Obraz (13)

ii. Frakcjonowane wirowanie.

1.    Dezintegrat wirujemy w chłodzonej wirówce przy 1,5-2 tys. obrot./20 min. W osadzie zostają jądra. Osad przepłukać buforem .

2.    Płyn znad osadu jądrowego wirować przy 6 tys.obr./30 min. W osadzie zostają mitochondria, które przepłukujemy buforem.

3.    Supernatant znad mitochondriów wirujemy przy 15 tys.obr./30 min. W osadzie zostają lizosomy i mitochondria. Osad przepłukać buforem.

HOMOGENIZACJA

u

h;

SC

-homogenat w sacharozie. 0.25 M

£2

supernatant II

osad II:

mitochondria

supernatant Ha

osad II po

przepłukaniu:

mitochondria

supernatant III: rozpuszczalne substancje z homogenatu

osad III: mikrosomy

Osady zawiesić w wyjściowej ilości buforu fosforanowego, a następnie zamrozić do dalszych badań nad aktywnością enzymatyczną

Cześć III

I. Oznaczanie aktywności (3-N-acetvloglukozaminidazv.

Rozpuścić 4 mg mureiny Microcuccus lysodeicticns w 1 ml 50 mM buforu octanowego o pH 5,0. Zawiesinę mureiny rozdzielić na 2 probówki (do każdej dać po 0,5 ml). Do pierwszej probówki dodać 0,5 ml wody dest. (K), zaś do drugiej 0,5 ml dezintegratu ameb z frakcji lizosomalnej. Próbki kontrolną i badaną inkubować w temp. 37°C. Pomiar aktywności polega na oznaczaniu ilości cukrów redukujących uwalnianych z mureiny pod wpływem enzymu bakteriolitycznego po czasie inkubacji: 0’, 30’, 40’min.