CCF20121026000

Ćwiczenie 5

Temat: Ilościowe oznaczenie białka w surowicy krwi zwierząt metodą Lowry’ego i biuretową

1. Ilościowe oznaczenie białka metodą Lowry

W tej kolorymetrycznej metodzie końcowa barwa jest wynikiem dwóch kolejno zachodzących procesów: 1) reakcji biuretowej białka z jonami miedzi w środowisku zasadowym oraz 2) redukcji kwasu fosfomolibdenianowego i fosfowolframowego (odczynnik Folina i Ciocalteu) przez obecne w białku aminokwasy aromatyczne - tyrozynę i tryptofan. Pierwszy etap polega na przyłączeniu jonów miedzi do wiązań peptydowych, drugi na redukcji odczynnika Folina-Ciocalteu do błękitu fosfomolibdenowego nie tylko przez obydwa aminokwasy, ale i przez miedź związaną z białkiem. Dzięki obecności jonów Cu²⁺ czułość tej reakcji dla białek zwiększa się nawet pięciokrotnie. Pozytywną reakcję dają w tej metodzie białka, dłuższe i krótsze łańcuchy peptydowe oraz tyrozyna i tryptofan.

Metoda Lowry pozwala na oznaczenie białka już w stężeniu 1 Mg/ml. Jest powszechnie stosowana do oznaczania zawartości białka w płynach biologicznych i homogenatach tkankowych.

Odczynniki: Standard - albumina wołowa (BSA) o stężeniu 50 Mg/ml Lowry A - 2% roztwór Na2C03 w 0,1 M NaOH Lowry B - 0,5% roztwór CUSO4 Lowry C - 50ml Lowry A + lml Lowry B Odczynnik Folina-Ciocalteu

Surowica: rozcieńczenie 0,1 ml surowicy + 9,9ml Lowry C

	Próba odczynnikowa „O”	Standard	Próba badana
H20 (ml)	1	-	/T
Standard (ml)	-	1	' -
Surowica (ml)	-	-	0,1
Lowry C (ml)	5	5	4,9
Inkubacja	15 min, temperatura pokojowa
Odczynnik Folina (ml)	0,5	0,5	0,5
Inkubacja	30 min, temperatura pokojowa

Po inkubacji zmierzyć absorbancję próbek (ekstynkcję) wobec próby odczynnikowej (O) przy fali o długości ?i=660 nm w kuwecie o grubości warstwy d=lcm.

Obliczenie stężenia białka:

Absorbancja próbki badanej / absorbancja standardu x 0,05 x 100 = .. .g/100ml

Stężenie białka całkowitego w surowicy:

gatunek	Wartości Tg/lOOml
Koń	6,0-7,8
Bydło	5,1-7,1
Owca	6,5-7,0
Koza	5,9-7,8
Świnia	5,9-7,4
Pies	5,5-7,0
Kot	6,0-8,0
Królik	6,0-8,3
kura	4,5-5,5

22