CCF20121026002

Ćwiczenie 6

Temat: Oczyszczanie białek metodą dializy. Zastosowanie chromatografii do analizy białek.

I. Oczyszczanie białek metodą dializy

W celu zbadania struktury, a także określenia właściwości fizykochemicznych i funkcji, białka muszą zostać uprzednio wyizolowane z materiału biologicznego i poddane procedurze oczyszczania. W odróżnieniu od związków niskocząsteczkowych, białka nie przechodzą przez błony półprzepuszczalne. W trakcie oczyszczania białka bądź przygotowywania materiału biologicznego do różnego typu oznaczeń, zachodzi często konieczność usunięcia z badanego roztworu niskocząsteczkowych związków organicznych lub nadmiaru soli (odsolenie). Do odsolenia stosuje się przeważnie dializę, która wykorzystuje zjawisko dyfuzji. Proces dyfuzji zachodzi zawsze w kierunku od wyższego do niższego stężenia substancji rozpuszczonej, co prowadzi do wyrównania stężeń w całej objętości roztworu bez nakładu energii. Małe cząsteczki można więc oddzielić od białka metodą dializy przez błonę półprzepuszczalną, taką jak błona celulozowa. Cząsteczki o wymiarach większych niż średnica porów pozostają w woreczku dializacyjnym, natomiast jony i mniejsze cząsteczki przechodzą przez pory błony i pojawiają się w zewnętrznym roztworze dializacyjnym. Dializa jest procesem dość długotrwałym, nie dającym całkowitego odsolenia. W celu przyspieszenia dializy i możliwie maksymalnego oczyszczenia białek z soli, lub innych niskocząsteczkowych związków zmienia się często roztwór, do którego próbka jest dializowana oraz stosuje się mieszanie.

- B. Dializa

Woreczek dializacyjny napełniony jest roztworem przeznaczonym do dializy

zawierającym substancje nisko- i wy soko cząsteczko we.

Po około 30 min dializy substancje

niskocząsteczkowe przechodzą przez błonę dializacyjną do płynu zewnętrznego (=zewnętrznego roztworu dializacyjnego)

Odczynniki:

-Roztwór A (=roztwór przeznaczony do dializy): mleko z dodatkiem NaCl (100mg/25ml mleka) i glukozy (100mg/25ml mleka)

-10% NaOH -1% CuS0₄-10% a-naftol -Stężony H2SO4 -Odczynnik Fehling I -Odczynnik Fehling II -10 mM AgN03 -Woreczek do dializy

Wykonanie oznaczenia:

1. Przygotować i opisać probówki:

1A, 2A, 3 A, 4A IB 1, 2B1, 3B1, 4B1 1B2, 2B2, 3B2, 4B2