94

Fosfatazy wykazują niską specyficzność substratową i w związku z tym zależnie od optimum pH dla ich działania klasyfikowane są na: fosfatazy kwaśne o optimum pH ok. 5 i

fosfatazy alkaliczne o optimum pH ok. 9.

Fosfataza kwaśna występuje w dużych stężeniach w nasionach roślin i gruczole krokowym człowieka. Aktywność jej bardzo silnie wzrasta w chorobie nowotworowej tego gruczołu, co wykorzystuje się w diagnostyce do wczesnego rozpoznawania tej postaci raka. W nasionach roślin aktywność fosfatazy kwaśnej silnie wzrasta podczas kiełkowania, a następnie maleje w miarę wzrostu siewek. Prawdopodobnie wzrost jej aktywności związany jest z uwalnianiem fosforanu nieorganicznego z organicznych form zapasowych fosforanu, np. z mezoinozytoloheksafosforanu (kwasu fitynowego).

lość fosfataz oznacza się zazwy czaj używając sztucznych substratów, takich jak:

2-giicerotostoran, fenylofosforan, fosforan fenoloftaleiny, 4-nitrofenylofosforan. Aktywność enzymu mierzy się ilością uwolnionego fosforanu lub części organicznej estru po inkubacji enzymu z substratem w ściśle określonych warunkach. Szczególnie dogodny jako substrat jest 4-nitrofenvlofosforan, gdyż jeden z produktów reakcji przechodzi w formę barwną już po zalkalizowaniu środowiska.

W ćwiczeniu będzie wykorzystany wodny wyciąg enzymu z kiełków pszenicy. Jako substrat będzie użyty 4-nitrofenylofosforan. Reakcję hydrolizy tego związku z udziałem fosfatazy i tworzenie barwnego produktu pokazano na rysunku 22. Powstający produkt reakq'i — 4-nitrofenol — przyjmuje w środowisku zasadowym barwę żółtozieloną i jest miarą aktywności fosfatazy.

produkt barwny    s-r'S- L . s    _V'JP-    ^ ^

L ^    w-^<r- » ¹

RYS. 22. Mechanizm reakcji hydrolizy 4-nitrofenylofosforanu z udziałem fosfatazy kwaśnej i powstawanie produktu barwnego

Przyjęta w wykonaniu temperatura inkubacji 38°C wprawdzie odbiega od temperatury standardowej, lecz nie powoduje jeszcze denaturacji enzymu, a przyspiesza szybkość reakcji i jest często stosowana w badaniach klinicznych.

Część a ćwiczenia może być wykonana w trzech układach:

1. Dwie osoby wyznaczają stałą K_m (3 godz.).

83