pasożytów, np. trofozoity ameb bardzo dobrze ujawniają się w rozmazach barwionych trichromem po zastosowaniu utrwalacza Schaudina.

Zasadniczo wybór utrwalacza powinien być adekwatny do planowanego rodzaju badania koproskopowego.

Metody hodowli in vitro

Metody hodowli tkankowych czy na podłożach sztucznych

■losuje się w celu namnożenia pasożytów, co może być konieczne w sytuacjach diagnostycznie problemowych;

mogą stanowić konieczny etap postępowania, zmierzającego do uzyskania odpowiedniego materiału, niezbędnego do dalszych badań immunologicznych,

■    /y badań na obecność w kale kwasów nukleinowych pasożyta.

Problemy diagnostyczne powodują głównie takie pasożyty, których formy lo/wojowe są ubogie lub podobne morfologicznie. Niemożność rozróżnienia pokrewnych gatunków w badaniu bezpośrednim może mieć niebagatelne konsekwencje medyczne, zwłaszcza, jeśli gatunki te różnią się podatnością na Irki czy patogenicznością.

Konieczność wykonania specyficznej diagnostyki różnicowej dotyczy wśród nicieni Ancylostoma duodenale, Strongyloides stercoralis.

'.pośród pierwotniaków różnicować trzeba Entamoeba histolytica i E.dispar.

Założenie hodowli in vitro z materiału koproskopowego, zawierającego jaja łych helmintów, umożliwia prześledzenie dalszych etapów rozwoju nicieni i po/wala na wychwycenie morfologicznych różnic gatunkowych, występujących u Ibrm larwalnych. W ten sposób wykrywać można , a następnie oznaczać mikroskopowo - w kulturach założonych na płytkach agarowych, w kulturach /ułożonych w probówkach wg Harada-Mori lub jako technika alternatywna - w

■    /alkach Petri’ego - wychodzące z jaj ruchliwe stadia larwalne Strongyloides \Urcoralis, Ancylostoma duodenale.

Metody te nie będą efektywne, jeśli użyty do badań materiał koproskopowy ulegnie wcześniej przemarznięciu lub będzie przechowywany w lodówce; wrażliwe na zimno gatunki mogą wówczas całkowicie utracić zdolność rozwoju. Negatywne wyniki hodowli z takiego materiału będą niemiarodajne.

Inną metodą, umożliwiającą wykrywanie pasożytów w kale, gdy liczba ich jest niewielka, jak to bywa często w zarażeniu nicieniem Strongyloides stercoralis, jeiit technika z użyciem aparatu Baermanna. Wykorzystywane w niej jest /niwisko aktywnej wędrówki rozwijających się w kulturze larw. Ze świeżego miiieriału koproskopowego, umieszczonego w szklanym lejku, na gazie, /uwierającego jaja nicieni, rozwijające się larwy wędrują do znajdującej się poniżej warstwy wody. Wszystkie migrujące larwy skupiają się w wąskiej, zamkniętej kranikiem, dolnej części lejka, skąd mogą być pobierane do dalszych Imdań, np. mikroskopowych. Zaletą tej techniki jest możliwość użycia większej niż w innych metodach ilości materiału do badania.

Należy jednak pamiętać o inwazyjności w ten sposób wychwyconych larw i podczas wykonywania badania zastosować odpowiednie środki ostrożności.

IIzyskanie większej liczby trofozoitów Entamoeba histolytica sensu lato wymagać może także hodowli in vitro, w warunkach beztlenowych, na pożywkach płynnych dwufazowych (np. Robinsona) lub stałych (podłoże Myjaka). Hodowlę prowadzi się w temp. 37°C, przeszczepiając co 24-48 h..

Można w ten sposób uzyskać dostateczną ilość materiału do:

73